中藥材及其制劑的顯微鑒別操作規(guī)程

標準操作規(guī)程標題：中藥材及其制劑顯微鑒定法生效日期 年月曰頁次：1/10編號：SOP^QC05801頒發(fā)部門：質(zhì)量管理部新訂口修訂口原文件號：編制：部門審核：QA審核：批準：分發(fā)部門：QC。目的：建立中藥材及制劑顯微鑒定方法操作規(guī)程。范圍：所有購進的中藥材及正式生產(chǎn)的含原藥粉的制劑品種。責(zé)任者：QC主任、檢驗員對本OP的實施負責(zé)。規(guī)程：藥材及成方制劑顯微鑒定法是應(yīng)用動植物細組胞織、和礦物晶體光學(xué)等知識鑒別中藥材或中成藥的一種方法。通常是借助顯微鏡進行觀察，故稱“顯微鑒別法”主要適用于：藥材性狀鑒別特征不明顯或外形相似而組織構(gòu)造不同；藥材破碎不易辨別或區(qū)分；藥材呈粉末狀態(tài)或為成方制劑；用顯微方法確定藥材中有效成份在組織中的分布狀況及其特征。顯微標本片的分類臨時性制片操作簡單，制作方便，主要用于藥材檢驗。切制片采用滑走切片或徒手切片法制片。適用于植物根、莖類藥材的鑒別。表面片采用剪、撕等方法制片。適用于葉類、花類及全草類藥材的葉片、花冠、萼片、苞片等的鑒別。解離組織片用適當(dāng)?shù)慕M織解離液使組織細胞相互適度解離后裝片，適用于觀察比較堅硬的細胞組織，如導(dǎo)管、纖維、石細胞等的形態(tài)。磨制片適用于礦物藥或有些堅硬的動物類藥材如珍珠、石決明及動物骨骼的鑒別。粉末片適用于花粉粒、孢子等的形態(tài)特征或構(gòu)造觀察。石蠟片亦稱永久片制成的石蠟切片外形較完整，厚薄均勻，且可制得連續(xù)切片，觀察方便，能長期保存。適用于藥材鑒定研究工作。以上各臨時裝片均可按規(guī)定和制備方法制成永久性的石蠟切片。標題中藥材及其制劑顯微鑒定法頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號SOI—QC—058—01頁次：2/103.儀器和用具儀器生物光學(xué)顯微鏡、鏡臺測微尺、離心機。3.2.用具放大鏡、刀片、解剖刀、鑷子、剪、解剖針。3.2.2.載玻片、蓋玻片。吸濕器、培養(yǎng)皿或小燒杯、酒精燈、鐵三角架、石棉網(wǎng)、滴瓶、試管、試管架、滴管、玻璃棒、乳缽、量筒等。毛筆、鉛筆、帶蓋搪瓷盤、紗布、吸水紙、火柴等。4.試液及配制水合氯醛試液取水合氯醛50g加水15ml與甘油10ml使溶解，即得。此液為透化劑，可使干縮的細胞壁膨脹而透明并，能溶解淀粉粒、樹脂、蛋白質(zhì)及揮發(fā)油。甘油醋酸試液（斯氏液）取甘油、50%醋酸與水各等份混，合即得。此液專用于觀察淀粉粒形態(tài)可，使淀粉粒不膨脹變形便，于測量其大小。甘油－乙醇液取甘油1份，50％乙醇1份，混合即得。此液為封藏液，用于保存植物配料及臨時切片，有軟化組織的作用。蘇丹III試液取蘇丹III0.01g加90%乙醇5ml溶解后，加甘油5ml搖勻即得。本液應(yīng)置棕色玻璃瓶內(nèi)保存，2個在月內(nèi)應(yīng)用。釘紅試液取10%醋酸鈉溶液一2ml,加釘紅適量使呈酒紅色即得，本液應(yīng)臨用時新配。間苯三酚試液取間苯三酚1g,加90%乙醇100m,使溶解，濾過即得。應(yīng)置棕色玻璃瓶內(nèi)，在暗處保存。此液與濃鹽酸合用，可使木化細胞染成紅色或紫紅色。碘試液取碘化鉀）.5g溶于少量水中加碘1g,使溶解加水至00ml即得。硝酸鉻試液取硝酸鉻10m,加入100ml水中，混勻。另取鉻酸10g加水100ml使溶解。用時二液等份混合，即得。此液為常用的“植物組織解離液”。檢品的解離浸泡時間，依材料的質(zhì)地不同而異。a—萘酚試液取15%的a—萘酚乙醇溶液0.5ml緩緩加入硫酸6.5m，混勻后再加乙醇0.5ml及水4ml混勻即得。標準操作規(guī)程標題中藥材及其制劑顯微鑒定法頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號SOLQC—058—01頁次：/10硝酸汞試液（米隆氏試液取汞4.5g加發(fā)煙硝酸ml,待作用完畢，加等量水稀釋即得本。液應(yīng)置棕色玻璃塞瓶內(nèi)在暗處保存。用于檢查糊粉粒，染成磚紅色。氯化鋅碘試液取碘化鉀8g,加入8.5ml水使溶解，再加無水氯化鋅2.5g使溶解，加碘適量至飽和即得。本液應(yīng)置棕色玻璃瓶塞內(nèi)用于檢查木質(zhì)化與纖維素細胞壁，前者顯黃棕色，后者顯藍色或紫色。5.顯微標本片的制做切片（橫片或縱片）5.1.1.藥材的預(yù)處理先將藥材表面泥沙刷洗干凈將應(yīng)觀察的部位，切成大小適當(dāng)?shù)膲K或段一般以寬1cm長3cm為宜，厚10?20um,切面削平整。質(zhì)地軟硬適中的藥材可直接進行切片。質(zhì)地堅硬的則須先使其軟化后再切片。軟化方法可放在吸濕（器即干燥器底部盛蒸餾水并滴數(shù)滴苯酚防霉，上部瓷板上置藥材樣品吸濕）中悶潤，或在水中浸軟。有些根、根莖、莖及木類藥材，質(zhì)地雖堅實，可將削平的切面浸水中片刻表面潤濕時取出，直接切片也能切成較完整的薄片過。于柔軟的材料，可將其浸入70％－95％乙醇中，約20min后可變硬些，即可進行切片。對于細小、柔軟而薄的藥材，如種子或葉片，不能直接手持切片，種子類可置軟木中塞或橡膠片中（一側(cè)切一窄縫，將種子嵌入其中）葉類藥材可用質(zhì)地松軟的通草或向日葵的莖髓作夾持物進行切片藥。材在預(yù)處理時應(yīng)注意不能影響要觀察的顯微鑒別特征。徒手切片具有操作簡便、迅速，方便，制成片能保持其內(nèi)含物的固有特征，便于進行各種顯微化學(xué)反應(yīng)觀察的特點，是顯微鑒別中最為常用的方法。切片右手持刀片，左手拇指和食指關(guān)節(jié)夾持藥材，中指托著藥材的底部，使藥材略高出食拇二指肘關(guān)節(jié)應(yīng)固定，使材料的切面保持水平，刀口向內(nèi)并使刀刃自左前方向右后方切削，即可切得薄片。操作時，材料的切面須經(jīng)常加水或50％乙醇保持濕潤，防止切片粘在刀片上切。好的切片用毛筆蘸水輕輕從刀片上推入盛有水5或0％乙醇的培養(yǎng)皿中。徒手圓筒生物切片器切片將藥材用通草或軟木夾持，固定于切片器持物筒中；具有一定硬度的藥材可直接固定于持物筒中；左手持切片器，拇指與小拇指持底盤的邊緣，食指端頂動中柱上的固定螺帽，使切片整體方向不變，以保持材料的切片方向固定；右手持刀片，刀柄靠于拇指與食指部，標題中藥材及其制劑顯微鑒定法頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號SOP^QC-058-01頁次：4/10食指與中指輕壓于刀片的上面，刀片平貼于刀片器圓臺上，由左上方至右下方迅速滑動，切下的切片用毛筆沾水取下置盛水的培養(yǎng)皿中。裝片選取薄而平整的切片置載玻片上，根據(jù)所要觀察的內(nèi)容要求，滴加適宜的試液1~2滴，蓋好蓋玻片，即可在顯微鏡下觀察。如加水合氯醛試液透化，將切片移載玻片上滴1~加2滴水合氯醛試液，在酒精燈上微微加熱，至邊緣起小泡即停止加熱，繼續(xù)補充試液再加熱，以不燒干為度，直至透化完全為止；加熱溫度不能過高，以防水合氯醛試液沸騰，使組織內(nèi)帶入氣泡，加熱時應(yīng)將載玻片不斷移動，不宜對準一處燒，以免受熱不勻而炸裂，透化后放冷，加甘油乙醇試1液~2滴后加封蓋片，貼上標簽，冬日室溫較低時，透化后不待放冷即加甘油乙醇試液，以防水合氯醛試液結(jié)晶析出而防礙觀察。水合氯醛試液有潔凈作用，并能使已收縮的細胞膨脹，能清楚觀察組織構(gòu)造，可溶解淀粉粒、蛋白質(zhì)、葉綠素、揮發(fā)油、樹脂等，對草酸鈣結(jié)晶無作用，為觀察草酸鈣結(jié)晶的良好試劑。如需觀察菊糖等一些多糖物質(zhì)則加水合氯醛試液不加熱?；咔衅瑱C切片此法不需要較高的技巧，只要了解掌握操作方法，短期內(nèi)即可學(xué)會并切出較薄的切片，適用于質(zhì)地堅實、形狀較大的藥材切片。柔軟的材料經(jīng)冷凍處理后便可切得較薄的的切片。材料制備經(jīng)軟化處理的材料，檢查軟化是否合適，可用刀片切割材料，若較容易切下薄片，則軟化適宜。柔軟的藥材可直接用胡蘿卜或土豆作夾持物。新鮮材料則直接浸入石蠟中，使材料外面包上一層石蠟。切片機調(diào)試及材料安裝切片前，先安裝好要片機使穩(wěn)固，進行調(diào)試檢查。將切片刀夾持在夾刀器上夾緊，調(diào)整刀的角度0（0~約150）；調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器至所需厚度。把制備好的材料用兩塊軟木塞夾住或直接放在切片機的材料固定器上夾正，使材料露出軟木塞或固定器上端cm調(diào)整好材料高度，使刀機刀刃靠近材料的切面，使材料切面與刀刃平等并略高于刀刃約0.5~1mm。切片用右手所握夾刀器柄。往操作者方向迅速拉動，便切下切片，且附著于刀的表面上，用毛筆蘸水把切片取下放入盛水的培養(yǎng)皿中。將刀推回原處，轉(zhuǎn)動厚度推進器，用毛筆蘸水潤濕材料切面及刀刃，再拉切片刀，往返推動，可得到許多厚度均勻完整的切片。若切片不成功，應(yīng)檢查切片刀是否太鈍，則應(yīng)磨刀或換鋒銳的切片刀，若切得太薄而破碎，則逐漸增標準操作規(guī)程標題中藥材及其制劑顯微鑒定法頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號SOLQC—058—01頁次：/10加厚度至切得完整的薄片為度。注意：夾持在材料固定器上的材料切面接近于固定上端時，必須注意防止切片刀刃碰撞固定器而損毀切片刀。裝片為防止切片彎曲可，選取理想的切片用，兩張載玻片夾住，浸于水中4小時使材料壓平，放入95％乙醇中固定，甘油裝片觀察。粉末標本片的制做主要用于粉末狀的藥材及藥材粉末制成的成方制劑觀察。粉末制備藥材要先干燥，磨或挫成細粉，裝瓶，貼上標簽。粉末制備時，注意取樣的代表性和全面性如，根要切取根頭、根中及根尾等部位，必須全部磨成粉，不得丟棄渣頭。并需4過號篩，混合均勻。干燥時，一般不能超過60°C,避免經(jīng)受高溫，使淀粉粒糊化，難以觀察其完整者。制片法用解剖針挑取粉末少許置，載玻片的中央位置加，適宜的試液1滴，用針攪勻（如為酸或堿時應(yīng)用細玻璃棒代替，針待）液體滲入粉末時，用左手食指與拇夾持蓋片的邊緣，使其與左側(cè)藥液層接觸，再用右手持小鑷子或解剖刀托住蓋玻片的右側(cè)，輕輕下放，則液體逐漸擴延充滿蓋玻片下方，如液體未充滿蓋玻片，應(yīng)從空隙相對邊緣滴加液體，以防產(chǎn)生氣泡；若液體過多，用濾紙吸去溢出的液體，最后在載玻片的左端貼上標簽或做上標記。中藥成方制劑的鑒別散劑、膠囊劑，可直接取粉末裝片或透化裝片；片劑，可取2~3片研細后，取粉末適量裝片或透化裝片；5.2.3.3.水丸劑，可取數(shù)粒丸置乳缽中（若系包衣水丸，可刮去包衣）研細，取粉末適量裝片或，取粉末適量置小容器內(nèi)加，水合氯醛試液透（化加適量甘油以防水合氯醛結(jié)晶析出，）攪勻，用吸管吸取混懸液裝片。5.2.3.4.蜜丸劑樣品可用二種方法處理（1）用解剖刀沿蜜丸正中切開，從切面由外至內(nèi)刮取少許樣品，置載玻璃片中央偏右，滴加適宜的試液，用玻璃棒攪勻。按上述粉末制片法制片，或透化裝片。（2）將樣品切碎放入容器加，水?dāng)嚢柘礈欤缓笾秒x心管中離心沉淀，如此反復(fù)以除盡蜂蜜后，取沉淀或透化后裝片。含揮發(fā)油性成分的制劑，取其粉末進行微量升華裝片。標題中藥材及其制劑顯微鑒定法頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號SOP^QC-058-01頁次：6/105.2.4.粉末制片的注意事項粉末加液體攪拌及加蓋處理時容易產(chǎn)生氣如泡用。水或甘油裝片時，可先加少量乙醇使其潤濕，可避免或減少氣泡的形成，或反復(fù)將蓋片沿一側(cè)輕抬，可使多數(shù)氣泡逸出。攪拌時產(chǎn)生的氣泡可隨時用針將其移出。裝片用的液體如易揮發(fā)應(yīng)，裝片后立即觀察用，水裝片也較易蒸發(fā)而干涸，通常滴加少許甘油可延長保存時間。5.2.4.3需用水合氯醛試液透化時應(yīng)，注意掌握操作方法裝，片后用手執(zhí)其一端，保持水平置小火焰上約Ecm處加熱，并緩緩左右移動使之微沸，見氣泡逸出時離開火焰，待氣泡停止逸出，再放在小火上，并隨時補充蒸發(fā)的試液，如此反復(fù)操作，直至粉末呈透明為止，放涼后滴加甘油鏡檢。5.2.4.4.粉末藥材制片時，每片取用量宜少不宜多為，使觀察方便，可多做些制片。如取量多，顯微特征單一輪廓不清，反而費時，不易得出準確結(jié)論。中藥制劑的粉末檢查，因在多味藥材粉末中尋找某一味藥材某一顯微特征，有時較難查見，可以取粉末量多些，置試管或小燒杯中，加入水合氯醛試液，加熱透化。透化好后再用吸管吸出，滴在載玻片上，加蓋玻片，即可觀察。表面標本片的制做主要用于葉類、花類（萼片、花、瓣果）實、草質(zhì)莖及鱗莖等藥材的表面特征如毛茸、氣孔、表皮細胞等的觀察。質(zhì)地菲薄的藥材可以整體裝片；較厚的藥材則須撕下表皮然后裝片。1.整體裝片適用于較薄的葉類、萼片和花瓣。剪取欲觀察部位約4mm2的兩小片，一反一正放在載玻片上，加水合氯醛試液，加熱透化至透明為至，蓋好蓋玻片即得。另法，剪取欲觀察薄片8mm2，置試管中加水合氯醛試液，加熱透化，然后移至載玻片上，切成相等兩部分，將其中一片反過來，與另一片并列，再加1~2滴封藏液，蓋好玻片即得。表面撕離裝片凡較厚的或新鮮藥材用，上法不能使之透化或不便于整體裝片。將軟化了的或新鮮材料固定住，然后用鑷子夾住要剝?nèi)∷弘x的部分，小心的撕離，或用解剖刀輕輕割（刮）去不需要的各層組織，只保留表面層（上層或下層，）將欲觀察的表皮表面朝上置，載玻片上，加透化劑透化后，放冷，加稀甘油1滴，貼上標簽，即得。標準操作規(guī)程標題中藥材及其制劑顯微鑒定法頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號SOP^QC-058-01頁次：7/10解離組織片制做適用厚壁組織或輸導(dǎo)組織的單個細胞的顯微觀察。將樣品切成段（長約mm寬約2mm）或片（厚約1mm）,對于木類或莖類木質(zhì)，最好切成縱長的小段，然后根據(jù)細胞壁的性質(zhì)，按照下列方法之一進行處理；如樣品堅硬，木化組織較多或集成較大群束，可用硝鉻酸法或氯酸鉀法；對于薄壁組織占大部分，木化組織少或分散存在的樣品，可用氫氧化鉀法。氫氧化鉀法置樣品于試管中，加1%氫氧化鉀溶液2?3m,加熱至用玻璃棒擠壓能離散為止，傾去堿液，用水洗滌后，取出少量，置載玻片上，用解剖針撕開，以稀甘油裝片觀察。硝鉻法置樣品于小杯中，加20%硝酸與20%鉻酸的等量混合液適量，浸沒樣品，旋轉(zhuǎn)約30?60分鐘，堅硬的樣品需時要長些，也可在水浴上微溫，至用玻璃棒擠壓能離散為止，傾去酸液，用水洗滌后，取出少量，置載玻片上，用解剖針撕開，以稀甘油裝片觀察。氯酸鉀法置樣品于試管中加硝酸溶液（1?2mD及氯酸鉀少量，緩緩加熱，待產(chǎn)生的氣飽和時，再及時加入氯酸鉀少量，以維持氣泡穩(wěn)定地發(fā)生，至用玻璃棒擠壓能離散為止。傾去酸液，用水洗滌后，撕開，封藏。注意事項用氯酸鉀法制片時，每次加入的氯酸鉀不可過多加，熱溫度不宜過高，否則突沸容易使液體逸出管外。加熱時間長短因樣品的硬度和木化程度而異，通常約需5?15分鐘。操作過程中產(chǎn)生的氯氣有毒，應(yīng)注意通風(fēng)。用硝鉻酸法解離也可在載玻片上進行。即取一塊厚度適當(dāng)?shù)那衅?，置載玻片上，滴加氯硝鉻酸液使之浸沒放，置約20分鐘，輕輕壓下或移動蓋片使之分離，其余操作同前，此法解離的細胞，可以看清其分離的組織部位。花粉粒與孢子片制做取花粉、花藥（或小的花）或孢子囊群（干燥樣品浸于冰醋酸中軟化，）用玻璃棒搗碎，紗布過濾，濾液置離心試管中離，心，取沉淀加新配制的醋酐與硫酸:1）的混合液1?3m,置水浴上加熱2?3分鐘，離心，取沉淀，用水洗2滌次，加50%甘油與1%苯酚3?4滴，用品紅甘油膠封藏觀察也。可直接用水合氯醛試液裝片具，體操作同粉末標本片。磨片凡需要觀察斷面以，一般切片法無法制做的標本如，堅硬的動物藥材珍珠、石決明、動物骨骼、礦物藥材等可采用磨片法。片的厚度一般為20~50um。磨片方法有手工磨制與機器磨制。標題中藥材及其制劑顯微鑒定法頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號SOLQC—058—01頁次：8/105.6.1手工磨片選取合適的材料一般以1?2mm為度,先置粗磨石（或磨砂玻璃）上，加適量水，用食指、中指夾住材料，在磨石上往返研磨，待兩面磨均勻，厚度約數(shù)百m后，改用軟木塞壓在上面，再在細磨石上加水磨，磨至透明時20?50um）,用水沖洗，再用5%乙醇圭寸藏。5.6.2.機器磨制地質(zhì)礦產(chǎn)部門有專門人員機構(gòu)與設(shè)備制做。6.顯微測量顯微鑒定時應(yīng)用測量方法以細胞內(nèi)含物等的大小，應(yīng)用最多的是長度測量，常用的是目鏡測微尺與載物臺測微尺。目鏡測微尺又稱目鏡量尺或目鏡尺它。是在目鏡內(nèi)的一種標尺是，一個直徑18?20mm圓形玻璃片，中央刻有精確等距的平行線刻度，常為或100條。目鏡測微尺是用以直接測量物體的，但其刻度所代表的長度是根據(jù)顯微鏡放大倍數(shù)不同而改變，故使用前必須用載物臺測微尺來標化。載物臺測微尺又稱鏡臺測微尺或臺微尺。它是一種特制的載玻片，中央粘有一小圓形玻片上刻有將1mm（或2mm）精確等分為100（或200）小格的細線，每一小格長為um，它是用以標化目鏡測微尺的。6.3目鏡測微尺的標化以確定使用同一顯微鏡及特定的物鏡目、鏡和鏡簡長度時，目鏡測微尺上每一格所代表的實際長度。標化方法將載物臺測微尺置于顯微鏡臺上按，常規(guī)對光調(diào)焦并，移動測微尺象于視野中央；從鏡簡中取下目鏡，旋下接目鏡的鏡蓋，將目鏡測微尺放入目鏡簡中部的光欄上（應(yīng)正面向上）旋上目鏡蓋后返置鏡簡上，此時在視野中，除鏡臺測微尺的象外，還同時可觀察到目鏡測微尺的分度小格，移動鏡臺測微尺和旋轉(zhuǎn)目鏡，使兩種量尺的刻度平行。左邊0”的刻“度重合，尋找第二條重合刻度。記錄兩刻度的讀數(shù)，并根據(jù)比值計算出目鏡測微尺每小格在該物鏡條件下所相當(dāng)?shù)拈L度m）例如：接目鏡頭為0X，接物鏡為40X時，目鏡測微尺每7小格相當(dāng)于載物臺測微尺小格，則目鏡測微尺每小格的長度為X10umF17=2.35umo測定細胞及細胞內(nèi)容物的方法將載物臺測微尺取下?lián)Q以裝有待測的標本片對光、調(diào)焦，移動載片，使需測量的目的物置于目鏡測微尺范圍內(nèi)，調(diào)清物象，計數(shù)出目的物占測微尺的小格數(shù)，乘以目鏡測微尺每一小格的長度值即得。標準操作規(guī)程標題中藥材及其制劑顯微鑒定法頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號SOP^QC-058-01頁次：9/10計算公式：待測物長度（pm）=x所測物體占有目鏡測微尺的格數(shù)待測物長度（pm）=x所測物體占有目鏡測微尺的格數(shù)例如：則得淀粉粒長20小格，每小格長2.35um,20X2.35um=47um注意事項測量通常是在高倍鏡下進行因，目鏡量尺的每一小格的長度較大，結(jié)果較為準確。但如測量較長的物體如纖維、非腺毛等時，則在低倍鏡下較為方便。6.5.2.每次測量記錄下數(shù)據(jù)并分析數(shù)據(jù)最小值、最大值和多見值卩m）。如浙貝母淀粉粒直系J6~56um,表示最小值和最大值如為6?40?56um,中間的數(shù)值表示多見值。測量直徑時，應(yīng)以物體中部為準。目鏡測微尺所代表的長度隨不同目鏡與物鏡配合而異，因此在檢驗時，應(yīng)將專用的目鏡測微尺，在所用顯微鏡不同倍數(shù)的目鏡與物鏡組合后進行測量其長度值全，部測量后記載于檢驗記錄或?qū)?shù)值貼在顯微鏡鏡座上，備用。測量時，如有大小與規(guī)定有差異時，允許有少數(shù)略高于或略低于規(guī)定的數(shù)值。顯微鑒別法注意事項粉碎用具用畢后，必須清理干凈，干燥后才能使用于另一藥材。所用蓋玻