第三章酶的分離純化

2023/2/3第三章酶的分離純化第四章酶的分離純化及產(chǎn)品成型重點（2）酶的分離純化：沉淀、離心、膜過濾、層析分離、電泳分離（4）酶純化過程的純度監(jiān)測本章知識點：（1）細(xì)胞的破碎、酶的提?。?）酶液的濃縮、結(jié)晶、干燥、成型一、生物下游加工技術(shù)下游加工過程包括目標(biāo)產(chǎn)物的提取、濃縮、純化及成品化等過程。

大多數(shù)酶的回收純化過程成本約占70%；

醫(yī)用酶的生產(chǎn)回收過程的成本高達85%；

基因工程表達產(chǎn)物的回收純化過程成本一般占85-90%以上；

青霉素回收過程成本約占50%；

乙醇的回收過程成本僅占14%。二、分離純化的一般流程發(fā)酵液細(xì)胞分離（離心、過濾）

細(xì)胞清液細(xì)胞破碎碎片分離粗分離純化成品化線路2線路1（胞內(nèi)酶）（胞外酶）預(yù)處理發(fā)酵液預(yù)處理細(xì)胞分離細(xì)胞破碎細(xì)胞碎片分離初步分離純化成品加工（胞外酶）

人干擾素是一種重要蛋白類生物藥品，具有抗癌和治療肝炎等作用。Yonehara等人：醋酸鋅鹽析離子交換層析硫酸銨鹽析銅螯合層析疏水層析凝膠電泳staehelin等人：硫酸銨鹽析免疫親和層析陽離子交換層析（83.0%）（62.7%）（96.2%）（46.0%）（78.3%）（88.9%）共六步，總收率僅為16%僅三步，總收率達81.0%首先，應(yīng)對被純化的酶的理化性質(zhì)有一個比較全面的了解;其次，判斷采用的方法和條件是否得當(dāng)，始終以活力回收率和純化倍數(shù)為指標(biāo)；再者，在純化工作中，往往不宜重復(fù)采用相同的步驟和條件；最后，要嚴(yán)格控制操作條件。在實踐工作中選擇方法時:酶分離純化方法離心分離、凝膠過濾、膜分離鹽析沉淀、有機溶劑沉淀、共沉淀、等電點沉淀離子交換層析、電泳分離、等電聚焦選擇性熱變性法、選擇性酸堿變性法、選擇性表面變性法親和層析、免疫電泳、免疫沉淀分離依據(jù)的性質(zhì)分離方法分大小、輕重溶解度大小穩(wěn)定性差異電荷性質(zhì)親和作用二、細(xì)胞破碎—只對胞內(nèi)酶（1）機械破碎法（2）物理破碎法（3）化學(xué)破碎法（4）酶促破碎法超聲波細(xì)胞破碎機細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機電動玻璃勻漿機利用機械力的攪拌，剪切或研碎細(xì)胞。組織搗碎機，細(xì)胞研磨器，勻漿器等。（一）機械破碎法1.搗碎法利用搗碎機的高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。10000r/min此法在實驗室和生產(chǎn)規(guī)模均可采用。2.研磨法利用研缽、石磨、球磨(不銹鋼或玻璃珠直徑0.2-1.0mm)、細(xì)菌磨等研磨器械所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎，必要時可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化鋁等作為助磨劑。此法效率較低3.勻漿法利用勻漿器所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。勻漿器一般由硬質(zhì)磨砂玻璃制成，也可由硬質(zhì)塑料可不銹鋼等制成。通常用來破碎那些易于分散，比較柔軟，顆粒細(xì)小的組織細(xì)胞。此法細(xì)胞破碎程度較高，對酶的破壞也較少，但難于在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。高壓勻漿器細(xì)胞懸浮液加工后的細(xì)胞勻漿閥座碰撞環(huán)閥杠珠磨機通過溫度，壓力，聲波等各種物理因素的作用，將組織細(xì)胞破碎的方法。凍融法、壓差法、超聲波法。（二）物理破碎法通過溫度的突然變化使細(xì)胞破碎。例如將冷凍的細(xì)胞突然放進較高溫度的水中，或?qū)⑤^高溫度中的細(xì)胞突然冷凍都可使細(xì)胞破壞。此法對較脆弱的細(xì)胞效果較好。但難以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。通過壓力的變化使細(xì)胞破碎。常用的有高壓沖擊、突然降壓和滲透壓差法等。（1）高壓沖擊法是在結(jié)實的容器中裝入菌體細(xì)胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或沖擊錘加高壓沖擊之，使細(xì)胞破碎。沖擊壓力可達每平方厘米幾百至幾千kg。壓力差破碎法（2）突然降壓法是將菌體裝進高壓容器中，加壓至30MPa以上，打開出口閥，使菌體懸浮液經(jīng)閥門流出，出口處壓力突然降為常壓，由于膨脹而使細(xì)胞破碎。突然降壓法的另一種形式為爆破性減壓法是將菌體懸浮在高壓容器中，用氮氣或二氧化碳加壓到幾十至幾百大氣壓，振蕩幾分鐘，使氣體擴散到細(xì)胞內(nèi)，然后突然排出氣體，壓力驟降，使細(xì)胞破碎。壓力差破碎法（3）滲透壓差法是利用滲透壓的變化而使細(xì)胞破碎。應(yīng)用時先將對數(shù)生長期的細(xì)胞從培養(yǎng)液中分離出來，再懸浮在20%左右的蔗糖溶液中平衡一段時間，然后離心收集細(xì)胞，迅速投入4℃左右的蒸餾水或低滲溶液中。由于細(xì)胞外滲透壓突然降低，而使細(xì)胞破碎，將細(xì)胞中的酶等物質(zhì)釋出胞外。此法適用于膜結(jié)合的酶、細(xì)胞間質(zhì)酶等的提取。可用于從海洋微生物中提取某些酶。但對G+菌不適用。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎的方法。有機溶劑：如甲苯，丙酮，丁醇，氯仿等。

非離子型表面活性劑：吐溫、催通等。（三）化學(xué)破碎法（1）有機溶劑處理有機溶劑可使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。常用的有機溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。（2）表面活性劑處理表面活性劑可以和細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過性。在酶的提取方面一般采用非離子型的Triton、Tween等表面活性劑。表面活性劑處理對膜結(jié)合酶的提取特別有效，在實驗室和生產(chǎn)中均已成功使用。微生物種類酶細(xì)菌酵母霉菌植物細(xì)胞（四）酶促破碎法（1）自溶法（自身酶）（2）酶處理（外加酶）溶菌酶β-葡聚糖酶幾丁質(zhì)酶纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶機械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機溶劑表面活性劑酶促破碎自溶法外加酶法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞細(xì)胞破碎方法及其原理三、酶的提取

指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┲械倪^程，又稱抽提。原料溶劑酶（一）提取方法

四?。合←}、稀酸、稀堿、稀有機溶劑，水。提取方法提取對象

稀鹽溶液

稀酸溶液

稀堿溶液

稀有機溶劑在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶在稀酸溶液中溶解度大且穩(wěn)定的酶在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定的酶與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含較多非極性基團的酶（二）提取過程中的注意事項不超出酶的酸堿穩(wěn)定范圍；最好遠離待提取酶的等電點。0~10℃左右，尤其是采用有機溶劑提取時。3、提取液體積（用量）：

為含酶原料體積的2~5倍。可一次抽提，也可分幾次反復(fù)抽提。提高酶的穩(wěn)定性。1、pH值：2、溫度：4、加保護劑：第二節(jié)酶的沉淀分離、離心和膜過濾技術(shù)鹽析沉淀法√有機溶劑沉淀法等電點沉淀法聚乙二醇沉淀法復(fù)合物沉淀法一、沉淀分離法（一）鹽析沉淀法常用中性鹽：（NH4）2SO4

優(yōu)點：①溶解度大，溫度系數(shù)小；②價廉易得；③可保護酶。在鹽濃度達到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。

在一定的溫度和pH值條件下（β為常數(shù)），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為Ks分段鹽析；而在一定的鹽和離子強度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為β分段鹽析。由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。2、為了得到較好的鹽析效果，應(yīng)控制下列因素：（1）不同酶，鹽析時所需的鹽濃度各不相同。（2）加鹽操作時，防止局部鹽濃度過高，防止產(chǎn)生泡沫。（3）pH值和溫度：等電點附近，室溫或低溫操作。（5）脫鹽：超濾、透析或?qū)游?。?）蛋白質(zhì)濃度：一般控制在2.5~3.0%為宜。（二）有機溶劑沉淀法1、作用原理

①去水膜；②降低介電常數(shù)；③破壞氫鍵。2、操作注意

低沸點，易燃易爆；低溫操作，沉淀析出后要盡快分離。（三）等電點沉淀1、原理2、實際操作

與其他方法一起使用（鹽析、有機溶劑沉淀、復(fù)合沉淀）。單獨使用時，主要是用于從粗酶液中除去某些等電點相距較大的雜蛋白。3、注意加酸堿調(diào)節(jié)pH值時，防止局部酸堿過高。（四）選擇性變性沉淀法1、熱變性法：根據(jù)目的酶與雜蛋白熱穩(wěn)定性差異，可以在較高溫度下，使雜蛋白變性沉淀，而酶則保持可溶狀態(tài)。2、酸堿變性法：目的酶與雜蛋白的酸堿穩(wěn)定性不同，可以調(diào)整pH使雜蛋白變性沉淀。

選擇一定的條件使酶液中存在的某些蛋白質(zhì)等雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶。二、膜分離技術(shù)在酶分離純化中的應(yīng)用

借助于一定孔徑的半透膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M行分離的技術(shù)。二、膜分離技術(shù)在酶分離純化中的應(yīng)用

膜分離技術(shù)已被國際上公認(rèn)為20世紀(jì)末至21世紀(jì)中期最有發(fā)展前途，甚至?xí)?dǎo)致一次工業(yè)革命的重大生產(chǎn)技術(shù)，所以可以稱為前沿技術(shù)，是世界各國研究的熱點。廣泛應(yīng)用于生物工程、化學(xué)、制藥、飲料、電力、冶金、海水淡化、資源再生等領(lǐng)域。滲出液膜分離技術(shù)的地位和影響美國官方文件曾說“18世紀(jì)電器改變了整個工業(yè)進程，而20世紀(jì)膜技術(shù)將改變整個面貌”，“目前沒有一種技術(shù)，能像膜技術(shù)這么廣泛地被應(yīng)用”日本和歐洲則把膜技術(shù)作為21世紀(jì)的基盤技術(shù)進行研究和開發(fā)?！罢l掌握了膜技術(shù)，誰就掌握了化學(xué)工業(yè)的未來”-NormanN.Li，美國科學(xué)院院士，著名華裔科學(xué)家。膜分離已得到廣泛應(yīng)用。21世紀(jì)是工業(yè)生物技術(shù)的世紀(jì)，膜技術(shù)將扮演重要角色。（一）膜分離的類型滲透（Osmosis）透析（Dialysis）微濾（Microfiltration）超濾（Ultrafiltration）納濾（Nanofiltration

）反滲透（ReverseOsmosis）1、按推動力不同：（2）壓力差膜分離：（3）電位差膜分離：（1）擴散膜分離：電滲析（Electrodialysis）2、按膜孔徑或截留物質(zhì)的大?。何V——超濾——納濾、電滲析、透析——

反滲透膜孔徑大小病毒生物大分子生物小分子鹽類水灰塵細(xì)菌病毒生物大分子生物小分子鹽類水灰塵細(xì)菌病毒生物大分子生物小分子鹽類水灰塵細(xì)菌病毒生物大分子生物小分子鹽類水膜微濾（MF）超濾（UF）納濾（NF）反滲透濾（RO）灰塵細(xì)菌（0.2-2um）（10-200nm）（＜2nm）（2-10nm）各種膜分離法的原理和應(yīng)用范圍膜分離法截留的顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)應(yīng)用舉例微濾（MF）0.2~2um灰塵、細(xì)菌微孔濾膜除菌，回收菌超濾（UF）10nm~200nm生物大分子及以上超濾膜蛋白質(zhì)、多肽和多糖的回收和濃縮納濾（NF）2nm~10nm生物小分子及以上納濾膜脫鹽、濃縮反滲透（RO）<2nm鹽類及以上反滲透膜鹽、氨基酸、糖的濃縮、淡水制造三、離心技術(shù)在酶分離純化中的應(yīng)用

離心是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分開的技術(shù)。（一）基本原理離心力：Fc=mac=mω2r

rminrmeanrmax軸心離心管式中：Fc—離心力；

m—為物質(zhì)質(zhì)量(g)；

ac—為離心加速度(m/s2)；

r—離心管中受力粒子到離心機軸心的垂直距離相對離心力（relativecentrifugationforce，RCF）：=1.12×10-5n2r（g）（r取厘米，g為980厘米/秒2）工業(yè)上:相對離心力→離心分離因素

r取米，則：

RCF=1900n2r（g）（二）離心機分類冷凍系統(tǒng)、離心管帽冷凍系統(tǒng)、離心管帽、真空系統(tǒng)800025000低速離心機高速離心機超速離心機分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘渣及粗結(jié)晶等較大顆粒。分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片及較大的細(xì)胞器等。制備用：分離純化生物大分子、細(xì)胞器和病毒等。分析用：測定樣品純度、沉降系數(shù)、相對分子量。轉(zhuǎn)速(r/min)（三）離心方法沉降速度法沉降平衡法差速離心密度梯度離心等密度梯度離心密度相近而大小不同密度差別較大（補充）中小大1、差速離心

采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒先后分離的方法。應(yīng)用范圍：大小和密度有較大差別的顆粒。2、密度梯度離心

在離心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐漸降低的梯度，將樣品放在密度梯度溶液的表面，經(jīng)過離心，沉降系數(shù)比較接近的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條不連續(xù)的區(qū)帶。梯度介質(zhì)：蔗糖密度梯度系統(tǒng)樣品蔗糖密度梯度沉淀慢的組分沉淀快的組分介質(zhì)的最大密度＜樣品組分的最小密度3、等密度梯度離心

當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍時，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆粒一直移動到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置，形成區(qū)帶。常用的離心介質(zhì)：銫鹽，如CsCl，Cs2SO4，CsBr樣品密度梯度低密度組分高密度組分超速離心機按照其用途可以分為制備用超速離心機、分析用超速離心機和分析-制備兩用超速離心機3種蛋白質(zhì)分子在離心時，其分子量、分子密度、組成、形狀等，均會影響其沉降速率，沉降系數(shù)即用來描述此沉降性質(zhì),其單位為S。每一種的沉降系數(shù)與其分子密度或分子量成正比。不同沉降系數(shù)的蛋白質(zhì)，可利用超高速離心法，在密度梯度中作分離。密度梯度的制備：密度梯度混合器（四）離心沉降速度和沉降系數(shù)沉降速度（v）：離心管中的粒子在離心力場作用下，向垂直于轉(zhuǎn)軸方向移動的速度。v

=drdt=S·ω2rS=dr/dtω2rS為沉降系數(shù)，單位：秒

許多大分子和超分子復(fù)合物（如核糖體等）的沉降系數(shù)，都在10-13秒這個數(shù)量級，將定為1S。（五）離心時間差速離心密度梯度離心等密度梯度離心離心時間表示方法：①沉降時間、②區(qū)帶形成時間、③平衡時間離心時間表示方法：①沉降時間、②區(qū)帶形成時間、③平衡時間1dt=

ω2Sdrr·t2–t1=1ω2S（lnr2-lnr1）積分得：

根據(jù)所用的離心機，確定了沉降開始的離心半徑r1和預(yù)定終止的r2，又確定了離心時的轉(zhuǎn)速，對某一具體的顆粒，其沉降系數(shù)S也是定值，就可計算出離心所需時間（t2-t1）。第三節(jié)層析技術(shù)在酶分離純化中的應(yīng)用（一）色譜法基本操作過程（二）吸附色譜（三）離子交換色譜（四）凝膠過濾色譜（五）親和色譜√√√一、色譜分離法

色譜法是1905年俄國植物學(xué)家茨維特發(fā)明的。他將植物色素的石油醚提取液倒入一根裝有碳酸鈣的玻璃管頂端，用石油醚淋洗玻璃管，使色素出現(xiàn)分離，在管內(nèi)顯示出不同的色帶，色譜一詞由此得名。碳酸鈣（固定相）石油醚（流動相）色譜柱二、色譜法分類1、根據(jù)流動相狀態(tài)不同分液相色譜氣相色譜常壓液相色譜√高壓液相色譜2、根據(jù)支持介質(zhì)不同分柱色譜√紙色譜薄層色譜毛細(xì)管色譜3、根據(jù)分離原理不同分吸附層析：吸附力不同離子交換層析：離子交換能力的不同凝膠過濾層析：相對分子質(zhì)量不同親和層析：專一而又可逆的親和力三、基本操作過程層析柱的準(zhǔn)備固定相材料的準(zhǔn)備裝柱平衡上樣（洗滌和）洗脫收集洗脫液洗脫液檢測，繪制洗脫曲線（柱再生）下一輪上樣四、幾種層析分離方法（一）吸附層析

利用物理吸附劑對不同物質(zhì)吸附能力的不同而使混合液中各組分分離的方法。1、原理2、吸附劑的種類和特點（1）種類：活性氧化鋁、硅膠、硅藻土、碳酸鹽、活性碳、陶土、纖維素等。①來源豐富、價廉、可再生、吸附設(shè)備簡單。②使用前要預(yù)處理，以除去雜質(zhì)，提高吸附力，增強分離效果。③上樣：低pH值和低離子強度，洗脫：提高pH值和離子強度。3、吸附的三個基本環(huán)節(jié)：加樣、吸附、洗滌和洗脫。（2）特點：（二）離子交換層析1、原理

利用離子交換劑上的帶電基團（活性基團）對各種離子親和力不同而達到分離目的的一種分離方法。2、什么是離子交換劑?+++---母體帶電基團帶電基團母體離子交換樹脂：交換容量不大，易使酶失活離子交換纖維素：最廣泛的一類離子交換凝膠：不耐高流速洗脫+++---陽離子交換劑：能吸附帶“+”的離子或酶-CM-（羧甲基）-PO32-（磷酸基）-SO3-（磺酸基）陰離子交換劑：能吸附帶“-”的離子或酶

-DEAE（二乙基氨基乙基）-TEAE（三乙基氨基乙基）3、離子交換反應(yīng)

蛋白質(zhì)/酶在不同的pH條件下，將發(fā)生不同的離解作用，而帶不同的電荷，選擇相應(yīng)的離子交換劑，同時要考慮被分離酶的穩(wěn)定性。4、操作要點（1）離子交換劑的預(yù)處理：浸泡吸脹，再用HCl和

NaOH交換處理，離子交換樹脂和凝膠用2~3倍于樹脂體積的2mol/L，離子交換纖維素用0.5mol/L酸、堿處理。（2）裝柱：濕法裝柱，離子交換劑上樣前抽氣泡。（3）平衡、加樣：1%~5%上樣量。（4）洗脫、收集：

梯級洗脫（分時段改變洗脫液的pH或鹽離子強度）梯度洗脫（連續(xù)改變pH或鹽離子強度）（5）再生：離子交換劑要再生，和預(yù)處理程序相同。（三)凝膠過濾層析1、原理

利用各組分分子量大小不同，從而在凝膠網(wǎng)孔中流速不同達到分離的目的。（1）混合物上柱;（2）洗脫開始，小分子進入凝膠內(nèi)，大分子則被排阻于外;（3）小分子滯留，大分子向下移動，大小分子開始分開;（4）大小分子完全分開;（5）大分子行程較短，已洗脫出，小分子尚在行進中。2、凝膠層析測定蛋白質(zhì)（酶）的相對分子質(zhì)量

不同分子之間的分離，是它們在內(nèi)水和外水之間的一種分配行為，流出柱的先后，用分配系數(shù)Kd作定量描述：Kd

=（Ve-Vo）/ViVe——洗脫體積，指從洗脫開始到某一組分流出峰值時所用洗脫液體積Vo——外水體積，柱床中凝膠顆粒之間的空隙體積Vi——內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部空隙體積的總和當(dāng)Ka=0時，Ve=Vo，全排出的大分子當(dāng)Ka=1時，Ve=Vo+Vi，是全受阻的小分子或無機離子Ka=0~1時，其他大小介于兩者之間的分子Kd

=（Ve-Vo）/ViVe——洗脫體積，指從洗脫開始到某一組分流出峰值時所用洗脫液體積Vo——外水體積，柱床中凝膠顆粒之間的空隙體積Vi——內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部空隙體積的總和Ve——洗脫體積，指從洗脫開始到某一組分流出峰值時所用洗脫液體積Vo——外水體積，柱床中凝膠顆粒之間的空隙體積Vi——內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部空隙體積的總和Ka值最小的，最先流出；Ka值最大的，最后流出。同一個凝膠床，內(nèi)水體積和外水體積（Vo和Vi）為定值，因而洗脫體積（Ve）小的，就是相對分子質(zhì)量大的。Ka

=Ve-VoViVe

=-blgMr+c

Mr—相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)分子量與凝膠層析洗脫體積的關(guān)系VelgMr····

用一組已知相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)進行實驗，作出上圖，然后對未知相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)（酶）在同一凝膠柱上實驗，測得Ve，就可以查標(biāo)準(zhǔn)曲線算出它的相對分子質(zhì)量。3、常用的凝膠種類（1）葡聚糖凝膠SephadexG-X

X—表示每克干膠的吸水值的10倍吸水值越大，分離范圍(分子量)越大（2）瓊脂糖凝膠

Sepharose2B、4B、6B

2B、4B、6B表示瓊脂糖含量為2%、4%、6%，濃度越高，凝膠網(wǎng)眼孔徑越小，分部的大分子相對分子質(zhì)量越小，范圍越窄。

瓊脂糖分部的相對分子質(zhì)量范圍較葡聚糖寬廣，上限達108，故適用于分離相對分子質(zhì)量大的蛋白（酶）。（3）聚丙烯酰胺糖凝膠（PAG）Bio-GelP-2、4、6、…….、200、300，共10種型號。P后的數(shù)字表示分離的最大相對分子質(zhì)量（×103）。4、操作要點（1）裝柱：裝柱前要吸脹和抽氣。常溫吸脹需較長時間，可加熱溶脹。（2）上樣：加樣量不超過3%。（3）洗脫：洗脫液應(yīng)與平衡時的溶液一致。（4）再生：無須經(jīng)過再生處理。（5）長期不用時，可加0.02%的NaN3保存。（四)親和層析1、原理

生物分子對間的專一而又可逆的結(jié)合力，稱為親和力，利用這種親和專一性的特點，而制備專門的親和吸附劑，用其進行蛋白質(zhì)等生物分子的層析純化，就是親和層析，效率特別高。

酶—底物（包括酶的競爭性抑制劑和輔因子）抗原—抗體激素—受體

DNA—互補的DNA或RNA

凝集素和糖蛋白載體配體臂待分離組分親和吸附洗滌洗脫再生雜蛋白目的酶

親和分離原理示意圖2、親和吸附劑由母體與配體偶聯(lián)而成。配基：作為固定相的分子對的一方。母體：又稱載體，如各種凝膠、纖維素均是惰性物，須先活化后再與配基反應(yīng)。臂：如果載體與配基間的距離太近，往往需要加臂。載體配體臂親和吸附劑3、操作要點（1）要先洗滌后洗脫，用含有與親和吸附劑相同的高濃度配基或另一種配基洗脫。（2）柱床要再生

10倍于柱床體積的0.1mol/LNaCl-0.1mol/LTris-HCl洗至pH8.5，改用0.5mol/LNaCl-0.1mol/LHAC洗至pH4.5，然后用純水洗至中性。親和層析法純化胰蛋白酶

雞蛋清

Sepharose4B

豬胰臟

↓↓↓提取↓活化

提取分離純化↓↓↓純卵粘蛋白(CHOM)→←活化Sepharose4B

胰蛋白酶原粗提液↓↓

偶聯(lián)

激活↓↓

CHOM-Sepharose4B→←胰蛋白酶提取液↓

親和層析↓純胰蛋白酶環(huán)氧氯丙烷活化載體活化偶聯(lián)親和結(jié)合洗脫吸附層析離子交換層析凝膠層析親和層析固定相操作步驟特殊點洗脫特點應(yīng)用物理吸附劑，如活性氧化鋁、磷酸鈣膠體等離子交換凝膠離子交換纖維素離子交換樹脂葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠（凝膠網(wǎng)孔內(nèi)水為固定相）用瓊脂糖或纖維素為載體共價結(jié)合適當(dāng)?shù)呐浠捎H和吸附劑無纖維素和凝膠類交換劑裝柱時先抽氣，柱床要再生后再上樣濕凝膠抽氣后濕法裝柱上樣后先洗滌除雜質(zhì)，然后洗脫，柱床要再生洗脫液含酶的配基或其他物質(zhì)用樣品和平衡緩沖液洗脫常用pH梯度或鹽濃度梯度洗脫洗脫液離子強度比樣品液高酶分離純化成本較低離子交換纖維素洗脫條件較溫和，酶分離純化多用廣泛用于酶分離純化、脫鹽、測定相對分子質(zhì)量酶純化效率高，但制備親和吸附劑較麻煩，貴第四節(jié)電泳技術(shù)在酶分離純化中的應(yīng)用第四節(jié)電泳技術(shù)在酶分離純化中的應(yīng)用一、電泳的基本原理二、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）三、等電聚焦電泳√

帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動，稱之為電泳(electrophoresis，簡稱EP)。電泳的定義：

電泳技術(shù)：是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進行分離。帶電粒子在電場中遷移的速度：A、α—常數(shù)r—粒子的半徑Q—粒子的表面電荷量η—介質(zhì)的粘度E—電場強度μ—介質(zhì)的離子強度一、電泳的基本原理（1）電場強度（電壓）（2）帶電粒子表面電荷（3）帶電粒子大?。?）介質(zhì)的粘度（5）溶液的離子強度（6）電滲的影響，公式中沒有反映，主要在紙電泳時表現(xiàn)較明顯。此式表明：影響電泳時帶電粒子遷移速度的因素，包括：因此，不同的分子可以由Q和r不同而彼此分離。在一定的電泳條件下，E、η、μ為定值。電泳時的遷移速度差別取決于：分子的表面電荷多少和分子大小。取決于PI與溶液的pH值的關(guān)系。電泳的分類：紙電泳薄層電泳薄膜電泳凝膠電泳等電點聚焦電泳根據(jù)支持體分類:√1、聚丙烯酰胺凝膠（PAG）

丙烯酰胺：arc，單體甲叉雙丙烯酰胺：bis，雙體，arc濃度：凝膠的孔徑大小arc和bis的比例：凝膠的強度催化劑用量：聚合時間二、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）交聯(lián)劑PAGE的應(yīng)用類型濃度梯度PAGESDS不連續(xù)PAGE

用于一般分析分離純化

用于測定Pr相對分子質(zhì)量和分離純化

用于測定Pr單體相對分子質(zhì)量和雙向電泳2、不連續(xù)PAGE的特性和分離Pr的效應(yīng)（1）三個不連續(xù)凝膠濃度不連續(xù)；pH值不連續(xù)；緩沖液不連續(xù)。

（2）三種效應(yīng)濃縮效應(yīng)；電荷效應(yīng)；分子篩效應(yīng)。用梯度混合儀制成從上至下4%~30%的均勻濃度梯度凝膠。其網(wǎng)眼孔徑從上至下越來越小。電泳時，不同Pr主要依r大小而分離，即分子篩效應(yīng)>電荷效應(yīng)?？捎糜跍y定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。3、濃度梯度PAGE4、SDSSDS：十二烷基硫酸鈉

CH3（CH2）11SO4Na2在配制凝膠時加入SDS，同時加巰基乙醇。Pr在電泳時，其中的寡聚體Pr解聚為單體（亞基）。SDS分子將每個單體分子表面覆蓋起來，使其形成短軸為1.8nm，而長軸各異的SDS—亞基復(fù)合物，電泳時，他們的表面電荷基本相同。故可因分子長軸大?。磥喕肿哟笮。┎顒e而分離，換言之，亞基的大小是彼此分離的依據(jù)。所以此法可用于測定單體的相對分子質(zhì)量。SDS測定蛋白質(zhì)（亞基）的相對分子質(zhì)量（Mr）與它們的電泳遷移率（U）之間，存在如下關(guān)系：lgMr=lgK-bU

用lgMr對U作圖，只要實驗測得U

，就可用標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得未知蛋白質(zhì)（亞基）的相對分子質(zhì)量。mR=蛋白質(zhì)移動的距離溴酚藍移動的距離實際工作中，常用相對遷移率（用mR

表示）代替U作圖。

三、等電點聚焦電泳（IsoelectricFocusing，IEF）

等電點聚焦電泳是在電泳介質(zhì)中加入兩性離子載體，電泳時形成由陽極到陰極的連續(xù)遞增的pH梯度，蛋白質(zhì)按其電荷性質(zhì)不同各自向著與其等電點相等的pH處移動聚焦，從而彼此分離的電泳技術(shù)，無論Pr從正極出發(fā)或是從負(fù)極出發(fā)，都會聚焦在等電點處。低pH等電聚焦電泳進行過程中高pH（＋）（＋）低pH等電聚焦電泳結(jié)束后高pH（－）（－）1、等電點聚焦電泳分離Pr原理2、兩性離子載體

各組分的pI值十分接近，在電泳中可以形成連續(xù)的pH梯度，常用的商品名為Ampholine，規(guī)格有pH3.5~9.0和精細(xì)分級的pH3.5~5、5~9、9~11的多種商品可供不同的要求使用。

由于其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分。

液體介質(zhì)3、支持pH梯度的介質(zhì)兩性電解質(zhì)載體在蔗糖密度梯度柱中形成pH梯度。凝膠介質(zhì)兩性電解質(zhì)載體在凝膠內(nèi)形成pH梯度。凝膠中加有兩性電解質(zhì)溶液（pH9-3）

加電場后在凝膠內(nèi)形成一個穩(wěn)定pH梯度

加樣品，然后繼續(xù)電泳凝膠染色表明樣品按照各自pI值沿著pH梯度分布第五節(jié)酶液的濃縮、結(jié)晶、干燥與成型濃縮：是從稀溶液中除去一部分溶劑（水），使其變成濃縮液的工藝。工業(yè)上處理大量物料：低溫真空蒸發(fā)、薄膜蒸發(fā)和超濾。一、稀酶液的濃縮(1)低溫真空蒸發(fā)(2)薄膜蒸發(fā)(3)超濾濃縮1、結(jié)晶的一般原理不飽和溶液飽和溶液過飽和溶液析出沉淀（快）析出結(jié)晶（慢）（無排列排隊機會）

結(jié)晶是指控制適當(dāng)?shù)臈l件，使溶液中的溶質(zhì)以晶體形態(tài)從溶液中析出的工藝過程。二、結(jié)晶第一步：形成過飽和溶液稍微越過飽和狀態(tài)，處于介穩(wěn)態(tài)，濃縮、降溫、調(diào)節(jié)pH至pI，可使溶液趨于過飽和。第二步：形成晶核過飽和溶液在一定條件下可形成極微小的有序排列的固相物，成為后續(xù)晶體生長的核心，稱為晶核。第三步：晶體生長溶質(zhì)在晶核周邊不斷有序排列，晶體逐步長大。2、結(jié)晶“三步曲”3、結(jié)晶條件（1）酶的純度——一般酶純度應(yīng)達到50%以上。（2）酶蛋白的濃度——對大多數(shù)酶來說，蛋白質(zhì)濃度在3~50mg/mL

較好。（3）晶種——有些不易結(jié)晶的酶，需加入微量的晶種才能形成結(jié)晶。（4）溫度——一般控制在0~4℃范圍內(nèi)。（5）pH值——一般選擇在被結(jié)晶酶的pI