《離心層析電泳技術(shù)》

常用臨床生物化學(xué)分析技術(shù)離心、層析、電泳技術(shù)

常用臨床生物化學(xué)分析技術(shù)

主要介紹：

離心技術(shù)、層析技術(shù)、電泳技術(shù)，在臨床生物化學(xué)中的應(yīng)用及應(yīng)該注意的基本知識(shí)

物質(zhì)的分離技術(shù)最普遍使用的有三大類(lèi)，即離心技術(shù)、層析技術(shù)、電泳技術(shù)。

它們是三項(xiàng)基本的實(shí)驗(yàn)室分離技術(shù)。一.離心技術(shù)：

簡(jiǎn)介：離心現(xiàn)象是指物體在離心力場(chǎng)中表現(xiàn)的沉降運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象，應(yīng)用離心沉降進(jìn)行物質(zhì)的分析和分離的技術(shù)稱(chēng)為離心技術(shù)。離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)受到一個(gè)外向的離心力的作用而發(fā)展起來(lái)的。尤其在生化檢驗(yàn)方面，離心機(jī)是分離細(xì)胞、細(xì)胞器和生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)等必不可少的工具。最簡(jiǎn)單的離心機(jī)由一個(gè)轉(zhuǎn)頭和一個(gè)驅(qū)動(dòng)器組成，轉(zhuǎn)頭用來(lái)承載待處理的樣品，驅(qū)動(dòng)器則用來(lái)使轉(zhuǎn)頭以一定角速度作圓周運(yùn)動(dòng)以獲得離心力?，F(xiàn)代化的離心機(jī)再輔以各種附屬裝置以保證轉(zhuǎn)頭的工作質(zhì)量，維持一定工作環(huán)境或特定目的，并廣泛采用電腦控制。（一）.離心技術(shù)的分類(lèi)1.根據(jù)離心方法分類(lèi)：（1）.平衡離心法：①差速離心法：利用樣品中各種組分的沉降系數(shù)不同而進(jìn)行的分離方法。②速率區(qū)帶離心法:：是根據(jù)樣品中不同組分離子所具有的不同的體積尺寸大小和不同的沉降系數(shù)將混合樣品進(jìn)行離心分離提純。.（2）.等密度離心法：又稱(chēng)等比重離心法，以離子密度進(jìn)行分離。（3).經(jīng)典式沉降平衡離心法：在分析離心方法中是最常用的，用于生物大分子分子量的測(cè)定、純度估計(jì)、了解構(gòu)象變化等。2.依據(jù)離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的旋轉(zhuǎn)速度分類(lèi)：(1).低速離心：（4000r/min以?xún)?nèi)）(2).高速離心：（20000r/min，最大相對(duì)離心率可達(dá)45000g）(3).超速離心：（30000r/min以上，最大相對(duì)離心率達(dá)645000g）3.按照離心技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用分類(lèi)：(1).普通離心(2).專(zhuān)用離心(3).制備型離心(4).分析型離心（二）.各類(lèi)型離心機(jī)的特點(diǎn)和應(yīng)用：1.低速離心機(jī)(1).錐形臺(tái)式離心機(jī)：體積小、重量輕、容量大，能自動(dòng)控制工作時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，使用方便，適用于醫(yī)院檢驗(yàn)科，生物化學(xué)化驗(yàn)室等對(duì)樣品的初級(jí)處理。(2).水平型桶式離心機(jī)(3).大容量立式離心機(jī)(4).帶冷凍系統(tǒng)的大容量低速離心機(jī)2.高速離心機(jī)：由于運(yùn)轉(zhuǎn)速度快，一般多配備冷凍控溫裝置，適用于各種生物細(xì)胞、病毒、血漿蛋白等有機(jī)物、無(wú)機(jī)物溶液、懸浮液及膠體溶液中有形成份的濃縮、提取、制備等工作，它是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物水平研究的重要工具。3.超速離心機(jī)：（1）.制備型超速離心機(jī)：是臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)等研究領(lǐng)域重要儀器之一，利用高速回轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的巨大離心力對(duì)細(xì)胞器、病毒、生物大分子進(jìn)行分離、濃縮和精致。（2）.分析型超速離心機(jī)：一般都裝備有特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)頭和控制系統(tǒng)，利用光學(xué)系統(tǒng)可直接觀察和分析樣品的沉降情況，利用特殊配備的數(shù)據(jù)處理機(jī)自動(dòng)計(jì)算沉降系數(shù)、分子量。它主要用于生物大分子的分子量測(cè)定，評(píng)價(jià)樣品純度和檢測(cè)生物大分子結(jié)構(gòu)組態(tài)的變化等。（三）.操作中注意事項(xiàng)：普通醫(yī)用離心機(jī)轉(zhuǎn)速稍低，最常用，也最容易忽視安全，使用時(shí)必需每次做到：（1）.用前檢查離心機(jī)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)速器等都應(yīng)在起動(dòng)狀態(tài)（即每次用后應(yīng)關(guān)好開(kāi)關(guān)，退回調(diào)速器至起點(diǎn)）。（2）.平衡轉(zhuǎn)頭上相對(duì)兩管至等重：水平轉(zhuǎn)頭常連套管在一起，在靈敏度0.1g的天平上平衡至等重，平衡時(shí)要檢查套管內(nèi)有無(wú)損傷或以前破管時(shí)殘留物，否則要先洗凈，以免再次引起破管。角度轉(zhuǎn)頭只能用配管平衡，不能在轉(zhuǎn)頭的插孔中隨意加水或放空管去平衡。

使用高速和超速離心機(jī)必須嚴(yán)格按操作說(shuō)明書(shū)操作！原則上應(yīng)牢記，大型機(jī)一旦發(fā)生操作事故，必比普通機(jī)嚴(yán)重百倍！二.層析技術(shù)：（一）.簡(jiǎn)介：層析技術(shù)是一種現(xiàn)在已經(jīng)廣泛使用的物理化學(xué)分析法，是色層分析法或色譜分析法的簡(jiǎn)稱(chēng)。層析法目前已發(fā)展成許多不同類(lèi)型而又各具特色的方法，層析用的各種儀器也由最簡(jiǎn)單的自制組合裝置發(fā)展成各種現(xiàn)代化，全自動(dòng)的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的層析儀，廣泛用于各種與化學(xué)有關(guān)的領(lǐng)域，特別是生物化學(xué)的研究中。(二).原理和分類(lèi):層析技術(shù)是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來(lái)的技術(shù)，各種層析方法都是利用物質(zhì)在不互溶的兩相之間，其吸附、溶解或親和作用等理化性質(zhì)上的差異，而將其從混合物中分離出來(lái)，加以鑒定的。其中一項(xiàng)稱(chēng)為流動(dòng)相（或稱(chēng)移動(dòng)相），另一項(xiàng)則稱(chēng)為固定項(xiàng)。根據(jù)兩相的特點(diǎn)，常將層析分為兩大類(lèi)：流動(dòng)相為液體的稱(chēng)為液相層析，流動(dòng)相為氣體的稱(chēng)為氣相層析。層析隨其層析過(guò)程的機(jī)制即原理不同，又分為以下幾種：1.吸附層析：利用同一吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附性能不同，可以在連續(xù)的吸附和解吸過(guò)程中達(dá)到使之分離的目的。其固定相就是固體的吸附劑。2.分配層析：利用不同物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)（或溶解度）不同，可以將它們分開(kāi)。其固定相也是液體，但附著在其他固體惰性材料上。

3.離子交換層析：利用各種不同的離子型物質(zhì)對(duì)離子交換劑的親和力不同而加以分開(kāi)。其固定相為各種離子交換劑。4.凝膠層析：利用某種凝膠對(duì)分子大小不同的物質(zhì)有不同的阻滯作用（起到分子篩作用）能分開(kāi)分子大小不同的物質(zhì)。其固定相大多數(shù)是親水凝膠。5.親和層析：利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異性親和力，從而達(dá)到分離目的的一類(lèi)特殊層析技術(shù)。實(shí)際上大多數(shù)層析都有吸附、分配過(guò)程，所以實(shí)用中仍常以操作時(shí)所采取的方式來(lái)命名。如柱層析（又叫加柱層析）、薄層層析、紙層析、薄膜層析等等。（三）.特點(diǎn)與應(yīng)用:在層析法中,根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積可以定性及定量。由于層析法具有分辨率高、靈敏度高、選擇性好、速度快等特點(diǎn)，因此適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析。實(shí)際在原理及分類(lèi)里大家已經(jīng)知道各種層析法的特點(diǎn)，根據(jù)原理特點(diǎn)有其不同的應(yīng)用：1.凝膠層析法：主要用于蛋白質(zhì)及其他生物大分子物質(zhì)的分離。如:①.脫鹽：用于生化制劑脫鹽，分離蛋白質(zhì)。②.分離提純精制：許多生化物質(zhì)都可用凝膠層析法精制。③.測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量。④.高分子溶液的濃縮。2.離子交換層析法：在生物化學(xué)及臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中主要用于分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)及同工酶，也可用于分離核酸、核苷酸及其他帶電荷的生物分子。3.高效液相層析法：分離能力強(qiáng)、測(cè)定靈敏度高、可在室溫下進(jìn)行，應(yīng)用范圍極廣，對(duì)蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類(lèi)固醇和類(lèi)脂等大分子以及高分子去聚合物分離尤為有利。鑒于臨床的需要，國(guó)外一些公司設(shè)計(jì)了自動(dòng)高效液相色譜儀，該儀器具有以下優(yōu)點(diǎn)：①.固定色譜柱和流動(dòng)相，使一臺(tái)儀器適合多種藥物的檢測(cè)。②.利用計(jì)算機(jī)技術(shù)，儲(chǔ)存幾百種藥物的圖譜，能自動(dòng)識(shí)別未知藥物，為提高圖譜鑒別能力，該機(jī)利用了三維光譜、出峰時(shí)間等多種手段。③.自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)使儀器自動(dòng)定量或定性測(cè)定分析多達(dá)50多個(gè)樣品。4.親和層析法：用于純化生物大分子，稀溶液的濃縮，不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏，從純化的分子中除去殘余污染物和用免疫吸附劑吸附純化那些尚無(wú)互補(bǔ)配體的生物大分子以及分離核酸等如用親和層析法提取特異性免疫球蛋白IgG等等。三.電泳技術(shù)：

[定義]：在電場(chǎng)中，帶電粒子向所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱(chēng)為電泳。[簡(jiǎn)介]：電泳技術(shù)作為一種分離方法，已有數(shù)十年歷史，特別是自1937年瑞典科學(xué)家建立了分離蛋白質(zhì)的界面電泳，繼而濾紙電泳研制成功后，各種形式的區(qū)帶電泳相繼出現(xiàn)，電泳技術(shù)在生物學(xué)和生物化學(xué)中被廣泛應(yīng)用。（一）.電泳技術(shù)的分類(lèi)和特點(diǎn)：按原理分為三種形式的分離系統(tǒng)：1.自由.移動(dòng)界面電泳：如密度梯度電泳等，現(xiàn)已成為歷史。2.移態(tài)電泳：如等電聚焦和等速電泳。前兩種不用支持體，后一種則用各種類(lèi)型的物質(zhì)作為支持體（支持介質(zhì)）。3.區(qū)帶電泳：根據(jù)固體支持體（介質(zhì)）不同分為兩類(lèi)：（1）.紙上電泳、醋酸纖維素薄膜電泳等。（2）.第二類(lèi)分兩種：①.凝膠電泳：如瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠等。②非凝膠電泳:如淀粉、纖維素粉等。

（二）.影響電泳的因素：在電泳中，電場(chǎng)、帶電粒子、和促使帶電粒子移動(dòng)的介質(zhì)是產(chǎn)生電泳的三大要素，因此影響電泳的主要因素有：（1）.顆粒性質(zhì)：不同的帶電粒子在同一電場(chǎng)中移動(dòng)的速度不同，這一速度稱(chēng)遷移率。換言之，遷移率取決于帶電粒子的性質(zhì)，粒子所帶電荷多，泳動(dòng)速度就快。（2）.電場(chǎng)強(qiáng)度（也稱(chēng)電位梯度）：電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶電粒子的泳動(dòng)速度就越快。電場(chǎng)強(qiáng)度在2-10v/cm稱(chēng)為常壓電泳電場(chǎng)強(qiáng)度在20-200v/cm稱(chēng)為高壓電泳（3）.溶液的pH：影響帶電粒子的解離程度，對(duì)兩性電解質(zhì)如蛋白質(zhì)、氨基酸等pH離開(kāi)等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，所帶電荷越多，泳動(dòng)速度越快，若在等電點(diǎn)pH溶液中，則不能泳動(dòng)，為保持電泳時(shí)pH恒定，電泳都在一定的緩沖液中進(jìn)行。（4）.緩沖液的離子強(qiáng)度：一般保持在0.02-0.2之間，離子強(qiáng)度越小，泳動(dòng)的速度越快。（5）.電滲：是指電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。在選用電泳支持物時(shí)，要考慮避免有高電滲作用的物質(zhì)。（三）.區(qū)帶電泳在臨床、科研等領(lǐng)域的應(yīng)用：目前電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床診斷和基礎(chǔ)理論研究中,如各級(jí)醫(yī)院常常用它來(lái)進(jìn)行血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白的分離、鑒定和含量測(cè)定，以及血清酶的檢驗(yàn)、免疫化學(xué)檢驗(yàn)等，作為診斷肝癌、肝硬化、惡性腫瘤、腎病綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤等的診斷依據(jù)之一。在科研工作中利用高壓電泳來(lái)研究蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)等。在生化工業(yè)中用于提純酶、激素及其他生化產(chǎn)品等等，總之，一系列與生物有關(guān)的物質(zhì)（小至氨基酸，大至細(xì)胞）的鑒別、分離、提純都離不開(kāi)電泳技術(shù)。毛細(xì)管電泳：具有無(wú)法比擬的高效和快速性，因而受到極大重視，毛細(xì)管區(qū)帶電泳已形成系列方法，以適應(yīng)不同目的的需要：（1）.分析核酸：傳統(tǒng)是以聚丙烯酰胺或瓊脂糖作凝膠電泳分離，此法類(lèi)似其但更快，用樣量更少。（2）.分析PCR產(chǎn)物：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是基因操作中一種體外擴(kuò)增DNA的重要技術(shù)。（3).分離、分析多肽。(4).對(duì)小的生物分子的分離：毛細(xì)管電泳+分配層析技術(shù)稱(chēng)為分子束電層析，分離B族維生素，食物色素等等。

三類(lèi)技術(shù)比較：物質(zhì)的分離技術(shù)最普遍使用的有三大類(lèi)，即層析技術(shù)、電泳技術(shù)和離心技術(shù)。它們是三項(xiàng)基本的實(shí)驗(yàn)室分離技術(shù)。這三類(lèi)技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，相互補(bǔ)充。從分離原理來(lái)看，層析技術(shù)根據(jù)顆粒吸附性和摩擦系數(shù)進(jìn)行分離，電泳技術(shù)根據(jù)帶電顆粒的摩擦系數(shù)進(jìn)行分離，離心技術(shù)是根據(jù)樣品的質(zhì)量、密度和摩擦系數(shù)進(jìn)行分離的。從可處理樣品的容量來(lái)看，層析和電泳只能用于小量樣品的分析性或制備性分離。離心方法可以使用大容量轉(zhuǎn)頭，特別是離心沉淀和差速離心法可以一次處理數(shù)千毫升的樣品液從分離樣品的大小范圍來(lái)看，由于層析和電泳技術(shù)一般是在凝膠中或支持介質(zhì)中進(jìn)行，所以它們能分離