微生物學(xué)：11結(jié)核分枝桿菌屬

分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium

是一類細(xì)長(zhǎng)略彎的桿菌，除二分裂繁殖外,尚有分枝生長(zhǎng)的趨勢(shì)，故名分枝桿菌。態(tài)生兩靨之愁，嬌襲一身之病。淚光點(diǎn)點(diǎn)，嬌喘微微。閑靜時(shí)如姣花照水，行動(dòng)時(shí)如弱柳扶風(fēng)。癆病

本屬菌的共同特點(diǎn)：

無芽胞，無鞭毛，某些菌株有莢膜，有分枝生長(zhǎng)趨勢(shì);細(xì)胞壁脂質(zhì)含量高，主要為分枝菌酸；為G+b,但不易著色，抗酸染色陽性，故又名抗酸桿菌（acid-fast-bacillus）；專性需氧，營(yíng)養(yǎng)要求高，大多生長(zhǎng)緩慢；不產(chǎn)生內(nèi)外毒素及侵襲性酶類，其致病性與菌體成分以及機(jī)體對(duì)菌體成分所產(chǎn)生的免疫損傷有關(guān)；所致疾病呈慢性過程。分類

放線菌目→分枝桿菌科→分枝桿菌屬：種類繁多，已發(fā)現(xiàn)80多個(gè)種。國(guó)際分類研究組（IWGMT）分為三類（表14-1）1.結(jié)核分枝桿菌群（緩慢生長(zhǎng)菌）（1）人結(jié)核分枝桿菌：感染率高，占90%，對(duì)人致病，與牛結(jié)核分枝桿菌有交叉免疫。（2）牛結(jié)核分枝桿菌：感染率次之，對(duì)人致病。（3）非洲結(jié)核分枝桿菌：1968年從非洲肺結(jié)核病人的痰中分離出（4）田鼠分枝桿菌：對(duì)人一般不致病

2．非典型分枝桿菌（緩慢生長(zhǎng)或快速生長(zhǎng)菌）

除結(jié)核與麻風(fēng)分枝桿菌以外的結(jié)核分枝桿菌（1）Ⅰ群（緩慢生長(zhǎng)菌）：致機(jī)會(huì)肺部感染或游泳池肉芽腫（2）Ⅱ群（緩慢生長(zhǎng)菌）：致兒童淋巴腺炎或成人肺部感染（3）Ⅲ群（緩慢生長(zhǎng)菌）：致AIDS患者機(jī)會(huì)感染或肺部類結(jié)核感染（4）Ⅳ群（快速生長(zhǎng)菌）：致局部和肺部類結(jié)核感染，軟組織和手術(shù)后繼發(fā)感染3．麻風(fēng)分枝桿菌（不能培養(yǎng)菌）

目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，致人類麻風(fēng)病，為慢性傳染病，主要侵犯深部組織和器官。目前對(duì)小鼠足墊接種成功，對(duì)犰狳易感,可作為研究的動(dòng)物模型。微生物學(xué)診斷主要靠涂片，抗酸染色鏡檢，金胺O熒光染色鏡檢或病理活檢。

分枝桿菌屬其模式菌株為人結(jié)核分枝桿菌，標(biāo)準(zhǔn)菌株為ATCC27294。

結(jié)核分枝桿菌

M.tuberculosis

一．微生物特性形態(tài)染色細(xì)長(zhǎng)略彎的桿菌,有時(shí)可見分枝狀，可出現(xiàn)多形態(tài):球形、串珠狀或絲狀。革蘭染色陽性,但不易著色,抗酸染色陽性,經(jīng)齊-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色,菌體呈紅色,其他細(xì)菌和背景物質(zhì)呈藍(lán)色,用金胺O熒光染色→菌體呈金黃色熒光。本菌無鞭毛,無芽胞,有莢膜,但因制片破壞不易看到。培養(yǎng)特性

本菌為專性需氧菌,3%-5%的CO2可促進(jìn)其生長(zhǎng)。最適PH6.5-6.8,最適生長(zhǎng)溫度為370C。營(yíng)養(yǎng)要求高，必須在含血清、卵黃、馬鈴薯、甘油、無機(jī)鹽和孔雀綠等的羅-琴（Lowenstein-Jensen,L-J）固體培養(yǎng)基

才能生長(zhǎng)良好，因蛋清含脂質(zhì)生長(zhǎng)因子，能刺激結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)，孔雀綠能抑制雜菌生長(zhǎng)，故有利于本菌的分離培養(yǎng)與保存。該菌生長(zhǎng)緩慢（18h/代）一般2-5周方長(zhǎng)出菌落，菌落呈R型：表面粗糙、干燥、隆起、堅(jiān)硬、呈顆粒狀、結(jié)節(jié)狀或花菜狀，乳白色或淡黃色，不透明。在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較為迅速，一般1-2周即可生長(zhǎng)，呈菌膜生長(zhǎng)，有毒力的菌株呈索狀生長(zhǎng)。若液體培養(yǎng)基中加入0.2%吐溫-80（Tween-80）則可呈均勻生長(zhǎng)。結(jié)核桿菌培養(yǎng)3.菌體成分—脂質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)1)脂質(zhì)此菌含有大量脂質(zhì)，占CW干重的60%,包括磷脂、脂肪酸和蠟質(zhì)。其中蠟質(zhì)所占比例最大,由分枝菌酸、索狀因子、蠟質(zhì)D組成.2)蛋白質(zhì)本菌含有多種蛋白質(zhì),結(jié)核菌素(tuberculin)就是其中之一,與蠟質(zhì)結(jié)合能使機(jī)體致敏,產(chǎn)生超敏反應(yīng),引起組織壞死和全身中毒癥狀,并與結(jié)核結(jié)節(jié)的形成相關(guān)．蛋白質(zhì)也可刺激機(jī)體產(chǎn)生非保護(hù)性抗體.3）多糖TB含有各種多糖,其致病作用不清.

莢膜主要成分為多糖及部分脂質(zhì)和蛋白質(zhì)．它能與吞噬細(xì)胞表面的補(bǔ)體受體3(CR3)結(jié)合,有助于粘附與入侵;莢膜中的多種酶可降解宿主組織中的大分子物質(zhì),為本菌生長(zhǎng)繁殖提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);

莢膜能防止宿主的有害物質(zhì)進(jìn)入本菌;莢膜尚可抑制巨噬細(xì)胞中的吞噬體與溶酶體的融合,故與致病性密切相關(guān)．

生化反應(yīng)

本菌生化反應(yīng)不活潑,不發(fā)酵糖類．多數(shù)菌株觸酶試驗(yàn)陽性,但熱觸酶試驗(yàn)陰性,而非典型分枝桿菌熱觸酶試驗(yàn)大多陽性．結(jié)核分枝桿菌煙酸試驗(yàn)及硝酸鹽還原試驗(yàn)均呈陽性,而牛分枝桿菌均為陰性,有助于鑒別．

人結(jié)核分枝桿菌非典型分枝桿菌牛結(jié)核分枝桿菌觸酶試驗(yàn)+熱觸酶試驗(yàn)-+煙酸試驗(yàn)+-硝酸鹽還原試驗(yàn)+-變異性1）形態(tài)變異：

細(xì)長(zhǎng)桿菌L型（Much顆粒）:

顆粒狀或者絲狀形,抗酸性下降或消失

2）菌落變異:

R型菌落(有毒菌株)S型(無毒菌株)

不良環(huán)境藥物影響不良環(huán)境藥物影響3）毒力變異:

有毒牛型結(jié)核分枝桿菌

減毒活疫苗(毒力大大下降,抗原性不變),1908年由BacilleCalmette-Guerin發(fā)現(xiàn)→BCG(卡介苗)4）耐藥性變異:結(jié)核分枝桿菌耐藥性變異（MDRTB）耐藥菌株毒力明顯減弱,但近年來多重耐藥菌株逐漸增多,其TB病的死亡率高達(dá)７２％－８９％（USCDC），甚至引起爆發(fā)流行,給結(jié)核病的防治帶來巨大困難.

藥物選擇(繼發(fā)耐藥)基因突變(原發(fā)耐藥)13年230代L-J培養(yǎng)基抵抗力(三耐五敏)耐干燥:在干燥痰中可存活6-8個(gè)月,在含痰液的塵埃中可存活8-10天,故不能隨便吐痰。耐酸堿:在3%HCI、6%H2SO4、4%NaOH中30min其活力不受影響,故常用此法來處理被雜菌污染的標(biāo)本。耐某些染料及抗生素:對(duì)1:13000孔雀綠、1:7500結(jié)晶紫、青霉素等有一定抵抗力,故在培養(yǎng)基中可加入這些物質(zhì)抑制標(biāo)本中的雜菌生長(zhǎng),而不影響結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng),從而有利于初代分離培養(yǎng)。對(duì)75%的酒精敏感,常用于消毒病人口溫表;對(duì)濕熱敏感,濕熱62-630C15min或者煮沸即被殺滅,故常用巴氏法消毒牛奶或用煮沸法消毒結(jié)核病人的餐具;對(duì)紫外線(日光)敏感:常用于消毒結(jié)核病房空氣和病人衣物等;對(duì)某些化學(xué)消毒劑敏感,但需延長(zhǎng)消毒時(shí)間:如5%石炭酸24小時(shí),3%來蘇爾1-2小時(shí),方能殺滅痰內(nèi)的結(jié)核桿菌;對(duì)抗癆藥物敏感:異煙肼、鏈霉素、對(duì)氨基水楊酸(PAS)、利福平、乙胺丁醇、卡那霉素等,常用于結(jié)核病的治療.抵抗力總結(jié)：四不怕◆對(duì)干燥的抵抗力特別強(qiáng)◆結(jié)核分枝桿菌對(duì)酸（3%HCl或6%H2SO4)或堿（4%NaOH)有抵抗力，15min不受影響◆對(duì)堿性染料有抵抗力◆對(duì)青霉素等抗生素耐藥四怕◆對(duì)乙醇敏感——在70%乙醇中2min死亡◆對(duì)濕熱敏感——62～630C15min殺死（巴氏消毒）◆對(duì)紫外線敏感◆對(duì)鏈霉素、異煙肼、利福平、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、卡那霉素、對(duì)氨基水楊酸等抗癆藥物敏感，但長(zhǎng)期用藥容易出現(xiàn)耐藥性二.臨床意義致病物質(zhì)------CW上莢膜、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)與致病性密切相關(guān)．所致疾病------結(jié)核病,以肺結(jié)核最為多見.傳染源:開放性肺結(jié)核病人,病灶與外界相通,不斷向體外排出結(jié)核分枝桿菌,經(jīng)過塵埃或飛沫吸入肺泡,被巨噬細(xì)胞吞噬,在其中發(fā)育繁殖,導(dǎo)致病變產(chǎn)生.傳染途徑:主要通過呼吸道、消化道和受損的皮膚粘膜等途徑→易感機(jī)體.部分結(jié)核分枝桿菌→血液→肺內(nèi)、外播散→肺內(nèi)外感染：肺結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、腎結(jié)核、骨結(jié)核、關(guān)節(jié)結(jié)核、生殖道結(jié)核等多種臟器組織的結(jié)核病(粟粒性結(jié)核),但有不少學(xué)者認(rèn)為沿血液播散的結(jié)核分枝桿菌為該菌的L型.易感機(jī)體:未接種過卡介苗或機(jī)體免疫功能低下者.初次感染TB→原發(fā)性結(jié)核,多見于兒童,病灶多位于肺門部,且多為外源性感染,易形成原發(fā)綜合癥.再次感染TB→繼發(fā)性結(jié)核,多見于成年人,病灶多位于肺尖部,既可內(nèi)源性感染復(fù)發(fā),也可為外源性新侵入的結(jié)核引起.

結(jié)核病至今仍為重要的傳染病,據(jù)WHO估計(jì),目前全球約1/3的人口感染過結(jié)核分枝桿菌,每年約有800萬-1000萬新發(fā)病例,每年至少有300萬人死于結(jié)核病,相當(dāng)于每天有8000人死于結(jié)核病,其中98%的病死率在發(fā)展中國(guó)家.20世紀(jì)80年代以來,隨著AIDS發(fā)病率的增加,耐藥性TB的不斷增加,以及吸毒、免疫抑制劑的應(yīng)用等原因,結(jié)核病的發(fā)病率出現(xiàn)了世界范圍的回升。如果不加強(qiáng)結(jié)核病的防治,從2000-2020年,全球有10億新結(jié)核感染者,其中約有2億人發(fā)病,7000萬人死亡.結(jié)核病已成為傳染病中的頭號(hào)殺手和最大死亡原因之一,被稱為“白色瘟疫”,全球目前已處于結(jié)核病的緊急狀態(tài).

新中國(guó)成立后隨著人民生活水平的提高,衛(wèi)生狀況的改善,特別是開展了群防群治,兒童普遍接種卡介苗,結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率也大為降低,但近20年以來結(jié)核病的發(fā)病率又普遍增高,應(yīng)引起我們高度的重視。免疫性—以CMI為主（

cell-mediatedimmunity）

結(jié)核的感染率高（80%-90%），但發(fā)病率低（4%±），多為隱性感染。說明人體對(duì)TB有相當(dāng)強(qiáng)的免疫力。結(jié)核分枝桿菌是細(xì)胞內(nèi)感染菌，主要以TL為主的細(xì)胞免疫。致敏TL+TB→淋巴因子：IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α…..共同作用殺死病灶中的結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核的免疫屬于傳染性免疫（infectiveimmunity）,又稱有菌免疫，即只有在體內(nèi)存在結(jié)核分枝桿菌或菌體成分時(shí)，機(jī)體才對(duì)再次入侵的TB有免疫力，反之則無免疫力。機(jī)體對(duì)TB的傳染、免疫和遲發(fā)型超敏反應(yīng)同時(shí)存在，可測(cè)其一而知其二。常用結(jié)核菌素（tuberculin）皮膚試驗(yàn)來檢測(cè)機(jī)體對(duì)TB是否有免疫力。

郭霍現(xiàn)象（Kochphenomenon）:有毒TB初次感染GP，10－14天后注射局部潰爛、壞死，附近LN腫大，細(xì)菌擴(kuò)散漫延至全身，甚至死亡。有毒TB再次感染GP，1－2天內(nèi)注射局部迅速潰爛，但很快愈合，且不擴(kuò)散至附近LN和全身。說明機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌所產(chǎn)生的CMI和超敏反應(yīng)是同時(shí)存在的，是由不同的菌體成分激活不同的T細(xì)胞亞群釋放出不同的細(xì)胞因子所引起的?，F(xiàn)一般認(rèn)為超敏反應(yīng)是由結(jié)核菌素蛋白和臘質(zhì)D共同引起的，而CMI是由結(jié)核分枝桿菌核糖體RNA(rRAN)引起。三.微生物學(xué)檢驗(yàn)（一)檢驗(yàn)程序圖14-1(二)標(biāo)本采集

根據(jù)感染部位不同分別采取痰液(晨痰)、支氣管灌洗液、胸腹水、腦脊液(靜置后，試管表面可有細(xì)薄凝塊)、尿(晨尿或24小時(shí)尿取沉淀物10－15ml,診斷尿路結(jié)核需采集3－5份標(biāo)本)、糞便（國(guó)外一般不做）、分泌物與組織等。

(三)檢驗(yàn)方法

1.顯微鏡檢查

直接涂片染色鏡檢：是一種常用的簡(jiǎn)易快速檢查法。標(biāo)本直接涂片(一接種環(huán)或0.01ml)或濃縮集菌(漂浮法、沉淀法)后厚涂片(3-4接種環(huán)，約0.1ml，面積1.5cm2)，經(jīng)干燥固定后做齊-尼抗酸染色(熱染法)或金胺’O’熒光染色?？顾崛旧糜顽R觀察，結(jié)核分枝桿菌呈紅色。金胺’O’染色后用熒光顯微鏡HP鏡觀察，結(jié)核分枝桿菌呈金黃色熒光。每張涂片至少觀察300個(gè)視野。

ThisisanacidfaststainofMycobacteriumtuberculosis(MTB).Notetheredrods--hencetheterminologyforMTBinhistologicsectionsorsmears:acidfastbacilli.組織中結(jié)核分枝桿菌(抗酸染色)結(jié)核分枝桿菌金胺’O’染色后用熒光顯微鏡HP鏡觀察Mycobacteriacanalsobestainedwithauramineandviewedwithfluorescencemicroscopy,inwhichacidfastbacillinowappearasglowingyellowrods.Thismethodiseasiertousetoscreenformycobacteriaandisthemethodroutinelyusedinsputumspecimenssenttothelaboratory.報(bào)告方式：“找到抗酸性桿菌”或“未找到抗酸性桿菌”。具體報(bào)告方式可用1984年國(guó)內(nèi)統(tǒng)一暫定的厚涂片法填寫報(bào)告單：表14-3染色方法

鏡檢結(jié)果

報(bào)告方式

抗酸染色(×1000)

未發(fā)現(xiàn)抗酸菌(至少１00個(gè)oil視野)－1-2個(gè)抗酸菌/300個(gè)oil視野±3-9個(gè)抗酸菌/100個(gè)oil視野+1－9個(gè)抗酸菌/10個(gè)oil視野++1－9個(gè)抗酸菌/1個(gè)oil視野+++≥10個(gè)抗酸菌/1個(gè)oil視野++++熒光染色(×450)

未發(fā)現(xiàn)抗酸菌(至少１00個(gè)視野)－1-2個(gè)抗酸菌/70個(gè)視野±2-18個(gè)抗酸菌/50個(gè)視野+4－36個(gè)抗酸菌/10個(gè)視野++4－36個(gè)抗酸菌/1個(gè)視野+++

＞36個(gè)抗酸菌/1個(gè)視野++++染色方法

鏡檢結(jié)果

報(bào)告方式

另直接涂片法也可用全視野發(fā)現(xiàn)1-4個(gè)GⅠGaffky報(bào)告法(GⅠ-GⅩ)

數(shù)視野發(fā)現(xiàn)1個(gè)GⅡoil視野

平均每視野內(nèi)有1個(gè)GⅢ平均每視野內(nèi)有2-3個(gè)GⅣ平均每視野內(nèi)有4-6個(gè)GⅤ平均每視野內(nèi)有7-12個(gè)GⅥ平均每視野內(nèi)有13-25個(gè)GⅦ平均每視野內(nèi)有26-50個(gè)GⅧ平均每視野內(nèi)有100個(gè)GⅨ平均每視野內(nèi)有100個(gè)以上GⅩ2.核酸檢測(cè)

用PCR法(尤其是定量PCR法)或核酸探針可快速診斷結(jié)核分枝桿菌感染。其特異性與敏感性均>95%(可達(dá)100％)。3.色譜分析技術(shù)

因不同分枝桿菌的細(xì)胞壁中的分枝菌酸含量不同，故可利用氣液相色譜(HPLC)分析不同分枝桿菌的脂肪酸，可進(jìn)行菌種鑒定，具有快速、微量、敏感性高等特點(diǎn)。4.免疫學(xué)診斷

(1)抗PPDIgG檢測(cè)：用PPD(純蛋白衍生物)為抗原，用ELISA法檢測(cè)結(jié)核病人血清中的抗PPDIgG，可作為活動(dòng)性結(jié)核分枝桿菌感染的快速診斷，其敏感性為60％-80％，特異性約90％，肺結(jié)核病人的血清陽性率為80％-90%.(2)結(jié)核菌素試驗(yàn)(tuberculintest):

是利用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚試驗(yàn)來測(cè)定機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌是否產(chǎn)生遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的一種試驗(yàn)。結(jié)核菌素是結(jié)核分枝桿菌的菌體成分，可分為兩種：一種是舊結(jié)核菌素(oldtuberculin,OT),另一種是純蛋白衍生物(purifiedproteinderivative,PPD)包括：結(jié)核分枝桿菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD兩種，每0.1ml含5個(gè)單位，目前均用PPD.

原理：結(jié)核分枝桿菌的感染、免疫、變態(tài)反應(yīng)三者同時(shí)存在，所以可用PPD來做皮膚試驗(yàn)，看局部皮膚有無變態(tài)反應(yīng)，從而推測(cè)機(jī)體是否有傳染和免疫。

方法與結(jié)果判斷：取0.1mlPPD(含5u)前臂皮內(nèi)注射，48－72小時(shí)后.局部紅腫硬結(jié)>5mm者為陽性。表明機(jī)體可能感染過結(jié)核分枝桿菌或接種過卡介苗，但不一定患結(jié)核??；局部紅腫硬結(jié)>15mm為強(qiáng)陽性，表明機(jī)體可能有活動(dòng)性結(jié)核，應(yīng)進(jìn)一步檢查；局部紅腫硬結(jié)<5mm為陰性，表明未感染過結(jié)核分枝桿菌，但應(yīng)排除原發(fā)性結(jié)核病的早期、老年人、嚴(yán)重結(jié)核病(如粟粒性TB、結(jié)腦)或有其它嚴(yán)重疾病(如麻疹、淋巴瘤、白血病、AIDS)以及免疫抑制劑應(yīng)用者。

用途：①可作流行病學(xué)調(diào)查,了解人群對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染率。②選擇BCG接種的對(duì)象及接種的效果。③可作為嬰幼兒(<3歲)結(jié)核病診斷的參考指標(biāo)。④可測(cè)定腫瘤病人的細(xì)胞免疫功能。結(jié)核菌素試驗(yàn)陽性(3)全血干擾素測(cè)定法：

當(dāng)全血＋PPD/植物血凝素共同孵育后，致敏LC可分泌IFN-γ，通過檢測(cè)IFN-γ的含量來鑒定菌種。本試驗(yàn)的結(jié)果與結(jié)核菌素試驗(yàn)相當(dāng)，且受BCG接種史影響小，又能與非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行區(qū)分，同時(shí)尚可避免結(jié)核菌素試驗(yàn)在操作上與結(jié)果判斷上存在的多種主觀或人為因素的影響。

5.分離培養(yǎng)(1)標(biāo)本前處理：結(jié)核病人的痰或其它標(biāo)本大多含有雜菌，在培養(yǎng)前可用4％NaOH、4％H2SO4、胰酶-新潔爾滅法等對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理，以達(dá)到殺滅雜菌或減少雜菌和液化痰標(biāo)本的目的。