畢四海畢業(yè)答辯

題目:恩施黑豬PTGFR基因SNP檢測及遺傳多態(tài)性分析

學(xué)生：畢四海指導(dǎo)老師：楊軍班級(jí)：動(dòng)科31002班核心組成結(jié)果與分析小結(jié)與討論致謝材料與方法前言前言我們都知道，母豬有發(fā)情周期，其本質(zhì)是受下丘腦—垂體—卵巢軸系調(diào)控而產(chǎn)生的周而復(fù)始的生殖生理變化。

發(fā)情前期黃體進(jìn)一步液化，卵泡開始發(fā)育；發(fā)情期卵泡發(fā)育成熟；發(fā)情后期成熟卵泡破裂、排卵，黃體開始形成；間情期黃體逐漸發(fā)育，并達(dá)到最大，孕激素分泌量也隨之逐漸達(dá)到最高水平，性中樞受到抑制。若是母豬未成功受孕，其子宮內(nèi)膜產(chǎn)生的前列腺素PGF2α通過逆流途徑促進(jìn)黃體退化，使之進(jìn)入下一個(gè)發(fā)情周期；反之若母豬妊娠,則轉(zhuǎn)化為妊娠黃體。這種暫時(shí)性的分泌器官分泌的孕酮是維持妊娠的主要激素。由于豬的胎盤不能分泌足夠的孕酮來維持妊娠，在此不再贅述。

主要激素的變化雌激素

妊娠早期,雌激素(Estrogen)主要來源于黃體。隨著妊娠期的增長,在母體產(chǎn)生的雌激素以及胎兒皮質(zhì)醇增加的影響下,胎盤產(chǎn)生的雌激素逐漸增加,分娩時(shí)達(dá)到最高峰。在分娩前,體內(nèi)雌激素的水平增高而孕酮濃度下降,導(dǎo)致孕酮與雌激素的比值發(fā)生變化,使子宮肌層對(duì)催產(chǎn)素的敏感性增高。妊娠期間雌激素可以調(diào)節(jié)孕酮的合成和分泌。分娩時(shí),雌激素可能通過對(duì)孕酮的抑制作用、刺激催產(chǎn)素受體的發(fā)育、刺激前列腺素的合成和釋放增強(qiáng)子宮肌層的自發(fā)性收縮。孕酮在妊娠早期維持妊娠所需的孕酮來自于黃體。妊娠的中后期，孕酮主要作用有五個(gè)方面：促進(jìn)子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化；抑制雌激素和催產(chǎn)素等對(duì)子宮肌層的收縮作用,使子宮保持靜止,保證胎兒生活在一個(gè)平衡穩(wěn)定的環(huán)境中;抑制前列腺素的合成,保持子宮肌層處于靜止?fàn)顟B(tài),抑制子宮節(jié)律收縮的起始；能夠抑制一些與免疫排斥相關(guān)的免疫反應(yīng)；能夠抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的組織感染,賦予著床的胚胎和發(fā)育的胎盤免疫能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,孕酮濃度的降低伴隨有PGF2α的分泌增多。孕酮濃度降低使抑制子宮肌層收縮的作用被解除。在家畜中,胎兒成熟時(shí)分泌的糖皮質(zhì)激素能夠刺激子宮分泌前列腺素,它可以順著子宮頸進(jìn)入母體的腹腔溶解黃體。但是臨產(chǎn)前和分娩時(shí)孕婦的孕酮濃度反而高于妊娠的其他階段,這有可能是由于孕酮受體不同亞型表達(dá)比例發(fā)生變化,導(dǎo)致孕酮不能夠發(fā)揮作用。前列腺素哺乳動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的前列腺素是排卵所必需的。通過對(duì)前列腺素合成的抑制可以阻止實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和非人靈長類的自發(fā)排卵和誘發(fā)排卵。當(dāng)內(nèi)源性的前列腺素合成受阻時(shí),注射前列腺素能夠引發(fā)排卵。前列腺素是溶解黃體、刺激子宮肌收縮的重要物質(zhì)。子宮內(nèi)膜來源的PGF2α在流經(jīng)子宮靜脈時(shí)通過逆流循環(huán)到達(dá)卵巢，引起黃體的溶解（Mitchelletal，1995）。高水平的PGF2α引起黃體分泌催產(chǎn)素。另外前列腺素對(duì)子宮平滑肌有強(qiáng)烈的刺激作用,通過受體使肌肉收縮。敲除PGF2α受體基因的小鼠可以正常發(fā)育,但不能正常分娩。前列腺素合成酶I(Cycloxygenase-1,COX-1)基因敲除的小鼠不能正常分娩,可能是由于黃體的退化受阻造成的(Gibb,1998)。催產(chǎn)素催產(chǎn)素(Oxytixin,OXT)對(duì)分娩的發(fā)動(dòng)起重要的但非分娩發(fā)動(dòng)的啟動(dòng)因子。將已妊娠綿羊或其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的垂體切除,它們?nèi)匀豢梢园凑毡旧淼哪Ｊ椒置?。將小鼠的催產(chǎn)素基因敲除,它仍然有正常的妊娠和分娩過程。分娩開始時(shí)血液中的OXT含量變化不大,當(dāng)胎頭通過產(chǎn)道時(shí)或者多胎動(dòng)物產(chǎn)出一仔后,引起反射性的緊張活動(dòng),其分泌量才相對(duì)增加。妊娠早期,子宮對(duì)大劑量催產(chǎn)素也不發(fā)生反應(yīng),它會(huì)受到催產(chǎn)素酶的降解,而到妊娠后期由于降解催產(chǎn)素酶的逐漸消失,僅用少量催產(chǎn)素即可引起子宮強(qiáng)烈收縮。實(shí)驗(yàn)證明,妊娠末期子宮對(duì)催產(chǎn)素的敏感性可以增加20倍。臨產(chǎn)前孕酮分泌量下降,雌激素增多,可以激發(fā)催產(chǎn)素的分泌。它還能刺激前列腺素的合成,進(jìn)一步增強(qiáng)子宮的收縮。

分娩的啟動(dòng)并非單一因素所致,而是由機(jī)械擴(kuò)張、神經(jīng)及激素等多種因素相互關(guān)系!彼此協(xié)調(diào)所促成。

促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素（CorticotropinReleasingHormone，CRH）可能決定分娩的起始，分娩啟動(dòng)前母體的CRH水平達(dá)到最高水平。切除羊胎兒的下丘腦、垂體和腎上腺可以阻止分娩,使妊娠期延長。給切除垂體和

腎上腺的胎兒滴注促腎上腺皮質(zhì)激(AdrenocorticotrophicHormone,ACTH)或者地塞米松能誘發(fā)分娩,而且給妊娠末期的胎羔滴注合成的ACTH或者地塞米松也能誘發(fā)早產(chǎn)。

肺泡表面活性蛋白A(SurfactantProteinA,SP-A)在妊娠完成80%時(shí)胎肺開始表達(dá),并在出生前達(dá)到最高峰。這有可能是皮質(zhì)醇促進(jìn)胎肺的成熟,其分泌的SP-A進(jìn)入羊水作為巨噬細(xì)胞活化和遷移的信號(hào),確保發(fā)生炎癥反應(yīng)導(dǎo)致分娩。有證據(jù)表明分娩前的起始與子宮內(nèi)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。胎膜未破的情況下發(fā)生的早產(chǎn)大約有30%在妊娠的末期有明顯的炎癥。妊娠期的QTL定位

QTL是在基因組中占據(jù)一定染色體區(qū)域,控制某一數(shù)量性狀的一組微效多基因的集合(或基因簇)。

通過基因組掃描的方法國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)在1號(hào)、9號(hào)、15號(hào)染色體上可能存在控制妊娠期的QTL。但控制豬妊娠期的候選基因研究尚未見報(bào)道。根據(jù)雙直接熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)人的7、11號(hào)染色體與豬的9號(hào)染色體是部分同源的,而影響豬妊娠期的一段區(qū)域是和人的1號(hào)染色體的部分區(qū)域是同源的,我們從人的這部分區(qū)域?qū)ふ胰焉镞^程中有重要作用的基因Renin和IL-10,與豬妊娠期的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行研究。本研究的目的是檢測影響豬妊娠期長短的候選基因PTGFR（前列腺素F2α受體基因）的核酸多態(tài)性，并對(duì)其遺傳多態(tài)信息進(jìn)行分析，為揭示豬的妊娠期的遺傳機(jī)理打下基礎(chǔ)。

材料：

40頭恩施黑豬來自長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)豬場，耳組織取樣。所采集的組織樣均放入70%的乙醇中，-20℃保存。

設(shè)備：Sigma常溫高速離心機(jī)、Sigma冷凍高速離心機(jī)、水平電泳槽、電泳儀、低溫恒溫水浴槽、超純水儀、梯度PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、海爾超低溫冰箱、海爾冰柜、pH計(jì)、紫外風(fēng)光光度計(jì)、高壓滅菌鍋、制冰機(jī)、電子天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、美的微波爐、超凈工作臺(tái)、分子雜交爐、可調(diào)式微量移液器

藥品和試劑：MTris-Cl（pH8.0)、0.5MEDTA（pH8.0）、100mMNaCl、50×TAE、5M乙酸鉀、6M氯化鋰、10%APS、EB染色液、10mg／ml蛋白酶K、TE緩沖液(pH8．O)、溴化乙錠（EB）、三羥甲基氨基甲烷（Tris），西班牙瓊脂糖（分裝）、10mMdNTPMix、PCR引物由上海捷瑞生物合成，用超純水配制成25pM/μl的工作液，-20℃保存、無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇、乙醚等常規(guī)試劑由長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供。

材料與方法方法：1、豬耳組織基因組DNA提取2、基因組DNA樣品濃度和純度檢測和稀釋3、PTGFR基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)與合成4、PTGFR基因擴(kuò)增

試劑體積（μl）10×PCRBuffer2.5dNTPs1.0PrimerF0.25PrimerR0.25模板DNA1.0TaqⅠ0.5ddH2O17.5Totalvolume23.0PTGFR基因PCR反應(yīng)體系

5、PCR-RFLP分析統(tǒng)計(jì)與分析：

基因型頻率（Genotypicfrequency）和等位基因頻率（Allelicfrequency）

遺傳特性分析試劑劑量倍數(shù)PCRreactionmixture10μl10×BufferBsuR1Nuclease-freewater2μl1μl18μl×52104μl52μl936μl酶切反應(yīng)體系

1、恩施黑豬耳部組織基因組DNA提取結(jié)果：

從恩施黑豬耳部組織所提取的基因組DNA電泳條帶清晰，基本沒有彌散現(xiàn)象，且點(diǎn)樣孔較干凈。說明所提取的基因組DNA完整性好，且?guī)缀鯖]有多糖和蛋白質(zhì)的殘留，完全可以用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增和酶切反應(yīng)。

結(jié)果與分析2、PTGFR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果：

所合成的引物對(duì)40個(gè)個(gè)體均擴(kuò)增出了683bp大小片段，且無雜帶，可進(jìn)行后續(xù)PCR-RFLP分析。

3、PTGFR基因PCR-RFLP酶切基因型檢測結(jié)果：PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和EB染色顯影后，檢測到3種基因型，條帶清晰可辨，兩種純合子分別命名為AA基因型和BB基因型，雜合子為AB基因型。4、恩施黑豬PTGFR基因群體遺傳學(xué)分析

4.1恩施黑豬PTGFR基因的基因型頻率和等位基因頻率：A、B兩等位基因頻率完全相等，各占50%。該恩施黑豬群體PTGFR基因位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)（P>0.05）?；蛐突蛐皖l率等位基因等位基因頻

率卡方值（概率）AA0.3778A0.5000AB0.24442.85（P=0.8750）BB0.3778B0.5000恩施黑豬PTGFR基因頻率和基因型頻率4.2

恩施黑豬PTGFR基因多態(tài)性分析結(jié)果：

等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)相等，雜合度0.2444，遺傳變異較低，多態(tài)性（PIC=0.3750）為中度多態(tài)。等位基因數(shù)（Na）有效等位基因數(shù)（Ne）雜合度（He）純合度（Ho）多態(tài)信息含量（PIC）22.00000.24440.75560.3750恩施黑豬PTGFR基因多態(tài)性分析前列腺素對(duì)于分娩有著極其重要的作用，PTGFR是前列腺素受體基因，PTGFR核酸序列的變異可能引起前列腺素在動(dòng)物體內(nèi)的生物功能變化。恩施黑豬群體中AA、BB型個(gè)體相當(dāng)，AB型個(gè)體相對(duì)較少，A、B等位基因頻