分離工程第七章

第七章色譜In1903，俄國植物學家MichaelTsweett’sWork(seeBer.Deut.Botan.Ges.,1906;24:384).Chromatography=(chromatus=color,graphein=towrite).A、圖形包含的意義B、分離機制C、柱效D、分離度紙層析第一節(jié)

色譜學基礎

1、一般過程2、分類3、名詞術語4、理論

4.1、塔板理論

4.2、速率理論

4.3、分離度

4.4、定性分析

4.5、定量分析

4.6、定量方法

5 應用:違禁藥物分析丁卡因N-烯丙基原嗎啡概念與原理層析：根據(jù)混合物中，溶質在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進行分離的方法。原理：互不相溶的兩相分別稱為固定相和流動相，固定相填充與柱中，在一端（入口）加入一定量的料液后，連續(xù)輸入流動相，料液中的溶質在流動相和固定相之間發(fā)生擴散傳質，產(chǎn)生分配平衡。分配系數(shù)m大的溶質在固定相上存在的幾率大，隨流動相移動的速度小。這樣，溶質之間由于移動速度的不同而得到分離，在層析柱出口處各個溶質的濃度變化如前圖所示。1 色譜一般過程組件及過程：A 色譜柱(column)：B 固定相(stationaryphase)：C 流動相(flowphase)：D 洗脫液(elution)：E 檢測器(detector)：F 部分收集器(portioncollector)2 色譜分類

1)、按應用的目的A、制備性色譜(preparationChromatography)：工業(yè)規(guī)模，實驗室規(guī)模B、分析性色譜(analyticalChromatography)：GC、LC、HPLC、TLC等。

2)、按流動相A、GC:

氣-固色譜法(固定相為固體)

氣-液色譜法(將不揮發(fā)的液體固定在適當?shù)墓腆w載體上作為固定相)B、LC

液-固色譜(固定相為固體)

液-液色譜(液體固定相固定在適當?shù)墓腆w上)

3)、按色譜的展開形式A、柱色譜法B、毛細管色譜法C、平板色譜法：硅膠板色譜、紙色譜2 色譜分類4)、按展開程序A)、洗脫法：料液中的溶質根據(jù)其在固定相和流動相中的分配行為的不同，在柱出口處被展開形成相互分離的色譜峰。B)、頂替法：與A相似，不同在于：采用的洗脫液中含有與固定相的親和力比料液中各個組分都大的物質（稱頂替劑），它將料液中所有溶質按其與固定相的親和力的大小不同從柱中按次序出來。適于大量處理稀溶液。C)、迎頭法：與一般的固定床吸附操作相同，大量料液連續(xù)輸入到層析柱中，直到在出口處發(fā)生溶質穿透，只有最先穿透的（分配系數(shù)大OR??？）組分能以純粹的狀態(tài)得到部分回收，之后的流出液均為雙組分或多組分的混合物。最常見的是A，本章主要討論的內容。5)、按原理分類2 色譜分類國際通用色譜法分類及其縮寫

3 色譜的名詞術語分配系數(shù)m：式中，cs和cm分別為組份在固定相和流動相中的濃度。m類型：A、B型曲線是一條典型的吸附等溫線，吸附色譜法屬于這類曲線。C和D型吸附等溫線很少遇到。C曲線為線性分配等溫線。線性色譜：溶質濃度低時，m為常數(shù)時的色譜意義：容易理解，溶質流過色譜柱時，m大的組份通過色譜柱所需要的時間長，m小的組份需要的時間短；當樣品中各組份在兩相的m不同時，就能實現(xiàn)差速遷移，達到分離的目的。Why?3 色譜的名詞術語色譜術語：A、基線：B、峰高：色譜峰頂與基線間的垂直距離，以h表示。

C、保留值：死時間tm：不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間。因為物質不被固定相吸附，故其流動速度將與流動相的流動速度相近：保留時間tr：試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)歷的時間。調整保留時間tr’：.3 色譜的名詞術語tr的表達：時間單位(如s,d,h),距離單位(如cm)，體積(ml,l)表示。tr意義：色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組份的tr常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積等參數(shù)進行定性檢定。D、死體積VM：指色譜柱內固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和，當后兩項很小而可忽略不計時，VM可由tm與流動相體積流速F0(ml/min)計算：E、保留體積VR：指從進樣開始到被測組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相體積。保留體積與tr的關系如下：F、調整保留體積V’R：某組份VR扣除VM后，稱該組份的V’R

，即3 色譜的名詞術語G、相對保留值2,1：某組份2與組份1的調整保留值之比，即： 由于2,1只與柱溫及固定相的性質有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它是色譜法中，如GC、HPLC中，廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。

注意：2,1絕不是兩個組份保留時間或保留體積之比在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標值(s),然后再求其它峰(i)對這個峰的相對保留值。此時r,i

可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常選擇一對最難分離的物質對，將它們的相對保留值作為重要參數(shù)。在這種特殊情況下，可用符號a表示：

式中t’r,2為下一峰的調整保留時間，所以這時a總是大于1。3 色譜的名詞術語H)、分配比k,即容量因子：意義：色譜柱對組份保留能力的重要參數(shù)k與m的關系：4)、區(qū)域寬度色譜主峰的區(qū)域寬度是組份在色譜柱中譜帶擴張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動力學因素。度量色譜峰區(qū)域寬度通常有三種方法：A、標準差：0.607倍峰高處峰寬的一半。B、半峰寬Y1/2：峰高一半處對應的峰寬。它與的關系為C、基線寬度Y：色譜兩側拐點上的切線在基線上的截距。它與的關系是3 色譜的名詞術語色譜曲線反映出的重要信息：A、根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以斷樣品中所含組份的最少數(shù)；B、根據(jù)色譜峰的保留值(或位置)，可以進行定性分析；C、根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進行定量分析；D、依據(jù)色譜峰的保留值及其區(qū)域寬度，評價色譜柱分離效能；E、色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(和流動相)選擇是否合適的依據(jù)。4 色譜理論

兩組份完全分離必須滿足：A、兩組份的分配系數(shù)必須有差異；B、區(qū)域擴寬的速率應小于區(qū)域分離的速度；C、在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱。它不僅應說明組份在色譜柱中移動的速率，而且應說明組份在移動過程中引起區(qū)域擴寬的各種因素。塔板理論和速率理論均以色譜過程中分配系數(shù)恒定為前提，故稱為線性色譜理論。速率理論對色譜分離條件的選擇具有實際指導意義，因此本節(jié)將重點介紹

4.1 塔板理論

塔板模型:

將色譜柱視為精餾塔，即色譜柱是一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板高(platehigh)為H。假設在每一塊塔板上，溶質在兩相間很快達到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前轉移。對一長為L的色譜柱，溶質平衡的次數(shù)應為：

n稱為理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨塔板高H的增大而減小。n與半峰寬及峰底的關系式為:

式中tr(或Y1/2)應采取同一單位(時間或距離)。上式示：在tR一定時，如果色譜峰越窄，則說明n越大，H越小，柱效能越高。4.1 塔板理論在實際工作中，按上式計算出來的n和H值有時并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因為采用tR計算時，沒有扣除死時間tM，所以，常用有效塔板數(shù)n有效表示柱效：有效塔板高為：

例1

已知某組分峰的峰底寬為40S，保留時間為400S，計算此色譜柱的理論塔板數(shù)。例2

已知一根1米長的色譜柱的有效塔板數(shù)為1600塊，組份A在該柱上的調整保留時間為100秒，試求A峰的半峰寬及有效塔塔板高度。4.2 速率理論

1956年，荷蘭學者范姆特（vanDeemter）等人在研究氣液色譜時，提出了色譜過程的動力學理論——速率理論。他們吸收了塔板理論中塔板高的概念，并同時考慮影響塔板高的動力學因素，指出：填充柱的柱效受分子擴散、傳質阻力、載氣流等因素的控制，從而較好地解釋了影響塔板高的各種因素。 譜峰擴寬受三個動力學因素的控制，即渦流擴散，分子擴散項，傳質阻力項。這樣,上述塔板高方程表示 式中，A、B、C為常數(shù)，分別代表分子擴散項系數(shù)、渦流擴散項系數(shù)和傳質阻力項系數(shù)。由上式知，當一定，只有當A、B、C較小時，H才能小，柱效才會高。反之則柱效低，色譜峰擴張。4.3 色譜分離度

柱效n

衡量柱效的指標是n(或neff)，柱效則反映了色譜分離過程的動力學性質。選擇性 為洗脫峰相臨的兩種溶質的容量因子之比.分離度 圖是兩相鄰組份在不同色譜條件下的分離情況。a）中兩組份沒有完全分離。b）和c）中兩組份完全分離，前者的柱效雖不高，但選擇性好；后者的選擇性較差，但柱效高。由此可見，單獨用柱效或柱選擇性并不能真實地反映組份在色譜柱中的分離情況，所以，在色譜分析中，需要引入分離度(RS)這一概念。4.3 色譜分離度分離度也稱分辨度。它是指相鄰兩色譜保留值之差與兩峰底寬平均值之比，即一般來說，當Rs<1時，兩峰總有部分重疊；當Rs=1時，兩峰能明顯分離；Rs>1.5時，兩峰才能完全分離。當然，更大的Rs值，分度效果會更好，但會延長分析時間。利用上式，可以直接從色譜圖上計算分離度。但該式?jīng)]有體現(xiàn)影響分離度的諸因素。而下式清楚地指出了，分離度受柱效n、選擇性x和容量因子k三個參數(shù)的控制：意義4.3 色譜分離度意義：第一，增加塔板數(shù)，可以增加分離度，若通過增加柱長來增加塔板數(shù)，就會延長分析時間。所以，設法降低塔板高H，才是增大分離度的最好方法。第二，加大容量因子可以增加分離度，但是會延長分析時間，至造成譜帶檢測困難。一般來說，當k>10時，分離度的提高并不明顯；而當k<2時，洗脫時間會出現(xiàn)極小值。因此，在色譜分離中，通常將k控制在2——7之間。第三，選擇性參數(shù)的微小增大，都會使分離度得到較大的改善。當

>2時，即使在很短的時間內，組份也會完全分離。當

1時，要完成分離，必須增加柱長，延長分析時間。例如，為了達到同樣的分離度，當

=1.01時，所需的時間是

=1.1時的84倍。顯然，當

=1時，無論怎樣提高柱效，加大容量因子等，Rs均為零。在這種情況下，兩組份的分離是不可能的。4.4 定性分析

制備性色譜定性分析特異性檢測4.4 定性分析

分析性色譜定性分析1st

在色譜條件一定時，任何一種物質都有確定的保留時間。2nd 相對保留值2,1：.4.5 定量分析

定量依據(jù) 在一定色譜條件下，組份i的質量(mi)或其在流動相中的濃度，與檢測器響應訊號（峰面積Ai或峰高hi

）成正比： 式中fiA和fih是絕對校正因子。峰高測量峰面積測量1st

自動測量：2nd

手工測量：手工測量的有關計算峰面積公式為 對于對稱的峰，近似計算公式為 對于不對稱的峰的近似計算公式為 式中Y0.15和Y0.85

分別是峰高0.15和0.85處峰寬值.峰面積的大小不易受操作條件如柱溫、流動相的流速、進樣的速度等的影響，從這一點來看，峰面積更適于作為定量分析的參數(shù)。4.4 定性和定量分析

定量校正因子1st

絕對校正因子

組份峰面積和峰高的絕對校正因子分別為：

由此可見，絕對校正因子是指某組份通過檢測器的量與檢測器對該組份的響應信號之比。

存在問題： 很明顯，絕對校正因子受儀器及操作條件的影響很大，偶然誤差和系統(tǒng)誤差較多，故其應用受到限制。解決之道：相對校正因子4.4 定性和定量分析

2nd

相對校正因子 指組份i與基準組份s的絕對校正因子之比，即 式中fAis和fhis分別為組份的峰面積和峰高相對校正因子，fAs和fhs分別為基準組份s的峰面積和峰高絕對校正因子。 必須注意，相對校正因子因量綱(相當于同身寸尺)。 絕對校正因子很少使用，一般文獻上提到的是相對校正因子。 優(yōu)點：相對校正因子消除了偶然誤差和系統(tǒng)誤差較.3rd

相對響應值 也叫相對應答值，即相對靈敏度，當計量單位相同時，它們與相對校正因子互為倒數(shù)：4.6 定量方法

外標法1st

作標準曲線：

將欲測組份的純物質配制成不同濃度的標準溶液，使?jié)舛扰c待測組份相近，然后取固定量的上述溶液進行色譜分析，得到標準樣品的對應色譜圖，以峰高或峰面積對濃度作圖。這些數(shù)據(jù)應是一個通過原點的直線。2nd

定量分析 測定時，在完全相同的條件下，取制作標準曲線時同樣量的試樣分析，測得該試樣的響應訊號后，從標準曲線即可查出其百分含量。3rd

優(yōu)點 操作簡單，因而適于工廠控制分析和自動分析4th

存在問題 結果的準確度取決于進樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。4.6 定量方法

內標法1st

方法：

A、測定相對校正因子：已知樣品+一定量標準物，然后進行色譜分析。根據(jù)被測物和內標物在色譜圖上相應的峰面積(或峰高)測定相對校正因子。

B、測定樣品含量：未知樣品+一定量內標物/基準物.4.6 定量方法：

2nd

優(yōu)點

內標法是通過測量內標物及欲測組份的峰面積的相對值來進行計算的，因而可以在一定程度上消除操作條件等的變化所引起的誤差。3rd內標法的缺點： 在試樣中增加了一個內標物，這常常給分離造成一定的困難。4th內標法的條件

A、內標物必須是待測試樣中不存在的；

B、內標峰應與試樣中各組份的峰分開，并盡量接近欲分析的組份。5 應用:違禁藥物分析樣品準備1st100mghairwashedby0.3%Tween20aqeoussolution.2ndhairwascutintosmallfragmentsincubated12hin2ml0.25MHCl3rdtheincubationmixturewasneutralisedbyNaOH4thsolutionwasextractedintoorganicphaseof63%heptane+19%dichloro-methane+18%dichloro-ethane.5thevaporatedbyastreamofairandtheresidueresissolvedinasuitablesolvent.

2、按層析的分離機理分類

（1）排阻層析(exclusionchromatography)

利用凝膠層析介質(固定相)交聯(lián)度的不同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過。利用流動相中溶質的分子量大小差異而進行分離的一種方法，稱之為排阻層析。

（2）離子交換層析(ionexchangechromatography)

利用固定相球形介質表面活性基團經(jīng)化學鍵合方法，將具有交換能力的離子基團在固定相上面，這些離子基團可以與流動相中離子發(fā)生可逆性離子交換反應而進行分離的方法，稱之為離子交換層析。（3）吸附層析(absorptionchromatography)

利用吸附層析介質表面的活性分子或活性基團，對流動相中不同溶質產(chǎn)生吸附作用，利用其對不同溶質吸附能力的強弱而進行分離的一種方法，稱之為吸附層析。

（4）分配層析(partitionchromatography)

被分離組分在固定相和流動相中不斷發(fā)生吸附和解吸附的作用，在移動的過程中物質在兩相之間進行分配。利用被分