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文檔簡介
實時熒光定量PCR技術
RealTimeQuantitativePCR南開大學醫(yī)學院lfnnLogo
RT-qPCR原理Contents1
RT-qPCR步驟2
SYBR實驗步驟3LogoRT-qPCR原理1定義:在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化,最后通過通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析的方法。1.熒光原理:SYBRGreen2.定量原理:(1)介紹三個概念:擴增曲線、熒光閾值、Ct值(2)定量原理:
絕對定量(標準曲線)、相對定量(2-ΔΔCt)
(3)融解曲線非特異性熒光標記:
1、SYBRGreen
結合于雙鏈DNA小溝之間,只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光。(在變性過程中無熒光,在復性及延伸過程中發(fā)出熒光)RT-qPCR原理---熒光原理特異性熒光標記:
1、TaqMan
水解型雜交探針。5′端標記有報告基團R,3′端標記有熒光淬滅基團Q。探針完整,R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收,無熒光。Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性,可水解探針R與Q分開,發(fā)出熒光。
2、MolecularBeacon
分子信標。標記熒光的發(fā)夾探針,環(huán)與目標序列互補,莖由互補配對序列組成。變性過程:產生非特異性熒光;延伸過程:不產生熒光;退火過程:產生特異性熒光,檢測熒光信號。
3、Amplisensor
雙鏈信號引物,進行半巢式擴增;隨著PCR循環(huán)的重復進行,信號引物的雙鏈結構被破壞,其中一條鏈參與到產物的合成中,熒光消失,產物量與熒光成反比。QQRLogoRT-qPCR原理----定量原理1擴增曲線圖:橫坐標:擴增循環(huán)數(Cycle)縱坐標:熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集Ct值的定義:PCR擴增過程中,擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環(huán)次數。Ct值極具重現性。分析定量時多取15-35較好。熒光信號閾值(threshold):前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號(baseline),即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值。熒光域值的缺省設置是3~15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。LogoRT-qPCR原理----定量原理1理想的PCR反應:
X=X0*2n非理想的PCR反應:
X=X0(1+Ex)nn:
擴增反應的循環(huán)次數X:
第n次循環(huán)后的產物量
X0:初始模板量
Ex:擴增效率
logX0=-log(1+Ex)*Ct+log
X
Log濃度與循環(huán)數呈線性關系,根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量.1.絕對定量LogoRT-qPCR原理----絕對定量1模板DNA量越多,熒光達到域值的循環(huán)數越少,即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數呈線性關系,通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,根據樣品Ct值,就可以計算出樣品中所含的模板量1.絕對定量LogoRT-qPCR原理----絕對定量1R2為相關系數:R2>0.99時,認為兩數值之間相關性好。E為擴增效率:一般認為在90%-110%之間數據可用。LogoRT-qPCR原理----相對定量12.相對定量病人內參基因病人目的基因對照內參基因對照目的基因Ctabcd結果表示病人的目的基因的表達是對照組目的基因表達的多少倍。RT-qPCR原理----融解曲線溫度熒光強度TmTm值:DNA解鏈一半時的溫度將溫度與熒光強度的變化求導。(-dI/dT)融解曲線為單一峰,無非特異性熒光,定量準確。溶解峰反映反應中擴增到的產物的量。前面雜峰較多時可能原因為樣品未混勻。RT-qPCR步驟----SYBRGreen法1.準備物品:檢測樣本、內參、引物、熒光染料、八連管、移液槍、Realplex軟件2.將樣本等稍許離心3.加樣(可將所有共同物質加入同一管中,混勻后分散入其他管中)
反應體系:ddH2O10μL染料8μL引物上下游各0.5μL樣本1μL4.將八連管標記后離心至無壁掛液體5.將其置入Realplex儀中,
設置程序:95℃15s95℃15s57℃30s74℃30s45循環(huán),END后右鍵設置“insert---meltingcurve”,后綠色運行6、反應結束后將數據導出,分析數據。反應體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性,太低,熒光信號太弱,不易檢測Primer:引物的特異性高,否則擴增有雜帶,定量不準MgCl2(多聚酶的激活劑)濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產物反應Buffer體系的優(yōu)化反應溫度和時間參數:由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同RT-qPCR步驟----SYBRGreen法對DNA模板沒
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