熒光分析法(2010)課件

《儀器分析實驗》實驗5熒光光度法測定維生素B2含量一、分子熒光分析法簡介(對光的吸收)發(fā)生激發(fā)態(tài)反應分子內的激發(fā)和衰變過程1.1熒光的產生激發(fā)態(tài)能量的躍遷與轉化的形式和速率：A1,A2吸收:10-15sVR振動松弛：10-12sic內轉化：10-11sisc系間竄越：

10-6

~10-2sF熒光：10-9~10-6sP磷光：10-6~100s激發(fā)光譜發(fā)射光譜1.2熒光光譜

任何熒光化合物，都具有兩種特征的光譜：激發(fā)光譜(Excitation)和發(fā)射光(Emission)譜。組成、結構與衍化信息☆物質的化學結構☆環(huán)境與介質條件☆與其它溶質的相互作用☆反應動力學

任何熒光化合物，都具有兩種特征的光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。激發(fā)光譜：固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長發(fā)射光譜：固定激發(fā)波長掃描發(fā)射波長激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關系ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關系S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)1.3熒光定量IF----熒光強度F-----熒光量子產率（☆注意：在一定濃度范圍內適用）b--吸收光程--摩爾吸光系數C--熒光物質濃度εIF=2.30kφFI0εbcIF=KC?問題：1）影響相對熒光強度的因素有哪些？2）試比較熒光法與紫外-可見分光光度法的分析性能。1.4熒光儀的基本構造？問題：熒光光度計與紫外-可見分光光度計在光路設置上有什么不同？為什么？光源1.光源的要求：發(fā)射強度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強度隨波長的變化小有足夠長的使用壽命2.氙燈光源常用氣體放電燈類型：

氙燈光源高壓汞光源波長范圍：200~1000nm工作壓力：5~20atm啟動電壓：20~40KV使用壽命：1000~2000h最廣泛應用的連續(xù)光源：發(fā)射波長范圍寬發(fā)射光強度大單色器平面衍射光柵檢測器光電倍增管放大倍數：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109樣品池：液池、熒光池1.樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計的吸收池一樣2.吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計的吸收池兩面透光熒光分光光度計的樣品池四面透光波長范圍3.使用注意事項容易破碎問題：紫外-可見分光光度計的吸收池與熒光分光光度計的樣品池有什么區(qū)別？沾污問題紫外-可見分光光度計:光源樣品池單色器檢測器數據處理儀器控制熒光(磷光)分光光度計:光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數據處理儀器控制發(fā)射單色器紫外-可見分光光度計

測量池(吸收池)熒光分光光度計樣品池I0ItI0ItIF,p1.5分子熒光分析法的應用簡介★常規(guī)分析應用：

☆定性分析：φf；λex；λem；峰形等☆定量檢測：F=K﹒I0﹒φf﹒C☆其它（略）★高端生化研究：

☆分子相互作用研究；☆代謝動力學跟蹤；☆顯微成像（物理遷移與化學衍化的原位“顯跡”）維生素B2含量的熒光光度法測定標準曲線法將已知量的標準物經過和樣品同樣處理后，配制一系列的標準溶液，測其熒光強度，以熒光強度對熒光物質含量繪制標準曲線。測定樣品溶液的熒光強度后即可由標準曲線求出樣品溶液中熒光物質的含量。熒光分析的靈敏度比紫外－可見分光光度法高103～104.FCsFxCx實驗原理維生素B2的化學結構C17H20N4O6★在近中性的水溶液中有較強的熒光發(fā)射:（535nm附近）

★在堿性介質中不穩(wěn)定且熒光消失（pH=11）★易發(fā)生光降解，對熱穩(wěn)定實驗步驟１、試液配制：配制系列標準溶液取VB2標準溶液(5ug/ml)1.00ml,2.00ml,3.00ml,4.00ml,5.00ml于25ml比色管中,稀釋至刻度.2、樣品藥片的處理及未知液的配制取2片藥片置于洗凈的小燒杯中,加20-30ml去離子水中,水浴中加熱30min,冷至室溫后,轉移到250ml容量瓶中,稀釋至刻度.過濾,棄取初濾液,取0.5ml到25ml比色管中,稀釋至刻度.3、VB2的熒光光譜的繪制掃描激發(fā)波長和發(fā)射波長,找出最大激發(fā)波長和發(fā)射波長.4、標準工作曲線的制作及樣品測定固定激發(fā)波長和發(fā)射波長,測定每管標準溶液和樣品的熒光強度.2.3注意事項：☆試液的移取與稀釋☆系列標液的測定順序☆即放即測，防光降解☆熒光儀的開關機順序2.4數據處理從熒光光譜圖上讀出最大激發(fā)（λex）和發(fā)射波長（λem）用標準工作曲線法算出所配實測試液的濃度計算藥片中維生素B2的含量，并計算測定量占標示量的百分數日立F-2500型熒光光度計的使用“波長掃描”操作步驟

Start↓Methodsetting↓Samplename↓Pre-scan↓Measurement↓Dataprocessing↓Print↓EndMethod鍵的使用General→Measurement→WavelengthscanOperator→姓名(1)Instrument→Scanmode→Excitation(做激發(fā))Datamode→FluorescenceEMWL→523nmEXStartWL→300nmEXEndWL→500nmScanspeed→3000nm/minEXSlit→5.0nmEMSlit→5.0nmPMTVoltage→700V(2)Instrument→Scanmode→Emission(做發(fā)射)Datamode→FluorescencEXWL→354nmEMStartWL→360nmEMEndWL→700nmScanspeed→3000nm/minEXSlit→5.0nmEMSlit→5.0nmPMTVoltage→700VSamples→輸入樣品數→Updata→okPre-scan→按Pre-scan鍵Measurement→按Measurement鍵→Yes→okDataprocessing→顯示最大強度值Print→打印波長掃描圖↓“定量分析”操作步驟Method鍵的使用Start↓Methodsetting↓Samplename↓Measurement↓Print↓EndGeneral→saveas→存放文件地址Measurement→PhotometryOperator→姓名Quantitation→Quantitationtype→WavelengthCalibrationtype→1storderInstrument→Datamode→fluorescenceWavelengthmode→BothWLFixed

EX→370nmEM→523nmEX