第五章分子發(fā)光0604

第五章分子發(fā)光分析法★分子發(fā)光分析法：根據(jù)分子發(fā)光現(xiàn)象建立起來的一類分析方法?！锓肿影l(fā)光光致發(fā)光熱致發(fā)光場致發(fā)光化學(xué)發(fā)光分子熒光分子磷光★本章討論分子熒光、分子磷光和化學(xué)發(fā)光分析法第一節(jié)熒光分析法一、概述★分子熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的分子熒光光譜進(jìn)行定性，以熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量的一種分析方法?！锶秉c(diǎn)：應(yīng)用不如吸光光度法廣泛?！飪?yōu)點(diǎn)比吸光光度法靈敏度高，檢測限低；比吸光光度法選擇性好。二、基本原理（一）分子熒光的產(chǎn)生

在一般溫度下，大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動能級。處于基態(tài)的分子吸收能量(電能、熱能、化學(xué)能或光能等)后被激發(fā)到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)是很不穩(wěn)定的，它得很快地釋放出能量又重新躍遷回基態(tài)。若分子返回基態(tài)時(shí)以發(fā)射的電磁輻射(即光)的形式釋放能量，就稱為“發(fā)光”。如果物質(zhì)的分子吸收了光能而被激發(fā)，躍遷回基態(tài)所發(fā)射的電磁輻射，稱為熒光和磷光?，F(xiàn)從分子結(jié)構(gòu)理論來討論熒光和磷光的產(chǎn)生機(jī)理。每個(gè)分子中都具有一系列嚴(yán)格分立相隔的能級，稱為電子能級，而每個(gè)電子能級中又包含有一系列的振動能級和轉(zhuǎn)動能級。1.分子能級★基態(tài)：分子的能量最低，最穩(wěn)定的能級(S0)★激發(fā)態(tài)：相對基態(tài)，能量較高的能級。能量從低到高依次叫作第一激發(fā)態(tài)(S1

、

T1)、第二激發(fā)態(tài)(S1

、

T1)…★熒光和磷光的產(chǎn)生只與成鍵電子的Ee的變化有關(guān)。分子中電子的運(yùn)動狀態(tài)除了電子所處的能級外，每個(gè)電子能級還包含有多重態(tài)，多重態(tài)的個(gè)數(shù)用M=2S+1計(jì)算，S為各電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和，其數(shù)值為0或1。2.分子中電子能級的多重態(tài)★單重態(tài)（S）：若分子中所有電子都是自旋配對的，則S=0,M=1該分子便處于單重態(tài)(或叫單重線)，用符號S表示?！锶貞B(tài)（T）：分子中具有兩個(gè)自旋不配對的電子，即S=1,M=3，分子處于激發(fā)的三重態(tài)，用符號T表示。

★在通常條件下，大多數(shù)有機(jī)分子處于基態(tài)。成鍵的兩個(gè)電子以自旋方向相反方式（保里不相容原理）占據(jù)成鍵分子軌道，即處于基態(tài)單重態(tài)；★根據(jù)洪特規(guī)則，平行自旋比成對自旋穩(wěn)定，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能量低；3.分子中電子能級的躍遷當(dāng)物質(zhì)受紫外-可見光照射時(shí)，基態(tài)分子選擇性吸收光能，使處于成鍵分子軌道中的兩個(gè)自旋方向相反的電子之一發(fā)生激發(fā)躍遷，進(jìn)入相應(yīng)的反鍵分子軌道而處于第一、第二電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2的不同振動能級上?！镫娮硬徽撥S遷到哪一個(gè)能級上，激發(fā)躍遷都是一步到位?！镉蒘0到T1躍遷須改變電子自旋方向，屬于禁阻躍遷。4.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷(1)振動弛豫：同一電子能級內(nèi)，分子以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時(shí)間10-12s。(2)內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級中,電子由高能級向低能級的無輻躍遷。內(nèi)部轉(zhuǎn)移的時(shí)間為10－11S～10－13S數(shù)量級。

振動弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移的速率比由高激發(fā)態(tài)直接發(fā)射光子的速率快得多，所以分子吸收輻射能后不管激發(fā)到哪一個(gè)激發(fā)單重態(tài)，都能通過振動弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移而躍遷到最低(第一)激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。(3)熒光發(fā)射：處于激發(fā)單重態(tài)的電子經(jīng)振動弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移后到達(dá)第一激發(fā)單重態(tài)(S1)的最低振動能級(v=0)后，以輻射的形式躍遷回基態(tài)(S0)的各振動能級，這個(gè)過程為熒光發(fā)射，發(fā)射的熒光波長為。

電于經(jīng)過振動弛豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)移的能量損失，因此熒光發(fā)射的能量比分子吸收的能量要小，熒光發(fā)射的波長比分子吸收的波長要長，即。第一發(fā)單重態(tài)最低振動能級的平均壽命得為10－9～10－4S，因此熒光壽命也在這一數(shù)量級。(4)系間跨躍

：不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷過程，它涉及到受激發(fā)電子自旋狀態(tài)的改變。這種躍遷是禁阻的(不符合光譜選擇)，但如果兩個(gè)能態(tài)的能層有較大重疊時(shí)，就有可能通過自旋一軌道偶合等作用實(shí)現(xiàn)這一躍遷。系間跨躍的速度很小，經(jīng)歷的時(shí)間較長。(5)磷光發(fā)射：激發(fā)態(tài)的電子經(jīng)系間跨躍后到達(dá)激發(fā)三重態(tài)，經(jīng)過迅速的振動弛豫而躍遷至第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級，然后以輻射形式躍遷回基態(tài)的各振動能級，這個(gè)過程為磷光發(fā)射。磷光發(fā)射的躍遷仍然是自旋禁阻的，所以發(fā)光速度很慢。磷光的壽命為10－4～100S。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持續(xù)一短時(shí)間。由于經(jīng)過系間跨躍及T1中振動弛豫丟失了一部分能量，所以磷光波長比熒光波長要長，即。

(6)外部轉(zhuǎn)移：激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互碰撞，并發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的過程稱為外部轉(zhuǎn)移。外部轉(zhuǎn)移能使熒光或磷光的強(qiáng)度減弱甚至消失，這種現(xiàn)象稱為猝滅或熄滅。（二）熒光效率及其影響因素1.熒光效率激發(fā)態(tài)分子的去激發(fā)包括兩種過程，即無輻射躍遷過程和輻射躍遷過程，輻射躍遷可發(fā)射熒光或磷光。而有多少比例的激發(fā)分子發(fā)射出熒光(或磷光)呢?？梢杂脽晒饬孔赢a(chǎn)率ΦF--有時(shí)也叫也叫熒光效率或熒光產(chǎn)率(或磷光量子產(chǎn)率φP)表示。φF定義為：熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射熒光的光量子數(shù)與所吸光的光量子數(shù)之比，即:許多吸光物質(zhì)并不能發(fā)射熒光，這是因?yàn)榧ぐl(fā)態(tài)分子的去激發(fā)過程中，除發(fā)射熒光(磷光)外，還有無輻射躍遷過程與之競爭。所以，熒光量子產(chǎn)率與各種去激發(fā)過程的速率常數(shù)有關(guān)。表14.4列出分子吸光及去激發(fā)的過程及速率常數(shù)。過程表示式一級反應(yīng)速率常數(shù)吸收（激發(fā)）

振動弛豫/內(nèi)部轉(zhuǎn)移

熒光發(fā)射

系間跨越

磷光發(fā)射

S1的碰撞猝滅（外轉(zhuǎn)移）

S0＋hva→S1（或S2）

S2

～～→S1，0

S1，0→S0＋hvf

S1‘～～→T1

T1，0→S0＋hvp

S1‘＋Q～～→S0＋Q＋熱量Ka

KIC

Kf

KISC

Kp

Ka[Q](準(zhǔn)一級)

表14.4激發(fā)及去激過程與速率常數(shù)因此，ΦF可以表示為:式中，ΣKi為無輻射躍遷各種過程的速率常數(shù)之和，即ΣKi

＝KIC＋KISC＋KQ[Q]。從上式可以看出，凡是能使Kf值升高而使其它Ki值它降低的因素，都可以提高量子產(chǎn)量，增強(qiáng)熒光。對于高熒光分子(如熒光素)來說，Φf接近于1，說明該分子的Kf較大，ΣKi相對于Kf不可忽略不計(jì)。一般熒光物質(zhì)Φf小于1，不發(fā)熒光的物質(zhì)Kf為0，Φf＝0。一般說來，Kf主要取決于化學(xué)結(jié)構(gòu)，Ki則主要取決于化學(xué)環(huán)境的因素，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。2.熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系(1)具有電子躍遷類型的結(jié)構(gòu)：

實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)能發(fā)熒光的化合物都是由或躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過振動弛豫等無輻射躍遷，再發(fā)生或躍遷而產(chǎn)生熒光。而其中光吸收時(shí)躍遷的摩爾吸光系數(shù)比躍遷的大102～103倍，躍遷的壽命(10－7～10－9)比躍遷的壽命(10－5～10－7)短，因此熒光發(fā)射的速常數(shù)Kf值較大，熒光發(fā)射的效率高。因此，躍遷發(fā)射熒光的強(qiáng)度大。此外，在躍遷過程中，通過系間跨躍從單重態(tài)躍遷至三重態(tài)的速率常數(shù)KISC小也有到于熒光的發(fā)射?？傊?，躍遷的類型是產(chǎn)生熒光的最主要躍遷類型。

發(fā)生熒光(或磷光)的物質(zhì)，其分子都含有雙鍵(π鍵)的結(jié)構(gòu)體系。共軛體系越大，電子的離域性越大，越容易被激發(fā)，熒光也就越容易發(fā)生，且熒光光譜向長波移動。大部分熒光物質(zhì)都具有芳環(huán)或雜環(huán)，芳環(huán)越大，其熒光(或磷光)峰越向長波移動，且熒光強(qiáng)度往往也較強(qiáng)。

(2)具有剛性平面結(jié)構(gòu)：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具有性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物分子都具有強(qiáng)烈的熒光，因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可減少分子的振動，使分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間的相互作用減少，即可減少能量處部轉(zhuǎn)移的損失，有利于熒光的發(fā)射。而且平面結(jié)構(gòu)可以增大分子的吸光截面，增五大摩爾吸光系數(shù)，增強(qiáng)熒光強(qiáng)度。金屬螯合物熒光。這一類螯合物中金屬離子的外電子層具有與惰性氣體相同的結(jié)構(gòu)，為抗磁性的離子，它與含有芳基的有機(jī)配位體形成螯合物時(shí)多數(shù)會發(fā)射較強(qiáng)的熒光。這是因?yàn)樵瓉淼呐湮惑w雖有吸收光構(gòu)型，但其最低激發(fā)單重態(tài)的S1是n，型，及缺乏剛性平面結(jié)構(gòu)，所以并不發(fā)熒光，而與金屬離子配合后，配位體變?yōu)樽畹图ぐl(fā)單重態(tài)的，型，且由于螯合物的形成，而具有則性平面結(jié)構(gòu)，因此能發(fā)射熒光。(3)取代基的影響★給電子取代基使熒光加強(qiáng)。屬于這類基團(tuán)的有－NH2，－NHR，－NR2，－OH，－OR，－CN等。由于這些基團(tuán)上的n電子云幾乎與芳環(huán)上的π電子軌道平行，因而實(shí)際上它們共享了共軛π電子，形成了p～π共軛，擴(kuò)大共軛體系。因此，這類化合物的熒光強(qiáng)度增大(比較表14.2中的苯、苯胺、苯酚、苯基氰)，考察這類取代基對熒光特性的影響時(shí)必需注意，這類基團(tuán)中的n電子容易與極性溶劑作用轉(zhuǎn)化為共鹽(共軛堿或共軛酸)，如酚在NaOH中，－OH轉(zhuǎn)化為－O－，苯胺在酸中，－NH2轉(zhuǎn)化為－NH3＋，它們的熒光均大為減弱。表14.2部分取代基對苯的熒光特性的影響情況表化合物分子式熒光波長熒光的相對強(qiáng)度苯C6H6270－31010甲苯C6H5CH3270－32017丙基苯C6H5C3H7270－32017氟代苯C6H5F270－32010氯代苯C6H5Cl275－3457溴代苯C6H5Br290－3805碘代苯C6H5I－0苯酚C6H5OH285－36518酚離子C6H5O－310－40010甲苯醚C6H5OCH3285－34520苯胺C6H5NH2310－40520苯胺離子C6H5NH3＋－0苯甲酸C6H5COOH310－3903苯基氟C6H5CN230－36020硝基苯C6H5NO2－0★吸電子基團(tuán)使熒光減弱而磷光增強(qiáng)。屬于這類基團(tuán)的有如羰基(－COOH，－CHO，)，硝基(－NO2)及重氮基等。這類基團(tuán)都會發(fā)生躍遷，屬于禁阻躍遷，所以摩爾吸光系數(shù)小，熒光發(fā)射也弱，而的系間跨躍較為強(qiáng)烈，同樣使熒光減弱，相應(yīng)磷光增強(qiáng)。例如二苯甲酮其的系間跨躍產(chǎn)率接近1，它在非酸性介質(zhì)中的磷光很強(qiáng)。和給電子基團(tuán)一樣，吸電子基團(tuán)也都存在n電子，所以對極性溶劑及酸，堿介質(zhì)都較為敏感?！镏卦有?yīng)使熒光減弱而磷光增強(qiáng)。熒光體取代上重原子后，熒光減弱，而磷光往往相應(yīng)增強(qiáng)。所謂重原子取代，一般指的是鹵素(Cl、Br和I)原子取代，芳烴取代，芳烴取代上鹵素原子這后，其熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量增加而減弱，而磷光通常相應(yīng)地增強(qiáng)，這種效應(yīng)稱為“重原子效應(yīng)”。這種效應(yīng)被解釋為，由于重原子中，能級之間的交叉現(xiàn)象比較嚴(yán)重，使得熒光體中的電子自旋一軌道偶合作用加強(qiáng)，系間跨躍顯著增加，結(jié)果導(dǎo)致熒強(qiáng)度減弱，磷光強(qiáng)度增強(qiáng)。表14.3鹵代萘的熒光及磷光光譜的情況化合物*φp

/φF熒光波長磷光波長（nm）萘0.0933154701－甲基萘0.0533184761－氟萘0.0683164731－氯萘5.23194831－溴萘6.43204841－碘萘>1000沒觀察到4883.環(huán)境因素對熒光的影響影響熒光強(qiáng)度的因素除了熒光物質(zhì)的本身結(jié)構(gòu)及其濃度以外，環(huán)境也是一個(gè)很重要的因素，主要的溶劑、溫度、介質(zhì)酸度、氫鍵的形成及其它的因素。(1)溶劑的影響。同一種熒光體系在不同的溶液中，其熒光光譜和熒光強(qiáng)度都可能會有顯著的差別。對于熒光發(fā)射的主要電子躍遷類型躍遷來說，電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，所以隨著溶劑極性的增大，對激發(fā)態(tài)比對基態(tài)產(chǎn)生更大的穩(wěn)定作用，因此降低了躍遷的能量，熒光光譜發(fā)生紅移，而且熒光增強(qiáng)。

表14.58-巰基喹啉在不同溶劑中熒光特性溶劑介電常數(shù)熒光發(fā)射峰λ/nm熒光量子產(chǎn)率ΦF四氯化碳

氯仿

丙酮

乙氰2.24

5.2

21.5

38.8390

398

405

4100.002

0.041

0.055

0.064溫度對于溶液的熒光強(qiáng)度有著顯著的影響。通常，隨著溫度的增高，熒光物質(zhì)溶液的熒光量子產(chǎn)率及熒光強(qiáng)度將降低，圖14.7為不同溫度下鄰菲羅啉的熒光光譜。一般認(rèn)為輻射過程速度不隨溫度變化，因此，熒光量產(chǎn)率的變化反映了非輻射躍遷過程速率的變化。隨著溶液溫度的升高，介質(zhì)粘度減小，分子運(yùn)動速度變大，從而使熒光分子與溶劑分子或其它分了的碰撞機(jī)率增加，使內(nèi)、外能量轉(zhuǎn)換速率加快，熒光效率降低。(2)溫度的影響。帶有酸性基團(tuán)或堿性基團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物，其熒光特性都與溶液的酸度(pH)有關(guān)。這是因?yàn)樵诓煌岫冉橘|(zhì)條件下，熒光體的存在型體不同，不同的型體(分子與其離子)在電子構(gòu)型上有所不同，而且基態(tài)和激發(fā)態(tài)所表現(xiàn)出來的酸，堿性也有所差別。因此不同酸度下，熒光光譜和熒光強(qiáng)度都可能發(fā)生變化。所以在熒光分析中一般都要較嚴(yán)格地控制溶液的pH值。下列為兩個(gè)實(shí)例:(3)介質(zhì)酸度的影響(4)表面活性劑的影響表面活性劑的存在對熒光光譜及強(qiáng)度都有會產(chǎn)生影響。熒光體在由表面活性劑形成膠束的微環(huán)境中，不僅可以減少非輻射去激化過程和猝滅過程的速度，提高熒光量子產(chǎn)率，而且由于表面活性劑參與組成更高次和配合物而增大配合物分子的有效吸光截面積，導(dǎo)致摩爾吸光系數(shù)的增大因此，在膠束溶液中，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，測定的靈敏度提高。多元配合物的形成通常也可以增強(qiáng)熒光強(qiáng)度，提高熒光測定的靈敏度。(5)溶解氧的影響溶解氧的存在會使熒光效率降低。為何？原因比較復(fù)雜，還沒有一個(gè)完整的確定說法，可能包含著多種機(jī)理。有的認(rèn)為氧和其它須磁性的物質(zhì)一樣，它們之所以會使熒光猝滅，是由于它們能夠促進(jìn)激發(fā)單重態(tài)的熒光分子的系間跨躍()。（三）熒光效率與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量(光強(qiáng))Ia及熒光量子產(chǎn)率Φf：If=IaΦf

吸收的光量(光強(qiáng))Ia應(yīng)為入射光的光強(qiáng)的光強(qiáng)I0與透射光的光強(qiáng)It

之差，即：Ia＝I0－It

根據(jù)吸收定律(朗伯-比耳定律)：所以:式中，ε為摩爾吸光系數(shù)，b為樣品溶液的光程(即液池的厚度)，c為樣品的摩爾濃度。

而的展開式為:當(dāng)濃度C很稀，吸光度A＜0.05時(shí)，則展開式的高次項(xiàng)可忽略，即:所以：當(dāng)I0及b一定時(shí):If＝Kc熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，這是熒光分析法定量分析的依據(jù)。但是，應(yīng)該注意的是，此式只適合于熒光物質(zhì)的稀溶液。當(dāng)c較大，吸光度A＜0.05時(shí)，線性關(guān)系將受到破壞。當(dāng)c較大，吸光度A＞0.05時(shí)，線性關(guān)系將受到破壞。原因：(1)由省略高次項(xiàng)引起；(2)由熒光猝滅效應(yīng)引起。熒光的猝滅：指的是熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子之間的相互作用，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。與熒光物質(zhì)發(fā)生相互作用而使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)，稱為猝滅劑。熒光猝滅的形式很多，機(jī)理也比較復(fù)雜。主要有為下幾種類型:何為熒光猝滅效應(yīng)？碰撞猝滅：

碰撞猝滅是熒光猝滅的主要類型之一。它指的是處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞，釋放熱量給環(huán)境以無輻射的形式躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生猝滅作用(這種猝滅也稱動態(tài)猝滅)。碰撞猝滅效應(yīng)隨溫度的升高而增強(qiáng)，而隨粘度的增大而降低。2.生成化合物的猝滅

生成化合物的猝滅也稱為靜態(tài)猝滅，它指的是基態(tài)的熒光物質(zhì)與猝滅劑反應(yīng)生成非熒光的化合物，導(dǎo)致熒光的猝滅，可用下式表示:

從上式也容易推導(dǎo)出熒光強(qiáng)度與猝滅劑平衡濃度之間的關(guān)系

式中(If)0及(If)q分別為加入猝滅劑Q之前及之后的熒光強(qiáng)度，CM為熒光物質(zhì)的總濃度。利用上面的關(guān)系式可以用于熒光猝滅法的定量分析。3.能量轉(zhuǎn)移猝滅

當(dāng)猝滅劑吸收光譜與熒光體的熒光光譜有重疊時(shí)，處于激發(fā)單重態(tài)的熒光體激發(fā)分子的能量就可能轉(zhuǎn)移到猝滅劑分子上或者猝滅劑吸收了熒光體發(fā)射的熒光，使熒光猝滅，而猝滅劑被激發(fā)，這是俗稱“內(nèi)濾作用”。4.氧的猝滅

氧的存在會使熒光效率降低5.轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅

在“重原子效應(yīng)”段落已經(jīng)敘述，溴化物和碘化物都能產(chǎn)生“重原子效應(yīng)”，促使熒光分子的激發(fā)單重態(tài)轉(zhuǎn)入激發(fā)三重態(tài)，導(dǎo)致熒光的猝滅。上面也已提及，氧的猝滅作用也可能是O2促使熒光體分子轉(zhuǎn)入激發(fā)三重態(tài)所致。6.熒光物質(zhì)的自猝滅

當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較大時(shí)，會使熒光強(qiáng)度降低，熒光強(qiáng)度與濃度不成線性關(guān)系，稱為熒光物質(zhì)的自猝滅。自猝滅可能有如下幾個(gè)原因：★熒光物質(zhì)分子之間的碰撞能量損失，這實(shí)際上是能量的外部轉(zhuǎn)移形式；★熒光物質(zhì)的自吸收，當(dāng)熒光物質(zhì)的吸收光譜與熒光發(fā)射光譜重疊時(shí)，會發(fā)生自吸收現(xiàn)象，處于S1激發(fā)態(tài)的分子發(fā)射的熒光被處于基態(tài)的分子所吸收，使熒光強(qiáng)度降低；★熒光物質(zhì)分子的締合。某些熒光體分子處于基態(tài)時(shí)會形成二聚體或多聚體，或者激發(fā)態(tài)分子

與基態(tài)分子M形成激發(fā)態(tài)二聚體(M*M)。這些聚合物與熒光單體一般都會具有不同的熒光特性，有的使熒光強(qiáng)度降低甚至不發(fā)射熒光，有的使光譜發(fā)生變化。（四）熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光和磷光均屬于光致發(fā)光，所以都涉用到兩種輻射，即激發(fā)光(吸收)和發(fā)射光，因而也都具有兩種特征光譜，即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。它們是熒光和磷光定性和定量分析的基本參數(shù)及依據(jù)。1.激發(fā)光譜

通過測量熒光(或磷光)體的發(fā)光強(qiáng)度)隨激發(fā)光波長的變化而獲得的光譜，稱為激發(fā)光譜。激發(fā)光譜的具體測繪方法是，通過掃描激發(fā)單色器，使不同波長的入射光照射激發(fā)熒光(磷光)體，發(fā)出的熒光(磷光)通過固定波長的發(fā)射單色器而照射到檢測器上，檢測其熒光(磷光)強(qiáng)度，最后通過記錄儀記錄光強(qiáng)度對激發(fā)光波長的關(guān)系曲線，即為激發(fā)光譜。通過激發(fā)光譜，選擇最佳激發(fā)波長——發(fā)射熒光(磷光)強(qiáng)度最大的激發(fā)光波長，常用λex表示。萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜2.發(fā)射光譜通過測量熒光(或磷光)體的發(fā)光強(qiáng)度隨發(fā)射光波長的變化而獲得的光譜，稱為發(fā)射光譜。其測繪方法，是固定激光發(fā)光的波長，掃描發(fā)射的光的波長，記錄發(fā)射光強(qiáng)度對發(fā)射光波長的關(guān)系曲線，即為發(fā)射光譜。通過發(fā)射光譜選擇最佳的發(fā)射波長——發(fā)射熒光(磷光)強(qiáng)度最大的發(fā)射波長，常用λem表示，磷光發(fā)射波長比熒光來得長，萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜（一）熒光儀器的基本構(gòu)成：

測量熒光的儀器主要由五個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器和信號顯示記錄器?！锾厥恻c(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測器通常成直角。三、熒光分析儀器1.激發(fā)光源●高壓汞燈：高壓汞燈是以汞蒸氣放電發(fā)光的光源，主要有365、405、436nm的三條譜線，尤以365nm譜線最強(qiáng)，一般濾光片式的熒光計(jì)多采用它為激發(fā)光源。激發(fā)光源應(yīng)具有足夠的發(fā)光強(qiáng)度、適用波長范圍寬，穩(wěn)定等特點(diǎn)。常用的光源有高壓汞燈和氙弧燈?！?/p>

氙弧燈：氙弧燈通常就叫氙燈，是目前熒光分光分度計(jì)中應(yīng)用最廣泛的一種光源。它是一種短弧氣體放電燈，外套為石英，內(nèi)充氙氣，常溫時(shí)其壓力為5atm，工作時(shí)壓力為20atm，具有光強(qiáng)度大，在200～800nm范圍內(nèi)是連續(xù)光源的特點(diǎn)。氙燈的燈內(nèi)氣壓高，啟動時(shí)的電壓高（20～40KV），因此使用時(shí)一定要注意安全?！窨烧{(diào)諧染料激光器：是一種新型的熒光激發(fā)光源。這種光源不需單色器和濾光片，具有單色性特，強(qiáng)度大，等優(yōu)點(diǎn)。但是儀器設(shè)復(fù)雜，所以應(yīng)用還不廣泛。2.單色器

熒光分析儀中應(yīng)用最多的單色器為光柵單色器，稱為熒光分光光度計(jì)。光柵有兩塊，第一塊為激發(fā)單色器，用于選擇激發(fā)光的波長，第二塊為發(fā)射單色器，用于選擇熒光發(fā)射波長。在比較低檔次的熒光計(jì)中，采用濾光片作為單色器3.樣品池

熒光分析的樣品池通常用石英材料做成，它與吸光分析法的液池不同在于，熒光樣品池的四面均為磨光透明面，同時(shí)一般僅有厚度為1cm的池。4.檢測器

簡易型的熒光計(jì)可用目視檢測，或用硒光電池，光電管檢測?，F(xiàn)在的熒光計(jì)多采用光電倍增管進(jìn)行檢測。檢測器的方向應(yīng)與激發(fā)光的方向成直角，以消除樣品池中透射光和雜散光的于擾。（二）熒光分析法的靈敏度與紫外可見分光光度法比較，熒光分析法的靈敏度要高出2～4個(gè)數(shù)量級。為何？1.從方法原理上看根據(jù)，熒光物質(zhì)的濃度與熒光強(qiáng)度成正比，熒光強(qiáng)度正比于入射光的強(qiáng)度。所以增大光源的強(qiáng)度可以提高靈敏度，降低檢測限；而在紫外—可見光光度法中，

，吸光物質(zhì)濃度與入射光和透射光比的對數(shù)值成正比，即吸光度。不論是增加入射光強(qiáng)度，還是提高檢測器靈敏度，都不會引起吸光度的變化。

A=Kbc=lgI0It2.從儀器裝置上看

（1）根據(jù)，熒光法可采用強(qiáng)光源和高靈敏度檢測器提高方法的靈敏度。（2）熒光的測量是在激發(fā)光的垂直方向檢測的，即在暗背景中檢測，所以只要較好地消除雜散光，采用較靈敏的檢測器，很微弱的熒光都可以檢測，所以檢測限較低；而吸光分析法是在亮背景下檢測透射光與入射光強(qiáng)度的比值，所以當(dāng)強(qiáng)度較小時(shí)，透射光與入射光強(qiáng)度相差很小，因此不能準(zhǔn)確的檢測，所以檢測限較高。

與紫外可見分光光度法比較，熒光分析法的靈敏度要高出2～4個(gè)數(shù)量級。為何？四、熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法目前還主要用于無機(jī)物和有機(jī)物的定量分析，但隨著其研究的深入，在定性分析、結(jié)構(gòu)分析及作為某些研究領(lǐng)域的手段也日漸增多，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。

熒光定量分析的方法主要有校正曲線法，依據(jù)熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成正比的關(guān)系，首先繪制校正曲線，再進(jìn)行未知的分析；其次還有比較法，在同樣條件下，測定試樣溶液和一標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，直接通過比例計(jì)算求得試樣中熒光物質(zhì)的含量。（一）無機(jī)化合物的分析1.直接熒光法

直接能應(yīng)用無機(jī)化合物自身的熒光進(jìn)行測定的為數(shù)不多，無機(jī)化合物的熒光測定主要依賴于待測元素與有機(jī)試劑所組成的能發(fā)熒光的配合物，通過檢測配合物的熒光強(qiáng)度以測定該元素的含量。這種方法稱為直接熒光法。某些元素雖不與有機(jī)試劑組成會發(fā)光的配合物，但它們可以從其他會會發(fā)熒光的金屬離子--有機(jī)試劑配合物中取代金屬離子或有機(jī)試劑，組成更穩(wěn)定的不發(fā)熒光配合物或難溶化合物，而導(dǎo)致溶液熒光強(qiáng)度的降低，由熒光強(qiáng)度降低的強(qiáng)度來測定該元素的含量，這種方法稱為熒光猝滅法。有些情況下，金屬離子與能發(fā)熒光配位體反應(yīng)，生成不發(fā)熒光的配位體，導(dǎo)致熒光配位體的熒光猝滅，同樣可以測定金屬離子的含量，這也屬于熒光猝滅法。

2.熒光猝滅法（一）有機(jī)化合物的分析脂肪族化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡單，會發(fā)熒光的為數(shù)不多。但也有許多脂肪族化合物與某些有機(jī)試劑反應(yīng)后的產(chǎn)物具有熒光性質(zhì)，可用于它們的測定。芳香族化合物具有共軛的不飽和結(jié)構(gòu)，多能發(fā)射熒光，可以直接進(jìn)行熒光測定。有時(shí)為了提高測定方法的靈敏度和選擇性，常使某些弱熒光的芳香族化合物與某些有機(jī)試劑反應(yīng)生成強(qiáng)熒光的產(chǎn)物進(jìn)行測定。例如降腎上腺素經(jīng)與甲醛縮合而得到強(qiáng)熒光產(chǎn)物，然后采用熒光顯微法可以檢測組織切片中含量低至10－17g的降腎上腺素。

在生理科學(xué)研究工作及醫(yī)療工作中，所遇到的分析對象常常是分子龐大而結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機(jī)化合物，如維生素、氨基酸和蛋白質(zhì)、胺類和甾族化合物、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等，這些復(fù)雜化合物許多均能發(fā)射熒光，可以用熒光分析法進(jìn)行測定或研究其結(jié)構(gòu)或生理作用機(jī)理。在現(xiàn)代的分離技術(shù)中，以熒光法作為檢測手段，?？梢詼y定這些物質(zhì)的低微含量，熒光免疫分析法也是醫(yī)學(xué)研究的一種重要手段。第二節(jié)磷光分析法（一）提高磷光分析靈敏度的途徑磷光的發(fā)射過程必須先由激發(fā)單重態(tài)經(jīng)系間跨越至激發(fā)三重態(tài)（）的無輻射過程，然后再從激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級經(jīng)過禁阻躍遷至基態(tài)的輻射躍遷過程，這在動力學(xué)上是處于不利的情況。經(jīng)歷的時(shí)間較長，容易受到外部轉(zhuǎn)移的干擾而使磷光強(qiáng)度減弱，甚至完全消失。因此，為了獲得較強(qiáng)的磷光，提高磷光測定的靈敏度，擴(kuò)大磷光分析的測定范圍，宜采用下列一些措施。1.增加試樣的剛性增加試樣的剛性可以減少質(zhì)點(diǎn)間的碰撞幾率，從而減少無輻射躍遷的光活化過程，從而提高磷光發(fā)射的幾率，提高磷光強(qiáng)度。低溫磷光就是基于這一原理而建立起來的。在低溫磷光分析中，液氮是最常用的合適的冷卻劑。在液氮溫度（77℃）下，所使用的溶劑具有足夠的粘度并能形成透明的剛性玻璃體，從而有效地降低質(zhì)點(diǎn)碰撞的能量外部轉(zhuǎn)移，提高磷光強(qiáng)度。2.固體基質(zhì)磷光法這種方法是基于測量吸附于固體基質(zhì)（載體）上的有機(jī)物質(zhì)所發(fā)射的磷光而進(jìn)行分析的。由于它有效地阻止了質(zhì)點(diǎn)的碰撞，它們可以進(jìn)行室溫磷光測定。理想的載體應(yīng)是既能將分析物質(zhì)牢固地吸附在表面或基體中，減少三重態(tài)碰撞猝滅等非輻射光活化過程，增強(qiáng)磷光強(qiáng)度，本身又不產(chǎn)生熒光背景。較常用的載體是濾紙和纖維素色層紙。3.膠束增穩(wěn)磷光法當(dāng)溶液中的表面活性劑濃度到達(dá)臨界膠束濃度后，便聚集成膠束。磷光體進(jìn)入膠束時(shí)，改變了磷光體的微環(huán)境及定向的約束力，從而強(qiáng)烈地影響磷光體的物理性質(zhì)，增強(qiáng)了其剛性，減少碰撞的能量損失，增強(qiáng)了激發(fā)三重態(tài)的穩(wěn)定性，增強(qiáng)了磷光強(qiáng)度，從而也可以實(shí)現(xiàn)室溫磷光測定。例如，在含有表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）的溶液中，摻入重原子離子Tl（Ⅰ）或Pb（Ⅱ），可觀察到萘、芘和聯(lián)苯的強(qiáng)烈室溫磷光。4.重原子效應(yīng)在含有重原子的溶劑如碘乙烷或溴乙烷中，有利于系間跨越，使磷光增強(qiáng)。除了使用含有重原子的溶劑外，還可以采用Ag鹽Pb鹽或Tl鹽等重金屬原子鹽類。（二）磷光分析儀器

磷光分析儀器與磷光分析儀器同樣由五個(gè)基本部件組成，但需要有一些特殊的配件，在比較好的熒光分析儀器上都配有磷光分析的配件，因此兩種方法可以用同一儀器。1.樣品池需配有冷卻裝置

對于溶液磷光的測定，常采用低溫磷光分析法，即試樣溶液需要低溫冷凍。通常把試液裝入內(nèi)徑約1-3mm的石英細(xì)管（液池）中，然后將液池插入盛有液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，激發(fā)光通過杜瓦瓶的沒有鍍銀的部位照射到試樣上，所產(chǎn)生的磷光經(jīng)由直角方向上的類似部位投射到發(fā)射單色器后加以檢測。2.磷光鏡有些物質(zhì)會同時(shí)發(fā)射熒光和磷光，因此在測定磷光時(shí)，必須把熒光分離去。為此目的，可利用磷光壽命比熒光長的特點(diǎn)，在激發(fā)單色器和液池之間及在發(fā)射單色器和液池之間各裝上一個(gè)斬波片，并且由一個(gè)同步馬達(dá)帶動。這種裝置稱為磷光鏡，它有轉(zhuǎn)角式（以圖14.12a）和轉(zhuǎn)盤式（如圖14.12b）兩種類型，尤以后者更為通用。（三）磷光分析法的應(yīng)用磷光分析法主要用于有機(jī)化合物的測定，如稠環(huán)芳烴和石油產(chǎn)品的分析，農(nóng)藥、生物堿和植物生長激素的分析，藥物和臨床分析等。此外磷光分析技術(shù)也已應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的化驗(yàn)及細(xì)胞生物學(xué)