臨床輸血學檢驗(技術)：3紅細胞血型檢測技術

第二章紅細胞血型檢測技術P36血型血清學檢驗的重要性血型血清學檢驗是輸血前檢查的必要內(nèi)容，是輸血安全的重要保證，同時也是新生兒溶血病、器官移植等重要的實驗室檢查。紅細胞抗原抗體反應基本理論紅細胞抗原與相應抗體無論是在體內(nèi)或是在體外，均可發(fā)生反應。體外試驗紅細胞抗原抗體反應的本質是凝集反應，其中抗體以前多從人血清中提?。ǖF(xiàn)在的抗A、抗B試劑一般為基因工程制備的單克隆抗體），又稱為血清學試驗。1．反應類型在試管中，紅細胞血型抗原抗體反應主要表現(xiàn)為凝集反應、溶血反應、沉淀反應等形式，其中溶血反應必須有補體參與，Ca２＋和Mg２＋參與補體激活。因此，在紅細胞抗原抗體反應中，溶血反應也是陽性結果。2．反應特點（1）特異性（2）可逆性（3）比例性（4）階段性3．影響凝集反應的因素（1）pH：接近生理性pH范圍。（2）離子強度：低離子強度溶液（LISS）減少了紅細胞周圍的陽離子云，從而促進了帶正電荷的抗體與帶負電荷的紅細胞發(fā)生反應。LISS增加抗體篩查和交叉配血試驗的敏感性，現(xiàn)已廣泛應用到臨床上。（3）溫度：一般IgM抗體適宜溫度為4～25℃，稱為冷抗體，IgG抗體在37℃時活性較好，稱為溫抗體。一般在室溫和37℃檢測抗體活性。（4）孵育時間：一般鹽水介質中，37℃孵育30分鐘可以檢出多數(shù)具有臨床意義的IgG抗體。第一節(jié)紅細胞血型系統(tǒng)檢測技術1.鹽水介質試驗技術2.抗球蛋白試驗技術3.微柱凝膠介質試驗技術4.聚凝胺介質試驗技術5.酶介質試驗技術6.吸收放散試驗7.凝集抑制試驗一、鹽水介質試驗技術P411．原理在鹽水介質中，紅細胞抗原和IgM抗體反應，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，屬于直接凝集反應。2．方法及應用根據(jù)載體不同，主要有試管法、平板法和微孔板法。①試管法為定性或半定量試驗方法，可用于ABO和Rh血型定型、不規(guī)則抗體篩查和鑒定、交叉配血及抗體效價測定等；②平板法和微孔板法為定性試驗方法，加樣與觀察結果同試管法，用于ABO血型和RhD抗原鑒定。二、ABO血型鑒定鹽水介質試驗ABO血型鑒定包括正定型和反定型。1.正定型（forwardtyping）：是指用已知特異性抗體鑒定紅細胞的抗原；2.反定型（reversetyping）：是指用已知血型紅細胞鑒定血清中的抗體。正、反定型結果應相互驗證，結果一致才能報告ABO血型結果。ABO血型正反定型結果判定表抗體+受檢者紅細胞（正定型）受檢者血型受檢者血清（血漿）+標準紅細胞（反定型）抗A抗BAcBcOc+-？-+--+？+----？++-++？---報告結果：紅細胞ABO血型鑒定：

型（鹽水介質試管法）。注意事項1.玻片法：可否用于反定型？2.試管法和微孔板法鑒定ABO血型時必須做正、反定型，兩者結果一致才能報告結果。3.反定型意義在于：①能夠復檢正定型血型結果的準確性，糾正漏檢、誤報；②發(fā)現(xiàn)正定型難以發(fā)現(xiàn)的弱抗原亞型，如A2B型，在正定型中因其A抗原較弱而常常被誤定為B型；③能夠糾正某些患者因疾病原因造成的紅細胞抗原減弱所致血型錯誤；④能夠排除獲得性抗原（如類B抗原）和冷凝集現(xiàn)象對紅細胞定型的干擾；⑤發(fā)現(xiàn)一些亞型中的不規(guī)則抗體。4.加樣順序：一般應先加抗體（血漿或血清），后加紅細胞懸液，以便核實是否漏加抗體（血漿或血清）5.離心離心能促進抗原和抗體的接觸和結合，提高反應敏感性和縮短反應時間，但離心時間和速度應嚴格遵從操作規(guī)程，防假陽性或假陰性結果。6.溫度：

IgM抗A和抗B與相應紅細胞反應的最適溫度為4℃，但為了防止冷凝集的干擾，一般在室溫（20～24℃）下進行試驗，37℃可使反應減弱。

7.結果觀察順序：溶血和凝集都是陽性結果，先看溶血，再看凝集。ABO血型鑒定正反定型結果不一致1．導致正反定型結果不一致的原因（1）技術失誤和人為原因1）器材不潔凈、試劑失效或污染、標準抗血清效價和親合力達不到要求：如抗A效價不高，可將A亞型誤定為O型，AB型誤定為B型等。2）標本張冠李戴，漏加或錯加試劑和標本、細胞與血清反應比例不適當（紅細胞懸液過濃或過淡，體積比例不當）、離心過度或不足、未注意觀察溶血現(xiàn)象、結果判斷、記錄或書寫錯誤等。（2）受檢者紅細胞的原因1）紅細胞抗原性減弱：新生兒或老年人；受檢者紅細胞上抗原位點過少（如A2、A2B等亞型）；白血病或惡性腫瘤等。2）多凝集紅細胞：紅細胞膜發(fā)生異常，紅細胞與其他所有人的血清，甚至包括自身血清都出現(xiàn)凝集。3）嵌合體血型：體內(nèi)有兩組紅細胞群體，定型時可以出現(xiàn)“混合外觀凝集”，可見于異卵雙胎?；旌贤庥^凝集（MF）：P384）紅細胞致敏：受IgG不完全抗體致敏的紅細胞，在含高蛋白介質的試劑中，可發(fā)生凝集。5）異形紅細胞：微柱凝膠血型卡法檢測時，鐮形紅細胞可致假陽性結果。（3）受檢者血清的原因

1）抗體減弱或缺乏：新生兒和出生６個月之內(nèi)的嬰兒血液中無ABO抗體或抗體很弱；老年人血清中ABO抗體水平下降，反定型時可出現(xiàn)不凝集或弱凝集；丙種球蛋白缺乏癥患者血清中缺乏應有的抗A、抗B。2）獲得性抗體：新生兒血清中可能存在來自母體的抗體；使用大量的非同型的血漿做置換治療，標本血清中含有供血者的抗A、抗B。3）異常血漿蛋白：肝病、多發(fā)性骨髓瘤患者血清中球蛋白增多，心肌梗死、感染及外傷等引起患者血清中纖維蛋白原增多，這些常引起紅細胞呈緡錢（串）狀排列，造成假凝集。4）血型特異性物質過高：一些卵巢囊腫病例，血液中血型物質濃度很高，可中和抗A、抗B，要多次洗滌待檢紅細胞。5）自身抗體：自身免疫性貧血患者血清中存在溫性自身抗體，能凝集自身和其他血型紅細胞。6）不規(guī)則抗體：受檢者血漿中含有ABO血型抗體以外的不規(guī)則抗體，與標準紅細胞上其他血型抗原系統(tǒng)的抗原起反應。7）藥物：藥物如低分子右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮及靜脈注射某些造影劑，血液粘滯性增高，可使紅細胞凝集而類似凝集表現(xiàn)。2．正反定型結果不符合分析程序及解決方法：首先應重復試驗1次，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，使用質量合格的試劑及仔細觀察凝集結果；如重復試驗仍然結果不符，則進一步進行以下試驗：（1）重新采集受檢者的新鮮血液標本，避免標本采集錯誤或原標本受污染所導致的錯誤結果。（2）查詢受血者既往病史、輸血史和用藥史等。（3）將受檢者紅細胞洗滌數(shù)次，應換用新開啟的確定為無細菌污染的生理鹽水洗滌紅細胞，用抗AB、抗A1或抗H檢測紅細胞。（4）對受檢者紅細胞直接作抗球蛋白試驗，如陽性，表示紅細胞已被致敏。（5）用A1、A2、B、O型紅細胞及自身紅細胞檢查受檢者血清。（6）如懷疑為A抗原或B抗原減弱，則可將受檢紅細胞與抗A或抗B血清作吸收及放散試驗，以及受檢者唾液作A、B及H物質測定。（7）分析O型篩選細胞檢測結果，確定是否是同種異型或自身冷抗體干擾正反定型結果。臨床應用1．用于輸血前的檢查：輸血前必須準確鑒定供血者與受血者的血型，選擇同型血源，經(jīng)交叉配血相符后才能輸血。2．用于器官移植前的檢查：ABO血型抗原廣泛地分布于人體內(nèi)除中樞神經(jīng)細胞外的各種組織細胞、體液、分泌液中，是一種移植抗原。在器官移植時，應力求受體和供體的ABO血型一致。3．用于新生兒溶血病的檢查：母子ABO血型不合可引起新生兒溶血病，主要通過血型血清學檢查來診斷。幾種血型鑒定方法學的比較（1）玻片法：不需要離心，操作簡單，可用于大規(guī)模普查，但費時，靈敏度差；不適于臨床常規(guī)使用及不適于反定型；容易污染環(huán)境和工作人員。（2）試管法：①常規(guī)血型鑒定方法，敏感，結果可靠，可發(fā)現(xiàn)亞型或較弱抗原抗體反應；②所需時間短，適用于急診血型鑒定；③應用廣泛：可用于定性試驗，也可用于半定量試驗，如抗體效價測定。臨床上主要用于血型鑒定、血清中IgM抗體的篩查和鑒定、交叉配血等。但與玻片法相比較，操作相對復雜。（3）微孔板法：可自動化、標準化，適于大量標本血型鑒定，中心血站應用較多。但需要特殊儀器設備。二、抗球蛋白介質試驗技術P43抗球蛋白試驗是1945年由R.R.A.Coombs等建立的，又稱為Coombs試驗?？骨虻鞍自囼炇墙?jīng)典的血清學實驗技術，主要用于檢查IgG等不完全抗體參與的抗原抗體反應，也可測定補體組分C3、C4片段參與的免疫反應。1.抗球蛋白試驗原理在合適的溫度及一定的反應時間等條件下，IgG血型抗體能與紅細胞膜上相應抗原結合而使紅細胞致敏，但多數(shù)IgG抗體不能在鹽水介質中使致敏的紅細胞出現(xiàn)肉眼可見的直接凝集。當加入抗球蛋白試劑后，該抗體（二抗）的Fab片段可與包被在紅細胞膜上的IgG血型抗體（一抗）的Fc片段結合發(fā)生抗原抗體反應，通過抗球蛋白抗體的“搭橋”作用，促使原來已致敏的紅細胞發(fā)生肉眼可見的凝集反應。因此采用此種方法能夠檢測出血清中是否存在不完全抗體。2.抗球蛋白試驗分類及應用根據(jù)試驗目的不同，分為:直接抗球蛋白試驗（directantiglobulintest，DAT）間接抗球蛋白試驗（indirectantiglobulintest，IAT）（1）直接抗球蛋白試驗（DAT）：抗球蛋白試劑直接與紅細胞反應，如出現(xiàn)肉眼可見的凝集，稱為直接抗球蛋白陽性。直接抗球蛋白試驗主要用于新生兒溶血病的診斷、溶血性輸血反應的調(diào)查、自身免疫性溶血性疾病和藥物免疫性溶血性疾病的診斷等。直接抗球蛋白試驗用于檢測體內(nèi)不完全抗體致敏的紅細胞。（2）間接抗球蛋白試驗（IAT）：紅細胞在體外與不完全抗體結合后，再加入抗球蛋白試劑進行檢測的試驗稱為間接抗球蛋白試驗。主要用于血清中不完全抗體篩查和鑒定、交叉配血試驗、檢測紅細胞上的血型抗原（如Rh、Duffy，Kell，Kidd等血型系統(tǒng)）、白細胞和血小板抗體試驗等。間接抗球蛋白試驗用于證實體外致敏的紅細胞。4.抗球蛋白試驗的技術特點（1）抗球蛋白試驗是最可靠的確定不完全抗體的方法，具有特異性強、靈敏度高的特點，已成為臨床上保障安全輸血、診斷和預防新生兒溶血病、自身免疫性溶血性疾病等研究工作中最主要的實驗技術。（2）經(jīng)典的試管法抗球蛋白試驗雖較靈敏，但其操作繁瑣，反應時間較長，不適用于急診檢查和大批量樣本的檢測，始終未能在臨床常規(guī)應用。洗滌非常重要！三洗三、微柱凝膠介質試驗技術P521．微柱凝膠試驗（microcolumngelassay）：1986年建立，紅細胞抗原抗體在微柱腔內(nèi)的凝膠介質中發(fā)生肉眼可見的凝集反應。2.原理：葡聚糖凝膠顆粒-凝膠微柱-微柱凝膠卡。是利用凝膠顆粒之間的間隙形成的分子篩作用，在微柱凝膠介質中紅細胞與相應抗體結合，經(jīng)低速離心，凝集成塊的紅細胞因體積大被凝膠阻滯不能通過凝膠層，留于凝膠介質的上層或中間，即陽性反應；未凝集游離紅細胞因體積小而通過凝膠之間的間隙沉積于微柱凝膠檢測管底部，形成細胞扣，即陰性反應。

微柱凝膠試劑卡分類應用中性凝膠試劑卡：用于ABO血型正反定型、RhD抗原測定、其他血型抗原鑒定及鹽水介質交叉配血等；特異性凝膠試劑卡：用于ABO血型正定型、RhD抗原測定和其他血型鑒定；抗球蛋白凝膠試劑卡：用于IgG抗D抗體鑒定RhD抗原，紅細胞不規(guī)則抗體篩查和交叉配血等?？ㄊ椒ǖ膬?yōu)點：1）結果敏感、準確：靈敏度、準確度比傳統(tǒng)的玻片法和試管法液體介質中的凝集試驗更高，重復性好，肉眼觀察清晰明確，易于判定且客觀，避免了因經(jīng)驗不足對結果判斷的影響。2）結果保存時間長：在室溫條件下，凝膠試劑卡一般可保存數(shù)天甚至數(shù)周，也可以拍照保留試驗結果圖像存檔備用。3）標本用量少：標本用量為試管法的1/10～1/5，尤其有利于新生兒及某些特殊血液標本的檢測。4）操作簡便：不需要洗滌，對陰性結果不需要確證試驗，適于大量標本檢測?？蓡畏輼吮径囗椫笜艘淮坞x心檢測，簡化了操作程序。5）自動化和標準化：配套儀器可以自動配制RBC懸液、自動加樣、自動判定實驗結果，易于自動化和標準化。6）檢驗項目齊全、應用范圍廣：可用于ABO血型正反定型、其他血型定型、交叉配血、抗體篩查、抗體鑒定等。7）安全：減少了接觸血液標本及病原微生物的機會，減少了醫(yī)源性感染。卡式法的缺點：本法試劑卡較貴，需要特殊離心機，其配套設備價格昂貴，不適合標本量較少的單位開展工作。Q：什么是微柱凝膠卡實驗結果的雙群現(xiàn)象？如何對雙群現(xiàn)象的結果進行判讀？微柱凝膠抗球蛋白試驗在含有抗球蛋白的凝膠介質中進行的抗球蛋白試驗稱之為微柱凝膠抗球蛋白試驗.即微柱凝膠Coombs試驗（MG-Coombs’Test）。MG-Coombs’T孵育后的紅細胞不需三洗，且孵育時間只需15分鐘，顯著提高了免疫凝集試驗的敏感性，使其能更廣泛地應用在臨床輸血檢驗中。四、低離子聚凝胺介質試驗技術P461980年建立聚凝胺（polybrene，Poly）是一種由4個胺聚合而成的高價陽離子聚合體，在液體中可產(chǎn)生多個陽離子基團，能夠中和紅細胞表面唾液酸所帶的負電荷，從而縮短紅細胞間的正常距離。1.原理A.利用低離子強度溶液（LISSorLIM）降低溶液的離子強度，減少紅細胞周圍的電子云，促使血型抗體與紅細胞膜上相應抗原結合。

B.加入聚凝胺(Polybrene)溶液，帶正電荷的聚凝胺大分子聚合物能夠中和紅細胞表面的負電荷，減弱紅細胞間的靜電斥力，縮短紅細胞間的正常距離.

在離心力作用下，可使正常紅細胞形成可逆性的非特異性聚集。C.加入枸櫞酸鈉重懸液，枸櫞酸根的負電荷能中和聚凝胺的正電荷.由抗體介導的特異性凝集則不會消失，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，為陽性反應。由聚凝胺引起的非特異性聚集會因電荷中和而消失，為陰性反應。2.低離子聚凝胺試驗技術特點

該方法能檢出完全抗體和多數(shù)不完全抗體，具有簡便、快捷、成本較低等優(yōu)點。盡管此法的靈敏度較鹽水介質試驗有了提高，但其根本還是一種非特異性促凝手段，仍不能使靈敏度達到最理想的臨床應用水平。該方法操作難以標準化、影響因素多、缺乏完善的質控體系，易造成假陰性結果，易漏檢低效價抗體。3.低離子聚凝胺試驗技術應用在抗體篩查、交叉配血和血型鑒定中具有一定應用價值，但對Kell血型系統(tǒng)的抗體檢測不理想。臨床應用

主要用于急診搶救患者的交叉配血試驗。如果用聚凝胺介質交叉配血出現(xiàn)不配合時，要用抗球蛋白試驗重復。結果不一致時，以抗球蛋白結果為準。五、酶介質試驗技術P42紅細胞膜表面唾液酸所帶負電荷，能夠使紅細胞相互排斥，保持懸浮狀態(tài)。因IgG抗體分子的跨度小于正常情況下紅細胞間的距離，IgG抗體與紅細胞抗原結合后，不足以把紅細胞拉在一起而引起肉眼可見的凝集。某些蛋白水解酶，可以破壞紅細胞表面的唾液酸結構，從而減少了負電荷的數(shù)量，縮短紅細胞間的距離，促進某些抗原抗體反應。酶技術對Rh、Kidd血型系統(tǒng)的檢出效果最好，但對MNS和Duffy血型系統(tǒng)抗原的破壞較為顯著。目前臨床常用木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶。酶試驗技術的應用：1.鑒定RhD抗原鑒定2.交叉配血試驗等Rh血型鑒定方法鹽水介質（玻片法、試管法）----IgM抗D試劑酶介質法----IgG抗D試劑抗人球蛋白介質法----IgG抗D試劑低離子強度聚凝胺法微柱凝膠法六、吸收放散試驗P48抗體與相應抗原在適合條件下可發(fā)生凝集或致敏，但這種結合是可逆的，如改變某些物理或化學條件，抗體可以從結合的紅細胞上解離下來。紅細胞與血清混合，在一定條件下，紅細胞表面某種抗原可特異性地與血清中相對應的抗體結合，使血清中該抗體的效價顯著降低或消失，稱為吸收試驗（absorptiontest）。根據(jù)待檢標本中所含抗體的最適反應溫度，對其進行吸收。冷抗體4℃反應最強，常用冷吸收試驗.溫抗體吸收采用酶處理后的紅細胞37℃孵育。放散試驗是把結合到紅細胞上的抗體解離下來，用于其他目的。ABO抗體首選熱放散方法（56℃）Rh抗體首選乙醚放散方法。吸收放散試驗的臨床應用1．去除血清中不需要的抗體：當存在冷抗體、自身抗體或抗血清試劑中混有其他特異性抗體時，可利用吸收試驗去除這些不必要或干擾試驗的抗體。2．證實存在于紅細胞上的弱抗原：如在ABO亞型鑒定中，紅細胞上的ABH抗原有時很弱，可能與相應試劑血清反應后不出現(xiàn)明顯凝集反應。經(jīng)過吸收放散后，測定放散液中的抗體，可以確定紅細胞上帶有的抗原。3．分離、鑒定混合抗體：當血清中存在多種血型抗體，并要求鑒定抗體特異性時，可以利用吸收放散試驗將抗體分離開來，并分別加以鑒定。4．濃縮低效價抗體：當血清抗體效價很低，可以利用吸收放散試驗濃縮抗體。如利用紅細胞膜做吸收放散試驗可以濃縮低效價的抗血清，使之成為可利用的試劑。5．鑒定抗體特異性：用已知抗原紅細胞吸收抗體，有助于鑒定、核實該抗體特異性。6．利用吸收放散技術鑒定引起新生兒溶血病和免疫性輸血反應的抗體。7．研究鑒別免疫性溶血性貧血的抗體。七、凝集抑制試驗P50血型抗原除了存在于人體紅細胞膜上外，某些血型抗原也以游離的形式存在于血漿、體液和分泌物中，稱為可溶性血型物質。這些血型物質可與相應的血型抗體結合而中和該抗體，從而使該抗體凝集對應紅細胞的能力受到抑制，此種試驗稱為凝集抑制試驗。唾液中ABH血型物質能特異地與相應抗體結合，從而抑制抗體再與相應紅細胞抗原發(fā)生凝集反應，由此可以判斷受檢唾液中是否有血型物質存在及其類型。臨床應用：1．輔助ABO血型亞型分類及特殊情況下進行血型鑒定。2．證明可溶性血型物質的存在。3．用于司法鑒定及考古鑒定。第二節(jié)輸血相容性檢測

輸血前三項試驗：紅細胞ABO血型和RhD血型鑒定（血型）交叉配血試驗（配血）不規(guī)則抗體檢測（抗篩）輸血前三項試驗是安全輸血的保障理論基礎：免疫血液學臨床安全有效輸血的免疫血液學底線是：病人與供者紅細胞：1.血型“相同”（same,identification）：病人與供者血型完全一樣。2.或者血型“相容”(compatibility,matching)：供者紅細胞能被病人容納，不被破壞。輸血前血型相容性試驗3.“相容”的本質是：病人沒有針對供者紅細胞的抗體。4.判斷“相容”的標準是：配血無凝集5.堅持“配不上血，決不輸血”的原則輸血前三項試驗，哪項最重要：配血第一：是“安全輸血生命線”血型第二抗篩第三只要配血不相容：即便是：1.病人與供者血型“相同”2.病人抗篩陰性一定會發(fā)生溶血性輸血反應或者無效輸血！必須配血無凝集才能輸血！一、交叉配血試驗P40將供血者的紅細胞、血漿分別與受血者的血漿、紅細胞混合，觀察有無溶血或凝集，稱為交叉配血試驗。主側和次側交叉配血主側交叉配血試驗：用受血者血漿與供血者紅細胞進行反應，檢查受血者血漿中是否存在針對供者紅細胞的抗體；次側交叉配血試驗：用受血者紅細胞與供血者血漿進行反應，檢查供血者血漿中是否存在針對受血者紅細胞的抗體。自身對照：患者紅細胞與自身血清，以排除自身抗體。目前，臨床上交叉配血試驗主要用于紅細胞和濃縮血小板輸注前的相容性檢查。我國《臨床輸血技術規(guī)范》未要求血漿和單采血小板輸注前需要做交叉配血試驗。

交叉配血試驗根據(jù)所使用的介質不同分為：鹽水介質法低離子聚凝胺介質法抗球蛋白介質法微柱凝膠抗球蛋白法酶介質法交叉配血反應體系均應有37℃孵育這個步驟。鹽水介質交叉配血試驗是臨床輸血前最基本的相容性試驗，簡便快速。但只能檢出不相配合的IgM完全抗體，不能對IgG不完全抗體進行檢測。鹽水介質交叉配血試驗應與檢測不完全抗體的配血方法（如抗球蛋白試驗）聯(lián)合檢測，以防止漏檢不完全性抗體，以確保輸血安全。二、不規(guī)則抗體篩查P39目的：在輸血前檢查患者血液中是否存在有臨床意義的意外抗體。所謂有臨床意義的不規(guī)則抗體一般指能夠引起溶血性輸血反應、新生兒溶血??；或者使輸入的紅細胞存活時間縮短且在37℃下有反應的同種異型抗體。除了ABO血型系統(tǒng)抗A和抗B外，其他血型系統(tǒng)抗體的產(chǎn)生沒有規(guī)律，不符合Landsteiner規(guī)則，稱之為不規(guī)則抗體或意外抗體?？笰1抗體，也屬于不規(guī)則抗體?？贵w篩查通常在配血前進行。凡遇有下列情況必須進行不規(guī)則抗體篩查試驗：①交叉配血不合時；②有輸血史、妊娠史；③短期內(nèi)需要