實(shí)驗(yàn)1 概述+2PCR+3基因組+4檢測 2014-02-24

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室守則實(shí)驗(yàn)要穿白大褂。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止吃食物，勿高聲談話。實(shí)驗(yàn)前必須認(rèn)真預(yù)習(xí)，熟悉實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容，了解所用的儀器用具；實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，認(rèn)真操作、仔細(xì)觀察，及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及結(jié)果；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后仔細(xì)地分析和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)真做好每一天的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。使用貴重精密儀器時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，對任何自己不熟悉的實(shí)驗(yàn)儀器都不要隨意操作（尤其是微量移液器?。?。在操作的過程中發(fā)現(xiàn)任何意外的現(xiàn)象都要及時(shí)向任課教師報(bào)告。在實(shí)驗(yàn)的過程中制造的任何垃圾都要丟到垃圾筐里（或先放在自己的桌面廢物缸內(nèi)），嚴(yán)禁隨地投棄！實(shí)驗(yàn)器具應(yīng)保持清潔，例用過的玻璃器皿必須洗凈后放回原處。實(shí)驗(yàn)臺面應(yīng)隨時(shí)保持整潔，儀器、藥品擺放整齊。公用試劑及用具盒用完后，應(yīng)立即蓋好放回原處。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要把微量移液器清點(diǎn)后歸還，征得同意后方可離開實(shí)驗(yàn)實(shí)。實(shí)驗(yàn)時(shí)損壞的任何物品（尤其是微量移液器）都要按規(guī)定賠償。執(zhí)行值日生制度，每天安排3-4人值日，其職責(zé)是負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)器具的整理、操作臺、水槽、地板等實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生工作和一切服務(wù)性工作，并注意實(shí)驗(yàn)室的水、電、門窗等方面情況。

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程介紹

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是研究核酸等生物大分子的功能、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及其重要性和規(guī)律性的科學(xué)，是生物學(xué)專業(yè)教學(xué)計(jì)劃中一門重要的實(shí)驗(yàn)課程。通過本課程的實(shí)踐與操作，使學(xué)生全面、系統(tǒng)地掌握分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本原理和技術(shù)，使學(xué)生了解分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展前沿，培養(yǎng)學(xué)生從分子水平上去分析、理解生命現(xiàn)象與過程，培養(yǎng)學(xué)生思考與探索生命的奧秘的能力。使理論知識與實(shí)踐能力相輔相成，不斷得到提升，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度與實(shí)事求是的作風(fēng)。本課程的基本要求

掌握實(shí)驗(yàn)中涉及的有關(guān)的理論知識常用技術(shù)的原理實(shí)驗(yàn)中使用的試劑的作用實(shí)驗(yàn)可能達(dá)到的預(yù)期結(jié)果掌握有關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作常用器具、儀器的使用方法和注意事項(xiàng)常用技術(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟及其原理具備基本的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)能力實(shí)驗(yàn)參考書：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書；《分子克隆》；盧圣棟《現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)》；

魏群《分子生物寫實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》(北師大)本課程涉及的基因技術(shù)基因克?。和ㄟ^PCR分離外源DNA/基因序列→外源DNA/基因序列和克隆/表達(dá)載體的酶切→DNA片段的連接（外源DNA/基因與載體的連接）→重組分子轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞內(nèi)（以擴(kuò)增或表達(dá)外源基因）基因組DNA提取質(zhì)粒/載體DNA的提取DNA/RNA的檢測：瓊脂糖凝膠電泳檢測、紫外分光光度計(jì)的檢測實(shí)驗(yàn)1：移液器的使用實(shí)驗(yàn)2:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（λDNA的PCR)擴(kuò)增（只做PCR，不做檢測）實(shí)驗(yàn)3:基因組DNA的提?。–TAB法提取植物基因組DNA）（由只提取DNA，不做檢測）實(shí)驗(yàn)4:瓊脂糖凝膠電泳（實(shí)驗(yàn)2、3的檢測，完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、2)實(shí)驗(yàn)5：質(zhì)粒DNA的提?。ú蛔鰴z測）實(shí)驗(yàn)6:質(zhì)粒DNA濃度和純度檢測（完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告3）實(shí)驗(yàn)7:質(zhì)粒DNA的酶切、連接及凝膠電泳檢測（實(shí)驗(yàn)報(bào)告4）實(shí)驗(yàn)8：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化（實(shí)驗(yàn)報(bào)告5）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及時(shí)間安排分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

注意事項(xiàng)“安全”觀念：使用離心機(jī)要注意離心樣品的平衡。微波爐內(nèi)不可使用金屬容器、空載容器、密閉容器。使用電泳儀等電器時(shí)注意用電安全。使用滅菌鍋、溫箱時(shí)注意壓力、溫度不可超過最大限值。使用紫外線時(shí)，注意防護(hù)：不可裸眼注視，不可在紫外線下暴曬……實(shí)驗(yàn)時(shí)帶一次性手套、穿白大褂。使用可能造成環(huán)境污染或?qū)θ梭w等生物體有害的物品,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要集中處理，不可隨處丟棄?！拔廴尽庇^念：保持干凈，防止污染凡是實(shí)驗(yàn)操作所用的一切塑料器具（EP管、tip等）及可以進(jìn)行滅菌的試劑都必須在使用前裝入盒子和瓶子中經(jīng)過滅菌（高壓蒸汽滅菌、過濾滅菌）后進(jìn)行使用，以防止雜質(zhì)的污染及其對實(shí)驗(yàn)樣品DNA、RNA或蛋白質(zhì)的降解。實(shí)驗(yàn)帶上一次性手套，手套用完后捆好再棄于廢物缸。手持離心管時(shí)注意不要觸碰離心管的內(nèi)表面，包括蓋子內(nèi)表面。每吸取一種試劑都要更換

tip頭，要避免試劑間交叉污染。每次取用tip頭后盒蓋關(guān)上。管內(nèi)表面蓋內(nèi)表面外表面“小心”觀念：仔細(xì)、認(rèn)真操作實(shí)驗(yàn)中加入任何試劑后應(yīng)注意樣品的混勻?；靹颉⒈氐确磻?yīng)后樣品應(yīng)瞬時(shí)離心將內(nèi)容物收集至管底后再進(jìn)行下步的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)做好每個(gè)樣品的標(biāo)記工作，且一般在離心管上用記號筆作標(biāo)記時(shí)，應(yīng)在兩處重復(fù)做好標(biāo)記。尤其注意：微量移液器的使用其它：實(shí)驗(yàn)前應(yīng)做好試劑的配置，用品滅菌等準(zhǔn)備工作，配置分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)各種試劑，必須要使用重蒸水（ddH2O）。使用后的器皿必須認(rèn)真清潔干凈，洗完后還要用重蒸水沖洗三次。微量移液器的使用微量移液器是連續(xù)可調(diào)的，用于計(jì)量和轉(zhuǎn)移液體的專用儀器，其裝有直接讀數(shù)的容量計(jì)。排放旋鈕讀數(shù)窗量程（可調(diào)讀數(shù)范圍）可脫卸吸嘴（槍頭、吸頭、tip頭）卸尖按鈕卸尖器我們實(shí)驗(yàn)室的微量移液器共有四種規(guī)格，在移液器量程范圍內(nèi)能連續(xù)調(diào)節(jié)讀數(shù)。分別是：0.5～10μl(讀數(shù)窗顯示0.5～10.0,精度為0.1μl)5～50μl(讀數(shù)窗顯示5.0～50.0,精度為0.5μl)20～200μl(讀數(shù)窗顯示20～200,精度為1μl)100～1000μl(讀數(shù)窗顯示100～1000,精度為5μl)量液的操作步驟第一步：容量設(shè)定切記：讀數(shù)窗的讀數(shù)絕對不能超出量程范圍?。?！順時(shí)針調(diào)節(jié)→讀數(shù)變大；逆時(shí)針調(diào)節(jié)→讀數(shù)變小正確的容量設(shè)定分為兩個(gè)步驟：一是粗調(diào)，即通過排放按鈕將容量值迅速調(diào)整至接近自己的預(yù)想值；二是細(xì)調(diào)，當(dāng)容量值接近自己的預(yù)想值以后，應(yīng)將移液器橫置，水平放至自己的眼前，通過調(diào)節(jié)輪慢慢地將容量值調(diào)至預(yù)想值，從而避免視覺誤差所造成的影響。注意：當(dāng)我們從大值調(diào)整到小值時(shí)，剛好就行；但從小值調(diào)整到大值時(shí)，就需要調(diào)超三分之一圈后再返回，這是因?yàn)橛?jì)數(shù)器里面有一定的空隙，需要彌補(bǔ)。第二步：安裝吸頭旋轉(zhuǎn)安裝法安裝吸頭將槍嘴垂直插入吸頭盒的吸頭上輕輕用力向下壓（A)，同時(shí)把手中的移液器按逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)180°（B），使吸頭緊緊地扣在槍嘴上。AB注意：不同規(guī)格的移液器使用不同規(guī)格的吸頭。切記用力不能過猛，更不能采取錘、跺吸頭的方法來進(jìn)行安裝，因?yàn)槟菢幼鰰δ种械囊埔浩髟斐刹槐匾膿p傷。吸頭要緊密扣在吸嘴上，不可漏氣，否則導(dǎo)致吸液不精確。（漏氣的檢驗(yàn)：吸液后垂直移液器，在吸頭出現(xiàn)液體滲出甚至液滴滴漏，即表明吸頭與吸嘴吻合不嚴(yán)而漏氣。）將微量移液器按鈕輕輕壓至第一停點(diǎn)；垂直握持微量移液器，使tip頭浸入液面下幾毫米，千萬不要將tip頭直接插到液體底部；緩慢、平穩(wěn)地松開控制按鈕，吸上液體，稍等片刻后將tip頭提離液面。第三步：吸液關(guān)于吸液的特別注意：

嚴(yán)禁吸液后將移液器平放！吸液時(shí)一定要緩慢松開排放旋鈕使液體進(jìn)入吸頭，否則，液體會迅速進(jìn)入tip頭，導(dǎo)致液體（尤其是一些腐蝕性液體，如氯仿）倒沖入移液器內(nèi)部，對移液器造成損傷，同時(shí)也可能造成溶液的污染。對于粘稠液體可首先吸放幾次，然后極緩慢地松開按鈕，使溶液慢慢進(jìn)入吸頭內(nèi)；否則，可使吸入體積減少。第四步：放液平穩(wěn)地把按鈕壓到第一停點(diǎn)，再把按鈕壓至第二停點(diǎn)以排出剩余液體；提起微量移液器，使tip頭在容器壁擦過；按tip頭卸尖器卸下tip頭。放液的注意事項(xiàng)：如果將要將一種溶液放到另一種溶液中時(shí)，最好將吸頭插入葉面下后再放液；放液時(shí)容易產(chǎn)生氣泡，在進(jìn)行下一步反應(yīng)前可瞬時(shí)離心將氣泡趕走。放液量液操作注意問題未裝tip頭的微量移液器絕對不可用來吸取任何液體。一定要在允許量程范圍內(nèi)設(shè)定容量，千萬不要將讀數(shù)的調(diào)節(jié)超出其適用的刻度范圍，否則會造成損壞。不要橫放帶有殘余液體tip頭的移液器。為了避免量液誤差，不要用大量程的移液器移取小體積樣品。在幾種規(guī)格都能一次完成取液時(shí)盡量選取精確度高的（量程小的）。所取的體積有精度要求時(shí)，需根據(jù)各規(guī)格的量程和精度來配合完成取液。練習(xí)使用移液槍進(jìn)行移液：量取下列容量的蒸餾水并轉(zhuǎn)移到另一個(gè)管子中：1、0.5μl2、3.5μl3、10μl4、17.4μl5、89.5μl6、250μl7、800μl8、0.3μl液體A+0.3μl液體B，轉(zhuǎn)移到同一個(gè)管子中9、45μl10、將0.5μl液體A轉(zhuǎn)移到盛有10μl液體B的管子中實(shí)驗(yàn)二、

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

λDNA特異片段實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙笳莆眨杭夹g(shù)原理PCR擴(kuò)增技術(shù)的原理技術(shù)操作熟練使用微量移液器吸放微量液體PCR體系建立的基本操作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基本原理什么是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）？

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR）是模擬DNA的復(fù)制過程，在體外特異性擴(kuò)增DNA片段的方法，從而獲得大量的同一序列DNA。細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制|細(xì)胞分裂

(體內(nèi)的DNA擴(kuò)增)Step1.解鏈Step2.引物結(jié)合Step3.子鏈延伸DNA復(fù)制的模板DNA聚合酶RNA引物4種脫氧核糖核酸（dNTP）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）（體外的DNA擴(kuò)增）Step1.解鏈Step2.引物結(jié)合Step3.子鏈延伸DNA復(fù)制的模板DNA聚合酶RNA引物4種脫氧核糖核酸（dNTP）DNA復(fù)制的模板耐熱的TaqDNA聚合酶DNA引物4種脫氧核糖核酸（dNTP）PCR緩沖液（含Mg2+等提供適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件）Step1.高溫模板變性Step2.低溫引物與模板退火Step3.中溫子鏈延伸反應(yīng)體系：反應(yīng)程序（過程）PCR擴(kuò)增過程

溫度持續(xù)時(shí)間94℃（預(yù)變性）4min94℃（變性）30sec52℃（退火）30sec72℃（延伸）1min72℃（補(bǔ)充延伸）5minDNA模板變性退火:引物+模板新鏈延伸37~55℃72℃N次循環(huán)引物耐熱的DNA聚合酶30次循環(huán)模板DNA94℃94℃~95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA94℃變性94℃~95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)ReverseprimerForwardPrimerDNA引物50℃復(fù)性55℃（視具體情況而定）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)ReversePrimerForwardPrimerDNA引物Taq酶Taq酶72℃延伸72℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)94℃第1輪結(jié)束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)94℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理論產(chǎn)物拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際產(chǎn)物拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

為什么可以通過PCR擴(kuò)增得到特異片段？特異片段1st

循環(huán)2nd

循環(huán)3rd

循環(huán)4th

循環(huán)5th

循環(huán)繼續(xù)：擴(kuò)增特異片段PCR的特點(diǎn)靈敏度高理論上1～3個(gè)DNA分子經(jīng)PCR擴(kuò)增可獲得百萬以上個(gè)相同的DNA分子特異性強(qiáng)擴(kuò)增的產(chǎn)物與模板分子特異區(qū)域完全相同簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，1～3小時(shí)完成擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳方法即可檢測分析對標(biāo)本的要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等的粗提DNAPCR的應(yīng)用研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，腫瘤檢測和診斷法醫(yī)犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析；親緣關(guān)系鑒定其他……實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、DNA模板：λDNA(30ng/μl)2、4種dNTP混和物3、10×PCR反應(yīng)緩沖液（15mmol/LMgCl2、500mmol/LKCl、100mmol/Ltris.HCl(pH8.3)、0.1%明膠）4、引物1和引物2:見“實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)”6、TaqDNA聚合酶(貯存液：50%甘油，100mmol/LKCl,20mmol/LTris-HClpH8.0,0.1mmol/LEDTA,1.0mmol/LDTT)7、瓊脂糖、DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物(100bpDNAMarker)（下次電泳檢測實(shí)驗(yàn)用）PCR的基本步驟1、PCR反應(yīng)體系的建立（1）取0.2ml的薄壁離心管，按表1順序加入試劑.（2）稍混勻，短暫離心把溶液甩至管底。試劑標(biāo)記成份體積(μl)H2OddH2O17.25B10×反應(yīng)緩沖液2.5ddNTPs(2.5mMeach)21引物112引物21PλDNA(30ng/μl)1TTaqDNA聚合酶0.25總體積25表1PCR反應(yīng)體系2、設(shè)置PCR的變溫程序（熱循環(huán)反應(yīng)）（1）按表2設(shè)置PCR反應(yīng)的變溫程序。（2）把離心管放進(jìn)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。（3）反應(yīng)結(jié)束后低溫保存或檢測。反應(yīng)階段循環(huán)數(shù)

溫度持續(xù)時(shí)間1194℃（預(yù)變性）3min23094℃（變性）30sec55℃（退火）30sec72℃（延伸）1min3172℃（補(bǔ)充延伸）10min4（可選）116℃（冷卻）4℃冰箱：短時(shí)間保存；-20℃：長期保存表2PCR反應(yīng)的變溫程序3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測取10μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測（操作步驟：實(shí)驗(yàn)4）1:DNAMarkerDL2,0002~5:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（500bp片段）本實(shí)驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果：PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測2000100075050020010012345實(shí)驗(yàn)報(bào)告（做完實(shí)驗(yàn)4后完成）記錄PCR擴(kuò)增DNA以及DNAMarker的電泳圖譜，說明帶型含義（對結(jié)果和出現(xiàn)的問題進(jìn)行分析，如若未獲得單一的擴(kuò)增帶，這是什么原因造成的？擴(kuò)增帶顏色深淺說明什么等）必做課外思考題：一位同學(xué)從擬南芥中提取了RNA并在體外逆轉(zhuǎn)錄獲得了cDNA。他打算以該cDNA為模板，從中將下列基因的編碼區(qū)序列（紅色字體部分，長561bp）通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出來。已知cDNA模板的濃度為0.5μg/μl，引物母液濃度為10μM，TaqDNA聚合酶母液濃度為

5U/μl，PCR緩沖液為

10×濃度的母液.請幫助他（1）設(shè)計(jì)合適的引物，（2）建立適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體系和（3）擴(kuò)增程序以擴(kuò)增紅色部分的序列。CGAGAAAAGGAAAAAAAAAAATAGAAAGAGAAAACGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAACCCAAACCTGAGGATCAAATTAGGGCACAAAGCCCTCTCGGAGAGAAGCCATGGGAAGAAAAAAACTAGAAATCAAGCGAATTGAGAACAAAAGTAGCCGACAAGTCACCTTCTCCAAACGTCGCAACGGTCTCATCGAGAAAGCTCGTCAGCTTTCTGTTCTCTGTGACGCATCCGTCGCTCTTCTCGTCGTCTCCGCCTCCGGCAAGCTCTACAGCTTCTCCTCCGGCGATAACCTGGTCAAGATCCTTGATCGATATGGGAAACAGCATGCTGATGATCTTAAAGCCTTGGATCATCAGTCAAAAGCTCTGAACTATGGTTCACACTATGAGCTACTTGAACTTGTGGATAGCAAGCTTGTGGGATCAAATGTCAAAAATGTGAGTATCGATGCTCTTGTTCAACTGGAGGAACACCTTGAGACTGCCCTCTCCGTGACTAGAGCCAAGAAGACCGAACTCATGTTGAAGCTTGTTGAGAATCTTAAAGAAAAGGAGAAAATGCTGAAAGAAGAGAACCAGGTTTTGGCTAGCCAGGTTTGGATCCGAGTGGCTCAGTTCCAACTCCAAGTGTCTAGAAGTAGTGCTACTTTTACATGCTATATATAGATGGAGAATAATCATCATGTGGGAGCAGAAGCTGAGATGGAGATGTCACCTGCTGGACAAATCTCCGACAATCTTCCGGTGACTCTCCCACTACTTAATTAGCCACCTTAAATCGGCGGTTGAAATCAAAATCCAAAACATATATAATTATGAAGAAAAAAAAAATAAGATATGTAATTATTCCGCTGATAAGGGCGAGCGTTTGTATATCTTAATACTCTCTCTTTGGCCAAGAGACTTTGTGTGTGATACTTAAGTAGACGGAACTAAGTCAATACTATCTGTTTTAAGACAAAAGGTTGATGAACTTTGTACCTTATTCGTGTGAG植物基因組DNA的抽提實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.了解真核生物基因組DNA提取的一般原理。2.了解基因組DNA的實(shí)驗(yàn)用途。3.掌握基因組DNA提取的方法和步驟。實(shí)驗(yàn)原理（CTAB法）CTAB，十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑，可使細(xì)胞破裂，釋放出核酸；CTAB溶液中含有1.4mol/LNaCl，有助于溶解釋放出來的DNA（DNA在2mol/LNaCl中DNA具有較高的溶解度）；加入無水乙醇，可以使DNA從溶液中沉淀出來。材料：花椰菜設(shè)備：移液器，高速離心機(jī)，水浴鍋，培養(yǎng)箱

。試劑：2%CTAB抽提緩沖液2.氯仿/異戊醇（24:1）3.無水乙醇4.70%乙醇5.TE或ddH2OCTAB溶液配制2%CTAB抽提緩沖液：100mmol/LTris-HCl,pH7.0；1.4mol/LNaCl；20mmol/LEDTA；2%CTAB.

10mlfinalconc.（終濃度）CTAB0.2g2%sterilemilli-QH2O5.78ml

1MTRIS-HCl1.0ml100mM5MNaCl2.8ml1.4M0.5MEDTA0.4ml20mM實(shí)驗(yàn)步驟（常溫操作，2人一組）取適量植物組織，加入2mlCTAB抽提緩沖液，充分勻漿2-3min，然后轉(zhuǎn)移800ul的勻漿液至一支2ml離心管中，65℃水浴45min（裂解細(xì)胞，釋放核酸和蛋白）；加入800ul的氯仿/異戊醇），上下?lián)u動2-3min(此步是萃取組織液中的蛋白質(zhì)；務(wù)必帶上手套?。?；12000g離心10min，取600ul上清液轉(zhuǎn)移至一支2.0ml離心管中（由于此時(shí)懸液已經(jīng)分層，而我們需要取最上層的溶液，所以注意千萬不要使槍頭觸碰到中間的雜質(zhì)層，當(dāng)然，更不能取吸取下層的萃取液了）；加入1/10體積的NaAc(3mol/L,pH5.2）（60ul），上下顛倒混勻；然后再加入2倍體積的無水乙醇（1.2ml)，上下顛倒混勻（此時(shí)可見大量絮狀物出現(xiàn)，即DNA）;12000g離心10min，去掉上清液，取沉淀（即DNA)；加入適量70％乙醇清洗DNA（目的是清洗DNA表面攜帶的鹽離子等物質(zhì)）。如果DNA已經(jīng)懸浮，就稍加離心，然后去掉清液；打開離心管蓋，在室溫下晾干1min（注意干燥程度，要以管壁上無水珠而DNA表面有些濕潤最佳，盡量不要讓DNA干燥的太厲害，以免影響溶解）；加入50-100ulTE（含50ug/mlRNase），輕彈管底，以溶解DNA（如溶解度不佳，可65度水浴10分鐘助溶）。將溶解的DNA儲存于-20度冰箱中（以備下次實(shí)驗(yàn)課電泳檢測）。核酸的貯存——DNA保存1）短期貯存：4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）緩沖液中。

TE緩沖液(PH為8.0)，可減少DNA脫氨反應(yīng)；EDTA可以抑制DNase的活性。2）長期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；無水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，減少分子間的排斥力，有助于分子之間的聚集。無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，基因組DNA提取的用途構(gòu)建基因組文庫Southern雜交RFLP基因克?。≒CR）DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)原理在中性或偏堿性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移。根據(jù)核酸的估計(jì)分子量大小、分辨率的要求、核酸的種類來選擇電泳的支持基質(zhì)。聚丙烯胺凝膠分辨率高，可分離差異僅有1bp的DNA；配制麻煩瓊脂糖凝膠中等分辨高，常用于分離中等大小的分子；分辨率取決于瓊脂糖凝膠的濃度瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠作為一種固體支持基質(zhì),瓊脂糖分子之間相互交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；主要利用DNA分子在電場中的泳動時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)來達(dá)到分離混合物的目的。由于DNA鏈上負(fù)電荷的增加伴隨著DNA分子質(zhì)量的增加，所以實(shí)際上DNA分子的荷質(zhì)比始終是一個(gè)常數(shù)，因此荷質(zhì)比（電荷效應(yīng)）不影響電泳遷移率。在恒電場的一定電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速率取決于由DNA分子的大小與構(gòu)型而形成的分子篩效應(yīng)。DNA分子遷移速率與其相對分子量成反比500bpMarker~800bp~600bp陰極陽極相同分子量但不同構(gòu)型的DNA分子遷移速率也不同質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型(a)松弛線性的DNA（L）(b)松弛開環(huán)（OC）(c)超螺旋（cccDNA）三種構(gòu)型的質(zhì)粒的電泳模式圖譜不同螺旋程度的DNA的電泳泳動率的差異1、瓊脂糖2、TBE緩沖液:臨用時(shí)用水稀至0.5×TBE（10倍稀釋）;pH8.0～8.23、核酸電泳的指示劑溴酚蘭：在堿性液體中呈紫藍(lán)色二甲苯青：在堿性液體中呈藍(lán)色瓊脂糖凝膠濃度0.6%1%1.4%2%溴酚蘭的遷移率：與之相當(dāng)?shù)腄NA大小1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb瓊脂糖凝膠濃度1%1.4%二甲苯青遷移率：與之相當(dāng)?shù)腄NA大小2Kb1.6Kb在電泳中，溴酚蘭和二甲苯青的遷移率與下列雙鏈線性DNA片段相當(dāng)：試劑4、載樣緩沖液(LoadingBuffer)（成分：蔗糖、甘油或聚蔗糖400+電泳指示劑）增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)在電泳中形成肉眼可見的指示帶,可預(yù)測核酸電泳的速度和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便5、熒光染料GoldView(GV)

是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同，在100ml瓊脂糖膠溶液中加入5μlGoldView即可。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈DNA呈現(xiàn)紅色熒光。GoldView不僅能染DNA，也可用于染RNA。

分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker

購買的商品化的DNA分子量Marker是一個(gè)DNA分子混合物，內(nèi)含大小不同但分子量確定的DNA分子，在電泳時(shí)分離開來成為梯狀電泳圖譜。

其中一個(gè)分子量的DNA往往是有確切的含量的?？筛鶕?jù)這個(gè)分子的電泳條帶的亮度估算待測DNA的含量。30ng/μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測瓊脂糖凝膠的制備根據(jù)樣品DNA片段大小確定瓊脂糖凝膠濃度；膠板的準(zhǔn)備：膠槽置于水平支持物上（兩側(cè)封口）,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙；注意：每個(gè)小組1塊制備8孔的瓊脂糖凝膠。膠液的制備：稱取0.2g瓊脂糖,置于100ml錐形瓶中,加入20ml0.5×