常用儀器分析匯報(bào)

儀器分析匯報(bào)孫雁斌紅外光譜分析流式細(xì)胞儀激光掃描共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)光散射儀核磁共振波譜分析紅外光譜分析（IR）紅外光譜(InfraredSpectroscopy,IR)

又稱分子振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，屬分子吸收光譜。樣品受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時(shí)，分子吸收其中一些頻率的輻射，分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)引起偶極矩的凈變化，使振-轉(zhuǎn)能級(jí)從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，相應(yīng)于這些區(qū)域的透射光強(qiáng)減弱，記錄百分透過率T%對波數(shù)或波長的曲線，即紅外光譜。近紅外(倍、泛頻)中紅外遠(yuǎn)紅外波長/m0.75-2.52.5-2525-1000波數(shù)/cm-1

13333-40004000-400400-10躍遷類型分子振動(dòng)分子振動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)分子轉(zhuǎn)動(dòng)近紅外光譜區(qū)：低能電子能級(jí)躍遷含氫原子團(tuán)：-OH、-NH、-CH伸縮振動(dòng)的倍頻吸收峰稀土及過渡金屬離子配位化學(xué)的研究對象適用于水、醇、高分子化合物、含氫原子團(tuán)化合物的定量分析中紅外光譜區(qū)：分子的振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)基頻吸收光譜區(qū)應(yīng)用最為廣泛的紅外光譜區(qū)遠(yuǎn)紅外光譜區(qū)：氣體分子的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷液體與固體中重原子的伸縮振動(dòng)晶體的晶格振動(dòng)某些變角振動(dòng)、骨架振動(dòng)-異構(gòu)體的研究金屬有機(jī)化合物、氫鍵、吸附現(xiàn)象研究該光區(qū)能量弱,較少用于分析紅外光譜的應(yīng)用及特點(diǎn)：應(yīng)用：推斷分子的結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型；測定分子的鍵長、鍵角推斷化學(xué)鍵的強(qiáng)弱及極性；計(jì)算相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)等特點(diǎn)：能夠更為精細(xì)的表征分子結(jié)構(gòu)的差別；測定快速、靈敏度高、試樣用量少；能分析各種狀態(tài)的試樣，應(yīng)用范圍廣；與色譜等儀器聯(lián)用具有強(qiáng)大的定性功能色散型紅外光譜儀光源單色器吸收池樣品檢測器數(shù)據(jù)處理和儀器控制參比切光器（斬波器）硅碳棒檢測器光源單色器吸收池?cái)?shù)據(jù)處理儀器控制產(chǎn)生紅外吸收的條件輻射光子的能量應(yīng)與振動(dòng)躍遷所需能量相等。輻射與物質(zhì)間有偶合作用，產(chǎn)生偶極矩變化。峰數(shù)目——分子的振動(dòng)自由度振動(dòng)自由度=3N-（平動(dòng)自由度+轉(zhuǎn)動(dòng)自由度）線性分子：振動(dòng)自由度=3N-5非線性分子：振動(dòng)自由度=3N-6例：水分子吸收峰數(shù)目少于振動(dòng)自由度的原因：存在沒有偶極矩變化的振動(dòng)模式存在能量簡并態(tài)的振動(dòng)模式，即振動(dòng)頻率相同的峰重疊振動(dòng)吸收的強(qiáng)度小，儀器的分辨率分辨不出，從而檢測不到某些振動(dòng)模式所吸收的能量不在中紅外光譜區(qū)。吸收峰的位置及影響因素虎克定律：k：化學(xué)鍵的力常數(shù)，與鍵能和鍵長有關(guān)μ：雙原子的折合原子量任意兩個(gè)相鄰的能級(jí)間的能量差為：化學(xué)鍵鍵強(qiáng)越強(qiáng)，鍵的力常數(shù)k越大,原子折合質(zhì)量μ越小，化學(xué)鍵的振動(dòng)頻率越大，吸收峰將出現(xiàn)在高波數(shù)區(qū)。電子效應(yīng)：誘導(dǎo)效應(yīng)、吸電效應(yīng)；使吸收峰向高波數(shù)方向移動(dòng)（藍(lán)移）共軛效應(yīng)：n-共軛效應(yīng)（中介效應(yīng)），-共軛效應(yīng)（C效應(yīng)）；使吸收峰向低波數(shù)方向移動(dòng)（紅移）氫鍵效應(yīng)：分子內(nèi)氫鍵、分子間氫鍵；使吸收峰向低波數(shù)方向移動(dòng)（紅移）振動(dòng)耦合：當(dāng)兩個(gè)振動(dòng)頻率相同或相近的基團(tuán)相鄰并由同一原子相連時(shí)，兩個(gè)振動(dòng)相互作用產(chǎn)生共振，吸收譜帶裂分，形成雙峰（高頻和低頻）。費(fèi)米共振：當(dāng)一振動(dòng)的倍頻與另一振動(dòng)的基頻接近（2νA=νB）時(shí)，二個(gè)振動(dòng)相互作用而產(chǎn)生強(qiáng)吸收峰或者發(fā)生譜帶裂分的現(xiàn)象?？臻g效應(yīng):由于空間阻隔，分子平面與雙鍵不在同一平面，此時(shí)共軛效應(yīng)下降，吸收峰藍(lán)移。張力效應(yīng):環(huán)張力：四元環(huán)>五元環(huán)>六元環(huán);環(huán)外雙鍵隨環(huán)張力增加，吸收峰藍(lán)移。環(huán)內(nèi)雙鍵隨環(huán)張力增加，吸收峰紅移物質(zhì)狀態(tài)：由固態(tài)向氣態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)，其紅外吸收峰將藍(lán)移。溶劑效應(yīng)：極性基團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰隨溶劑極性增加而紅移。特征區(qū)與指紋區(qū)特征峰：與官能團(tuán)相聯(lián)系的、在一定頻率范圍內(nèi)出現(xiàn)的化學(xué)鍵的振動(dòng)吸收峰。特點(diǎn)：吸收峰稀疏、較強(qiáng)，易辨認(rèn)指紋區(qū)：1300~900cm-1：C-X(X：O、N、F、P、S)、P-O、Si-O伸縮振動(dòng)區(qū)900~400cm-1：-CH2平面搖擺、苯環(huán)取代、C-H面外變形振動(dòng)區(qū)特點(diǎn)：吸收峰密集、難辨認(rèn)流式細(xì)胞儀（FCM）流式細(xì)胞儀（flowcytometer，F(xiàn)CM）是以激光為光源、檢測生物學(xué)顆粒理化性質(zhì)的儀器。流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）是應(yīng)用流式細(xì)胞儀對懸浮液中的細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行快速測量和多參數(shù)檢測的細(xì)胞分析技術(shù)。同時(shí)依賴測量到的參數(shù)還可以用物理的方法將一個(gè)群體中的細(xì)胞亞群分選出來，即流式細(xì)胞分選術(shù)。FCM與其他細(xì)胞分析技術(shù)相比，有如下特點(diǎn)：高速度：每秒可檢測1000~5000個(gè)細(xì)胞。高靈敏度：每個(gè)細(xì)胞只要帶有1000~3000個(gè)熒光分子就能檢出，兩個(gè)細(xì)胞之間有5%的差別就可區(qū)分出來，光散射的靈敏度為0.3um。高精度：在細(xì)胞懸液中測量細(xì)胞，比其他分析技術(shù)的變異系數(shù)更小，分辨率高。高純度：分選細(xì)胞的純度可大于99%以上。多參數(shù)：可同時(shí)定量檢測單個(gè)細(xì)胞的DNA等多個(gè)參數(shù)。在適當(dāng)?shù)臈l件，可對活細(xì)胞進(jìn)行無害性分析和分選。流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)包括五部分：以上整個(gè)系統(tǒng)由電子電路和計(jì)算機(jī)控制，用以收集、顯示、分析、儲(chǔ)存被測定的各種信號(hào)及控制細(xì)胞的分選收集。光源液流系統(tǒng)信號(hào)接收信號(hào)處理細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀基本原理流式細(xì)胞術(shù)光信號(hào)散射光信號(hào)：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光(forwardscatter,FSC)：激光器正前方1-6度方向上有比較強(qiáng)的衍射光，即前向散射光，F(xiàn)SC強(qiáng)度是d/λ的函數(shù)，反映被測細(xì)胞的體積大小和活力。側(cè)向散射光(sidescatter,SSC)：SSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號(hào)強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化。熒光信號(hào)（fluorescence，F(xiàn)L）：熒光素的電子吸收光的能量由低能態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軕B(tài)，再回到低能態(tài)時(shí)釋放出的光。自發(fā)熒光：微弱（核黃素、色素分子等）特異熒光：熒光素分子發(fā)出的的熒光比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。細(xì)胞信號(hào)的顯示一維直方圖（histogram）：單參數(shù)直方圖表示一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量間的關(guān)系，橫坐標(biāo)（X軸）表示熒光或散射光強(qiáng)度的相對值，其單位用在流式細(xì)胞儀中用“道”表示，道數(shù)與熒光強(qiáng)度之間是線性或?qū)?shù)關(guān)系，依儀器分析時(shí)放大器的性質(zhì)而定?？v坐標(biāo)（Y軸）通常代表細(xì)胞出現(xiàn)的頻率或相對細(xì)胞數(shù)量，絕對細(xì)胞數(shù)較少使用。在直方圖中，每個(gè)峰表示在某些方面性質(zhì)相同的一群細(xì)胞，若用“標(biāo)尺”把各峰分開成區(qū)間，即可統(tǒng)計(jì)分析出各個(gè)區(qū)間內(nèi)細(xì)胞所占百分比、及光散射或熒光強(qiáng)度的峰值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)等。二維點(diǎn)圖（dotplot）：二維點(diǎn)圖表示兩個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量間的關(guān)系。在二維點(diǎn)圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)的不同，在二維點(diǎn)圖上就會(huì)出現(xiàn)若干群細(xì)胞，即為不同的細(xì)胞亞群。若用“門”把各亞群細(xì)胞分開并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可得各亞群細(xì)胞所占百分比、及平均熒光強(qiáng)度等。假三維圖：任選FSC、SSC、FL1~FL3中任何兩個(gè)參數(shù)為X軸和Y軸，以細(xì)胞數(shù)量為Z軸，就構(gòu)成了三維圖。因Z軸細(xì)胞數(shù)量不是直接測量參數(shù)，實(shí)際上仍是二維圖，故稱為假三維圖。該圖對細(xì)胞亞群的觀察更為直觀。二維等高圖：用不同高度的平面切割假三維圖，將這些切割投影到X、Y平面上，就形成了等高圖，等高圖由類似地圖上的等高線組成，等高線密集的地方，就是細(xì)胞數(shù)變化快的地方。該圖對觀察細(xì)胞的分布趨勢優(yōu)于二維點(diǎn)圖。三維圖（3D）及四參數(shù)平面圖：三維圖：在FSC、SSC、FL1~FL3中任選三個(gè)參數(shù)為X軸、Y軸和Z軸，就構(gòu)成了一個(gè)三維圖，在三維空間中，每一群細(xì)胞各處于獨(dú)立的空間位置。該圖對復(fù)雜的細(xì)胞亞群分析更為直觀、準(zhǔn)確，但對其數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析較難。四參數(shù)平面圖：四參數(shù)平面圖分析對數(shù)據(jù)分布的觀察也有一定意義。直方圖散點(diǎn)圖假三維圖二維等高圖三維圖流式細(xì)胞儀的使用制備合格的單細(xì)胞懸液。對需測量的細(xì)胞生物化學(xué)成分進(jìn)行熒光標(biāo)記染色。進(jìn)行流式細(xì)胞儀測量。對測量資料進(jìn)行定量分析。對測量分析結(jié)果在生物學(xué)上的意義予以解釋。流式對照的設(shè)置空白對照：設(shè)置空白對照（未染色的細(xì)胞），用以區(qū)分細(xì)胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽性的結(jié)果。同型對照：同型對照是指使用與實(shí)驗(yàn)抗體相同種屬來源、相同劑量及同種免疫球蛋白的相同亞型的抗體作為對照，用于消除抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞上而產(chǎn)生的背景熒光。單標(biāo)對照：由于熒光素的寬發(fā)射譜特點(diǎn)，熒光通道間有光譜重疊現(xiàn)象。多色流式實(shí)驗(yàn)的時(shí)候需要通過補(bǔ)償調(diào)節(jié)消除光譜重疊影響。激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）激光掃描共聚焦顯微鏡(LaserScanningConfocalMicroscope;LSCM):以激光作為光源，激光器發(fā)出的激光通過照明針孔形成點(diǎn)光源，經(jīng)過透鏡、分光鏡形成平行光后，再通過物鏡聚焦在樣品上，并對樣品內(nèi)聚焦平面上的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。樣品被激光激發(fā)后的出射光波長比入射光長，可通過分光鏡，經(jīng)過透鏡再次聚焦，到達(dá)探測針孔處，被后續(xù)的光電倍增管檢測到，并在顯示器上成像，得到所需的熒光圖像，而非聚焦光線被探測針孔光欄阻擋，不能通過探測針孔，因而不能在顯示器上顯出熒光信號(hào)。這種雙共軛成像方式稱為共聚焦。因采用激光作為光源，故稱之為“激光掃描共聚焦顯微鏡”。激光掃描共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)激光光源掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測器）自動(dòng)顯微鏡控制系統(tǒng)（數(shù)字信號(hào)處理器、計(jì)算機(jī)）圖象輸出設(shè)備（顯示器、打印機(jī)、存儲(chǔ)器）激光掃描共聚焦顯微鏡的基本原理利用放置在光源后的照明針孔(P1)和放置在檢測器前的探測針孔(P2)實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測；激光經(jīng)過照明針孔形成點(diǎn)光源，由物鏡聚焦在樣品焦面的某個(gè)點(diǎn)上，只有該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光線被探測器阻擋，不能到達(dá)PMT探測器，從而提高了成像效果。照明針孔和探測針孔共焦，共焦點(diǎn)為被探測點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面為共焦平面。共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別ObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterLaserObjectiveEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterFluorescentMicroscopeConfocalPrinciple抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片增加側(cè)向分辨率由于點(diǎn)對點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響激光掃描共聚焦顯微鏡的優(yōu)越性動(dòng)態(tài)連續(xù)掃描及三維圖像重組同時(shí)多種物質(zhì)標(biāo)記瞬時(shí)分辨率高高質(zhì)量數(shù)字圖像熒光樣品的制備要求熒光標(biāo)記反應(yīng)特異性強(qiáng)，熒光信號(hào)定位準(zhǔn)確保持樣品應(yīng)有的形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性熒光信號(hào)響應(yīng)百準(zhǔn)確靈敏，具有可重復(fù)性熒光強(qiáng)度適度熒光穩(wěn)定性好樣品的熒光分布均勻圖象背景干凈，干擾雜質(zhì)少激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等；

生物化學(xué)：酶、核酸、FISH、受體分析等；藥理學(xué)：藥物對細(xì)胞的作用及其動(dòng)力學(xué)等；生理學(xué)：膜受體、離子通道、離子含量、分布、動(dòng)態(tài)等；遺傳學(xué)和組胚學(xué)：細(xì)胞生長、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷等；

神經(jīng)生物學(xué)：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運(yùn)輸和傳遞等；

微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)：細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)等；

病理學(xué)及病理學(xué)臨床應(yīng)用：活檢標(biāo)本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷等；

生物學(xué)、免疫學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)：免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)）的定位，細(xì)胞膜受體或抗原的分布等。動(dòng)態(tài)光散射儀動(dòng)態(tài)光散射DynamicLightScattering(DLS)，也稱光子相關(guān)光譜PhotonCorrelationSpectroscopy(PCS)，準(zhǔn)彈性光散射quasi-elasticscattering，是一種通過測量樣品散射光強(qiáng)度起伏的變化來得出樣品顆粒大小信息的一種技術(shù)。DLS技術(shù)測量粒子粒徑，具有準(zhǔn)確、快速、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，還具有測量Zeta電位、大分子的分子量等的能力，已經(jīng)成為納米科技中比較常規(guī)的一種表征方法動(dòng)態(tài)光散射儀原理假設(shè)粒子一樣大的，有單一的、良好的擴(kuò)散系數(shù)，且溫度保持不變。小顆粒在溶液中“抖動(dòng)”相對迅速，就得到一個(gè)快速波動(dòng)的強(qiáng)度信號(hào)。相比之下，大顆粒擴(kuò)散地更慢，導(dǎo)致強(qiáng)度信號(hào)又慢又大。從擴(kuò)散系數(shù)獲得粒度散射光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系是符合統(tǒng)計(jì)規(guī)律，引入“自動(dòng)相關(guān)函數(shù)C(t’)”，通過拉普拉斯逆轉(zhuǎn)換，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成指數(shù)光譜的形式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，從而將雜亂的強(qiáng)度起伏圖就變成了有規(guī)則的C(t’)平滑曲線。變量τ是一個(gè)的指數(shù)函數(shù)里特定的衰變時(shí)間常數(shù)，控制自相關(guān)函數(shù)C(t)向long-t極限值(基線B)衰變的速度。因此，粒子越大擴(kuò)散系數(shù)越小，產(chǎn)生的波動(dòng)越慢，衰減時(shí)間常數(shù)τ就越大。通過粒子衰變常數(shù)τ就能夠得到的擴(kuò)散系數(shù)D1/τ=2DK2或者D=(1/2K2)(1/τ)k“散射光波矢量”，是一個(gè)常數(shù)，由溶液中的激光的波長和PMT探測器接收到的散射光散射角θ決定。K=(4πn/λ)sinθ/2K=1.868×105cm-1（n溶劑折射率；θ=90°；λ=632.8nm）D=kT/6πηR（

K玻耳茲曼常數(shù)，T溫度，η溶液的剪切粘度）動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：樣品制備簡單，不需特殊處理，測量過程不干擾樣品本身的性質(zhì)，所以能夠反映出溶液中樣品分子的真實(shí)狀態(tài)測量過程迅速，樣品可以回收利用檢測靈敏度高能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測樣品的動(dòng)態(tài)變化核磁共振波譜分析（NMR）將磁性原子核放入強(qiáng)磁場后會(huì)發(fā)生磁能級(jí)分裂，用適宜頻率的電磁波照射，處于低能級(jí)的原子核發(fā)生能級(jí)躍遷會(huì)吸收能量，同時(shí)產(chǎn)生核磁共振信號(hào)，得到核磁共振波譜（nuclearmagneticresonance，NMR）分析測定時(shí)，樣品不會(huì)受到破壞，屬于無破損分析方法結(jié)構(gòu)分析的重要工具之一，獲取的結(jié)構(gòu)信息豐富核磁共振的原理將自旋核置于外磁場H0中時(shí)，根據(jù)量子力學(xué)原理，由于磁矩與磁場相互作用，磁矩相對于外加磁場有不同取向，它們在外磁場方向的投影是量子化的，可以用磁量子數(shù)(m)描述：

m=I，I-1，I-2，…，-I2I+1個(gè)取向其中I是核的自旋量子數(shù)，只有I﹥0時(shí)原子核才有自旋角動(dòng)量和自旋現(xiàn)象。EH0原子序數(shù)質(zhì)量數(shù)自旋量子數(shù)實(shí)例偶偶012C6、16O8、32S16偶、奇奇半整數(shù)1H1、13C6、17O8、33S16奇偶整數(shù)2H1、14N7對于具有一定自旋量子數(shù)I、磁量子數(shù)m的核量子化能級(jí)的能量為：H0：外加磁場強(qiáng)度β：核磁子μ：核磁矩相鄰兩個(gè)能級(jí)的能量差：當(dāng)用頻率為υ的電磁波照射被外磁場分裂了的自旋1H核且滿足：1H核自旋產(chǎn)生的磁場與外磁場發(fā)生相互作用，磁矩的取向發(fā)生改變，即處于低能態(tài)的核吸收了射頻能量而躍遷至高能態(tài)，發(fā)生了核磁共振吸收。hH0μμH0原子核在自旋的同時(shí)，還以外磁場方向?yàn)檩S線