克隆文庫(kù)的分析精品課件

克隆文庫(kù)分析

2021/4/171內(nèi)容文庫(kù)評(píng)價(jià)序列的拼接載體去除嵌合子去除BLAST比對(duì)RDP歸類系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建序列提交2021/4/172文庫(kù)評(píng)價(jià)文庫(kù)評(píng)價(jià)：主要是指對(duì)構(gòu)建的克隆文庫(kù)中酶切的克隆子個(gè)數(shù)是否能夠代表整個(gè)環(huán)境絕大多數(shù)微生物類群，以及如何科學(xué)性的進(jìn)行選擇酶切克隆子數(shù)。2021/4/173酶切克隆子個(gè)數(shù)選擇策略單文庫(kù)：每次以100個(gè)克隆為基數(shù)進(jìn)行酶切，切完后對(duì)庫(kù)中只出現(xiàn)一次的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，簡(jiǎn)單計(jì)算其所占比重，覆蓋率達(dá)到80%左右即可。多文庫(kù)：每次以50個(gè)克隆為基數(shù)進(jìn)行酶切，分別進(jìn)行計(jì)算覆蓋率，其中任何一個(gè)達(dá)到60%左右即可。2021/4/174例.單個(gè)文庫(kù)可以盡量的選擇到曲線變的平滑階段，2021/4/175例.多個(gè)文庫(kù)對(duì)比性的去取，其中任何一個(gè)樣品若出現(xiàn)有變得緩慢即可停止。2021/4/176稀有度曲線分析采用EstimateS8.0軟件進(jìn)行稀有度分析。(/estimateS)軟件使用如下：2021/4/177數(shù)據(jù)錄入文庫(kù)名稱OTUs數(shù)：首行為總個(gè)數(shù)酶切的克隆個(gè)數(shù)：首行寫總個(gè)數(shù)，次行從1開(kāi)始按自然數(shù)排列格式行：此行全部為寫為1格式行：此行全部為寫為-1，表示結(jié)束2021/4/178軟件操作2021/4/1792021/4/17109、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:38:02PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個(gè)人炫耀什么，說(shuō)明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3結(jié)果2021/4/1712稀有度曲線制作以individuals為橫坐標(biāo)，Sobs為縱坐標(biāo)在Excel中作曲線。2021/4/1713稀有度曲線2021/4/1714序列拼接序列拼接：是指測(cè)序反應(yīng)將一個(gè)長(zhǎng)度大于1000bp的序列分別于兩端進(jìn)行測(cè)序所得的兩個(gè)序列進(jìn)行拼接在一起。使用軟件contig2021/4/1715軟件操作測(cè)序返回的結(jié)果ab1格式的文件是指帶有測(cè)序峰圖的序列文件，序列拼接首選該文件。2021/4/17162021/4/17172021/4/17182021/4/1719載體去除由于測(cè)序常常使用的是載體上的序列，因此需要將所測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行去載體。載體的去除，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的sequenceanalysis中的vecscreen./2021/4/1720載體去除2021/4/17212021/4/17222021/4/1723嵌合子剔除運(yùn)用CHECK_CHIMERA(http://wdcm.nig.ac.jp/RDP/cgis/chimera)對(duì)測(cè)序所得的細(xì)菌16SrRNA基因序列進(jìn)行嵌合子序列的檢查和剔除

2021/4/1724BLAST序列比對(duì)登錄NCBI主頁(yè)（/）選擇BLAST然后選擇2021/4/1725BLAST序列比對(duì)輸入序列輸入菌株編號(hào)2021/4/1726比對(duì)結(jié)果2021/4/1727比對(duì)結(jié)果處理對(duì)比對(duì)得到的結(jié)果進(jìn)行處理：建立一個(gè)word文檔將相似性較高的序列復(fù)制粘貼進(jìn)文檔。如圖這樣做的目的是能夠快速，方便的對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行選擇。2021/4/1728標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇：根據(jù)自己未來(lái)所要寫的文章的內(nèi)容的論據(jù)來(lái)進(jìn)行選擇。由于克隆文庫(kù)所得的序列大部分為不可培養(yǎng)類群，因而標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇要選取與你環(huán)境相似，并且在分類上具有較為詳細(xì)的分類的菌株。總體標(biāo)準(zhǔn)：盡量選擇具有相似性高的純培養(yǎng)菌。2021/4/1729RDP歸類克隆文庫(kù)所得序列往往是一些不可培養(yǎng)類群，因而很難確定其具體分類地位，因此選擇使用RDPClassifer在線歸類系統(tǒng)。（/index.jsp）2021/4/1730RDP歸類2021/4/1731RDP歸類輸入序列2021/4/1732RDP分類置信度調(diào)至95%此處為具體分類，但需要進(jìn)一步的看歸類的置信度2021/4/1733RDP分類帶有置信度的分類重新開(kāi)始點(diǎn)此處2021/4/1734系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建：目的是用于對(duì)克隆序列進(jìn)行進(jìn)一步的精確地歸類。注意事項(xiàng)：1）克隆的序列不能有反向序列（主要是測(cè)序時(shí)產(chǎn)生的）2）標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇（盡量選擇具有具體種屬信息的序列，或者相似環(huán)境下的序列）3）對(duì)樹(shù)要多計(jì)算幾次來(lái)評(píng)估樹(shù)的穩(wěn)定性。2021/4/1735系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建如何判斷序列是反向序列：1）第一種：在BLAST序列比對(duì)時(shí)對(duì)自己的序列與網(wǎng)上的序列進(jìn)行比較看你們的序列是否是從小到大排列對(duì)應(yīng)的（也就是說(shuō)你的序列是8F應(yīng)該對(duì)應(yīng)的是別人的8F或者小的）2）第二種：預(yù)先將所有的序列構(gòu)建一次系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如果有出現(xiàn)進(jìn)化距離特別遠(yuǎn)的序列，該序列為反向序列的可能非常大。2021/4/1736此處序列為反向序列2021/4/1737反向序列修正2021/4/1738系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建使用軟件MEGA4.0。具體方法參考《進(jìn)化樹(shù)制作過(guò)程》。2021/4/1739序列提交序列提交目的是為了獲得Genebank登錄號(hào)，一般的文章都需要并且非常重要。序列提交首先要使用軟件sequin進(jìn)行編輯。其次將編輯好的序列用郵件發(fā)送至Genebank編輯郵箱，一星期左右就會(huì)得到序列登錄號(hào)。2021/4/1740序列編輯首先將確定分類的序列進(jìn)行編輯，可以將同類（同門）菌株放入同一個(gè)文件夾。格式：建立一個(gè)*.TXT的文檔，里面鍵入的格式如圖。2021/4/1741>sw-xj83[organism=unculturedactinobacterium][strain=sw-xj83]unculturedactinobacteriumclonesw-xj8316SribosomalRNAgenesequence.序列另起一行頂格輸入2021/4/1742Sequin序列編輯選擇所提交的數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)始提交2021/4/1743輸入一個(gè)名字，名字可以是你未來(lái)要發(fā)表文章的名字或者也可以填寫Directsubmission。2021/4/1744輸入名字，郵件電話等，此步很重要！2021/4/1745若每次只提交一個(gè)序列可以選擇這個(gè)選項(xiàng)此處為批量提交2021/4/1746此處導(dǎo)入序列2021/4/17472021/4/17482021/4/1749此處可以忽略此處必須進(jìn)行修訂，雙擊點(diǎn)擊進(jìn)行修訂2021/4/1750出現(xiàn)錯(cuò)誤基本是此處缺失序列的具體分類信息，點(diǎn)擊lineage2021/4/1751添加完分類信息后點(diǎn)擊此處若無(wú)任何問(wèn)題按上述地址發(fā)郵件2021/4/1752謝謝2021/4/17539、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:38:02PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/