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文檔簡介
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)
RealTimeQuantitativePCR南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院lfnnLogo
RT-qPCR原理Contents1
RT-qPCR步驟2
SYBR實(shí)驗(yàn)步驟3LogoRT-qPCR原理1定義:在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,最后通過通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。1.熒光原理:SYBRGreen2.定量原理:(1)介紹三個(gè)概念:擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值(2)定量原理:
絕對(duì)定量(標(biāo)準(zhǔn)曲線)、相對(duì)定量(2-ΔΔCt)
(3)融解曲線非特異性熒光標(biāo)記:
1、SYBRGreen
結(jié)合于雙鏈DNA小溝之間,只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。(在變性過程中無熒光,在復(fù)性及延伸過程中發(fā)出熒光)RT-qPCR原理---熒光原理特異性熒光標(biāo)記:
1、TaqMan
水解型雜交探針。5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)R,3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)Q。探針完整,R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收,無熒光。Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性,可水解探針R與Q分開,發(fā)出熒光。
2、MolecularBeacon
分子信標(biāo)。標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針,環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ),莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成。變性過程:產(chǎn)生非特異性熒光;延伸過程:不產(chǎn)生熒光;退火過程:產(chǎn)生特異性熒光,檢測熒光信號(hào)。
3、Amplisensor
雙鏈信號(hào)引物,進(jìn)行半巢式擴(kuò)增;隨著PCR循環(huán)的重復(fù)進(jìn)行,信號(hào)引物的雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞,其中一條鏈參與到產(chǎn)物的合成中,熒光消失,產(chǎn)物量與熒光成反比。QQRLogoRT-qPCR原理----定量原理1擴(kuò)增曲線圖:橫坐標(biāo):擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Cycle)縱坐標(biāo):熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集Ct值的定義:PCR擴(kuò)增過程中,擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。Ct值極具重現(xiàn)性。分析定量時(shí)多取15-35較好。熒光信號(hào)閾值(threshold):前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)(baseline),即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值。熒光域值的缺省設(shè)置是3~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。LogoRT-qPCR原理----定量原理1理想的PCR反應(yīng):
X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng):
X=X0(1+Ex)nn:
擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X:
第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量
X0:初始模板量
Ex:擴(kuò)增效率
logX0=-log(1+Ex)*Ct+log
X
Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系,根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量.1.絕對(duì)定量LogoRT-qPCR原理----絕對(duì)定量1模板DNA量越多,熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少,即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系,通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品Ct值,就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量1.絕對(duì)定量LogoRT-qPCR原理----絕對(duì)定量1R2為相關(guān)系數(shù):R2>0.99時(shí),認(rèn)為兩數(shù)值之間相關(guān)性好。E為擴(kuò)增效率:一般認(rèn)為在90%-110%之間數(shù)據(jù)可用。LogoRT-qPCR原理----相對(duì)定量12.相對(duì)定量病人內(nèi)參基因病人目的基因?qū)φ諆?nèi)參基因?qū)φ漳康幕駽tabcd結(jié)果表示病人的目的基因的表達(dá)是對(duì)照組目的基因表達(dá)的多少倍。RT-qPCR原理----融解曲線溫度熒光強(qiáng)度TmTm值:DNA解鏈一半時(shí)的溫度將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)融解曲線為單一峰,無非特異性熒光,定量準(zhǔn)確。溶解峰反映反應(yīng)中擴(kuò)增到的產(chǎn)物的量。前面雜峰較多時(shí)可能原因?yàn)闃悠肺椿靹?。RT-qPCR步驟----SYBRGreen法1.準(zhǔn)備物品:檢測樣本、內(nèi)參、引物、熒光染料、八連管、移液槍、Realplex軟件2.將樣本等稍許離心3.加樣(可將所有共同物質(zhì)加入同一管中,混勻后分散入其他管中)
反應(yīng)體系:ddH2O10μL染料8μL引物上下游各0.5μL樣本1μL4.將八連管標(biāo)記后離心至無壁掛液體5.將其置入Realplex儀中,
設(shè)置程序:95℃15s95℃15s57℃30s74℃30s45循環(huán),END后右鍵設(shè)置“insert---meltingcurve”,后綠色運(yùn)行6、反應(yīng)結(jié)束后將數(shù)據(jù)導(dǎo)出,分析數(shù)據(jù)。反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性,太低,熒光信號(hào)太弱,不易檢測Primer:引物的特異性高,否則擴(kuò)增有雜帶,定量不準(zhǔn)MgCl2(多聚酶的激活劑)濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同RT-qPCR步驟----SYBRGreen法對(duì)DNA模板沒
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