無乳鏈球菌口服疫苗免疫羅非魚的免疫機(jī)制與效果研究,漁業(yè)論文

無乳鏈球菌口服疫苗免疫羅非魚的免疫機(jī)制與效果研究,漁業(yè)論文無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)又稱B群鏈球菌(groupBstreptococci,GBS),在自然界,也是一種重要的水產(chǎn)動(dòng)物致病菌。魚類無乳鏈球菌病的流行與爆發(fā)在很多國(guó)家均有報(bào)道,給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來,魚類無乳鏈球菌病在我們國(guó)家的發(fā)生率呈上升趨勢(shì),十分是位于我們國(guó)家南部的廣東、廣西和海南等地爆發(fā)嚴(yán)重。當(dāng)前,對(duì)于羅非魚鏈球菌病的防治方式方法多樣,華而不實(shí)使用疫苗免疫是最重要的方式方法之一。因而,我們國(guó)家正大力發(fā)展羅非魚無乳鏈球菌病疫苗的研究,并獲得一定進(jìn)展。本試驗(yàn)利用自行研制的無乳鏈球菌口服疫苗免疫羅非魚,應(yīng)用HE染色方式方法觀察腸絨毛形態(tài)構(gòu)造、杯狀細(xì)胞以及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的分布和數(shù)量,討論該疫苗的免疫機(jī)制及不同免疫劑量的免疫效果,以期為該疫苗的深切進(jìn)入研究和推廣應(yīng)用積累資料。1、材料與方式方法1.1材料試驗(yàn)用羅非魚由廣西水產(chǎn)研究所國(guó)家級(jí)羅非魚良種場(chǎng)提供,體重為100g10g,體長(zhǎng)為15cm2cm;無乳鏈球菌GX035弱毒苗由廣西水產(chǎn)研究所魚類病害防治實(shí)驗(yàn)室提供。1.2方式方法1.2.1飼養(yǎng)管理羅非魚飼養(yǎng)于室內(nèi)水箱中(規(guī)格:70cm50cm40cm),各組水質(zhì)均為脫氯自來水,全天供氧。試驗(yàn)期間水溫保持在27℃~29℃,每周換水2/3。天天飼喂2次(8:00和16:00),日投飼率為2%~3%。1.2.2試驗(yàn)分組與處理選用體重為100g10g,體長(zhǎng)為15cm2cm的健康羅非魚共125尾,隨機(jī)分為5個(gè)試驗(yàn)組,每組25尾魚。免疫前馴養(yǎng)2周。試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為免疫組,分別投喂劑量為1.0106、1.0107、1.0108、1.0109CFU/mL的口服型無乳鏈球菌GX035弱毒苗(每100g飼料用100mL相應(yīng)濃度的菌懸液拌勻后在50℃烘箱中烘干),試驗(yàn)Ⅴ組為空白對(duì)照組,投喂未添加疫苗的飼料,根據(jù)2.5g/尾進(jìn)行投喂。1.2.3組織切片制備免疫接種15d后,從各組中隨機(jī)抽取1尾(共5尾)羅非魚進(jìn)行解剖,迅速取出前腸、中腸和后腸分別制樣。前腸在胃后端至腸道的第一個(gè)彎曲之間取材,中腸在腸道的第一個(gè)彎曲至最后一個(gè)彎曲之間取材,后腸在腸道最后一個(gè)彎曲至肛門之間取材,各腸段長(zhǎng)度約1cm。將腸段浸入pH7.2~7.4的磷酸鹽緩沖液中沖洗腸道內(nèi)容物,使用Bouin固定液固定各腸段后,制作石蠟切片,HE染色,顯微鏡觀察。1.2.4各指標(biāo)的形態(tài)觀察和測(cè)量參照黃玉章等提供的方式方法,每段腸道選取5張染色效果較好的切片于400倍鏡下對(duì)下面指標(biāo)進(jìn)行觀察:腸絨毛、各腸段肌層厚度、杯狀細(xì)胞、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞,并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)(Superimageverson6.0.1.2)對(duì)其進(jìn)行拍照和測(cè)量。1.2.5攻毒試驗(yàn)免疫20d后,所有魚(各組均為20尾)均根據(jù)1.67107CFU/尾的劑量腹腔注射感染無乳鏈球菌,記錄攻毒后10d內(nèi)各組魚的死亡數(shù),并計(jì)算相對(duì)免疫保衛(wèi)率(RPS)。1.2.6數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。P0.05為差異顯著,P0.01為差異極顯著,P0.05為差異不顯著。2、結(jié)果2.1羅非魚腸絨毛長(zhǎng)度的變化各試驗(yàn)組不同腸段的腸絨毛長(zhǎng)度均呈現(xiàn)前腸最長(zhǎng),中腸次之,后腸最短的規(guī)律。免疫組與對(duì)照組不同腸段腸絨毛長(zhǎng)度相比,差異均不顯著(P0.05)(表1)。2.2羅非魚腸道肌層厚度的變化各試驗(yàn)組不同腸段的肌層厚度均呈現(xiàn)前腸最薄,中腸次之,后腸最厚的規(guī)律。免疫組與對(duì)照組相比擬,前腸肌層厚度:免疫Ⅰ組與對(duì)照組相比有增厚,但差異不顯著(P0.05),免疫Ⅱ組~Ⅳ組較對(duì)照組增加20.96%、20.09%、31.51%,差異極顯著(P0.01);中腸肌層厚度:免疫Ⅰ組與對(duì)照組相比有縮短,但差異不顯著(P0.05),免疫Ⅱ組~Ⅳ組較對(duì)照組均有增加趨勢(shì),華而不實(shí)免疫Ⅳ組較對(duì)照組增加17.01%,差異極顯著(P0.01);后腸肌層厚度:各免疫組較對(duì)照組均增厚,華而不實(shí)免疫Ⅱ組增加10.95%,差異顯著(P0.05),免疫Ⅳ組增加19.41%,差異極顯著(P0.01)(表2)。2.3羅非魚腸道黏膜的形態(tài)構(gòu)造觀察腸黏膜層具有環(huán)形皺襞、腸絨毛和小腸腺,黏膜上皮由柱狀細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞等組成。400倍鏡下觀察,各組腸段腸黏膜都較完好,層次分明。腸絨毛排列整潔,腸黏膜上皮細(xì)胞形狀規(guī)則,排列嚴(yán)密,染色鮮明。各免疫組腸絨毛頂端稍有脫落,固有層中軸稍有增寬(圖1)。2.4對(duì)杯狀細(xì)胞分布及數(shù)量的影響羅非魚腸道組織經(jīng)HE染色后,顯微鏡下觀察杯狀細(xì)胞呈藍(lán)色或空泡狀。各腸段上皮均有杯狀細(xì)胞分布,散在分布于柱狀細(xì)胞之間,其頂部胞質(zhì)因大量糖原顆粒擁塞而膨脹,底部纖細(xì),呈高腳杯狀。HE染色后,其頂部多糖成分因水解而呈現(xiàn)空泡狀(圖1)。免疫后各免疫組腸道內(nèi),呈藍(lán)色的杯狀細(xì)胞數(shù)量均比對(duì)照組有所減少,差異極顯著(P0.01)(表3)。2.5對(duì)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞分布及數(shù)量的影響對(duì)照組腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞多數(shù)位于上皮細(xì)胞基膜附近,少量見于上皮游離面,各免疫組腸道上皮淋巴細(xì)胞的分布則有所不同,上皮游離面的淋巴細(xì)胞增加,而且在固有層的分布亦增加,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象(圖1)。各免疫組前腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比擬,差異均不顯著(P0.05);免疫各組中腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比擬均顯著增加,華而不實(shí)免疫Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組分別比對(duì)照組增加31.97%、31.51%、42.43%,差異極顯著(P0.01),免疫Ⅲ組增加19.66%,差異顯著(P0.05);免疫各組后腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比擬也均顯著增加,華而不實(shí)免疫Ⅰ組(1.0106CFU/mL)、免疫Ⅱ組(1.0107CFU/mL)和免疫Ⅳ組(1.0109CFU/mL)分別比對(duì)照組增加34.82%、33.21%、38.32%,差異極顯著(P0.01),免疫Ⅲ組(1.0108CFU/mL)比對(duì)照組增加27.09%,差異顯著(P0.05)(表4)。2.6攻毒后的保衛(wèi)效果試驗(yàn)Ⅰ~Ⅳ組的相對(duì)保衛(wèi)率分別為16.67%、27.78%、55.56%和66.67%,Ⅳ組相對(duì)保衛(wèi)率最高(表5)3、討論腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是一群特殊的淋巴細(xì)胞,主要見于腸絨毛上皮細(xì)胞間,是機(jī)體免疫系統(tǒng)中與外來抗原以及微生物最先接觸的免疫細(xì)胞,介入腸道黏膜免疫反響,處于免疫防御的第一線。腸黏膜上皮與腸腔大量微生物、食物抗原接觸后,可通過調(diào)節(jié)腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞以預(yù)防腸腔致病微生物侵襲和對(duì)無害抗原產(chǎn)生耐受。因而,腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化在一定程度上反映腸道局部黏膜免疫反響狀況。黃春蘭等研究表示清楚,口服免疫ISCOMs疫苗一定時(shí)間后能夠刺激腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖,且不同腸段的變化規(guī)律不同;前、中腸變化趨勢(shì)類似,均表現(xiàn)為先下降后上升,華而不實(shí)免疫后14d腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞與對(duì)照組相比總體呈下降趨勢(shì),21d后數(shù)量開場(chǎng)上升,而后腸上皮淋巴細(xì)胞在免疫后7d小幅上升后持續(xù)降低,21d后到達(dá)試驗(yàn)期間最低值。研究結(jié)果表示清楚,免疫后15d,中、后腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞與對(duì)照組相比總體呈上升趨勢(shì),且免疫Ⅳ組1.0109CFU/mL效果最明顯;而前腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比差異均不顯著。表示清楚口服疫苗后,疫苗直接進(jìn)入腸道,可激活上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞。不同腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化規(guī)律不同,不同濃度的疫苗免疫后產(chǎn)生的效果不同,免疫后15d,免疫Ⅳ組1.0109CFU/mL上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量增殖最多,效果最明顯。不同腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化呈現(xiàn)不同規(guī)律,分析原因可能是前、中、后腸的生理構(gòu)造不同,進(jìn)而免疫功能有所區(qū)別,但不同腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化的詳細(xì)規(guī)律以及對(duì)魚體免疫功能的影響還需進(jìn)一步深切進(jìn)入研究析。黏液細(xì)胞是黏液分泌的生理基礎(chǔ),它是魚類上皮中的一種腺體細(xì)胞,廣泛分布在皮膚、鰓、消化道等部位。這類細(xì)胞分泌的黏液除了具有機(jī)械性屏障、化學(xué)屏障,調(diào)節(jié)浸透壓、潤(rùn)滑等作用外,黏液中含有的黏多糖、糖蛋白、免疫球蛋白及各種水解性酶類等非特異性的免疫活性物質(zhì),可抵抗病原微生物入侵,進(jìn)而保衛(wèi)魚體不受細(xì)菌、病毒等的損害。杯狀細(xì)胞是典型的黏液細(xì)胞,主要分布于消化道和呼吸道黏膜的上皮內(nèi)。正常情況下,底部狹窄構(gòu)成長(zhǎng)柄狀附著于基膜上,頂部充滿分泌顆粒而膨大,呈高腳杯狀,經(jīng)HE染色后為藍(lán)色或空泡狀。杯狀細(xì)胞是腸道黏膜免疫應(yīng)答的重要成員,其數(shù)量及形態(tài)的變化在一定程度上反映腸道的局部免疫狀況。本試驗(yàn)結(jié)果表示清楚,各免疫組腸道內(nèi),呈藍(lán)色的杯狀細(xì)胞數(shù)量均比對(duì)照組有所減少,差異極顯著(P0.01),但呈空泡狀的杯狀細(xì)胞明顯增加,且主要分布于腸絨毛底部或上部。表示清楚經(jīng)口服免疫后,杯狀細(xì)胞呈現(xiàn)活潑踴躍的分泌狀態(tài),無乳鏈球菌弱毒苗在一定程度上能加強(qiáng)腸道杯狀細(xì)胞的合成分泌功能。除此之外,良好的腸道黏膜形態(tài)構(gòu)造對(duì)保持魚類的健康及維持正常生產(chǎn)性能具有重要意義。研究結(jié)果表示清楚,各免疫組腸黏膜都較完好,但均發(fā)現(xiàn)腸絨毛頂端稍有脫落,固有層中軸稍有增寬的現(xiàn)象,表示清楚弱毒苗免疫后,羅非魚相關(guān)免疫反響被激活,腸道會(huì)發(fā)生稍微的炎癥反響,出現(xiàn)腸道組織構(gòu)造稍微損傷等現(xiàn)象。賴翔等研究證明,飼糧添加蘇氨酸能在一定程度上減緩PRV弱毒苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激帶來的斷奶仔豬生長(zhǎng)性能下降和腸道損傷;一些研究證明,黃芪多糖、低聚木糖、木聚糖酶等飼料添加劑可促進(jìn)魚的生長(zhǎng)發(fā)育,促進(jìn)受損腸黏膜細(xì)胞的修復(fù);因而在使用無乳鏈球菌弱毒苗免疫時(shí),可在飼養(yǎng)經(jīng)過中適當(dāng)配合使用飼料添加劑,以改善弱毒苗的不良影響。組織學(xué)觀察表示清楚,無乳鏈球菌口服弱毒疫苗可刺激腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞活化增殖,促進(jìn)腸道杯狀細(xì)胞的合成及分泌功能等,華而不實(shí)以免疫Ⅳ組1.0109CFU/mL變化最為明顯;同時(shí)攻毒感染試驗(yàn)結(jié)果顯示,免疫組的羅非魚因不同免疫