微生物學(xué)-6病毒

第六章——病毒非細(xì)胞生物的種類:（真）病毒:至少含有核酸和蛋白質(zhì)兩種組分類病毒:只含單獨(dú)具侵染性的RNA組分亞病毒擬病毒:只含不具單獨(dú)侵染性的RNA組分朊病毒:只含蛋白質(zhì)一種組分第一節(jié)概述

一、病毒的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)1892：俄國伊萬諾夫斯基首次發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒的感染因子能通過細(xì)菌過濾器。1898：荷蘭貝哲林克證實(shí)該致病因子可以被乙醇從懸液中沉淀下來而不失去其感染性但用培養(yǎng)細(xì)菌的方法培養(yǎng)不出來；給這樣的病原體起名叫virus。1935：美國斯坦利從煙草花葉病病葉中提取出了病毒結(jié)晶，又證實(shí)了結(jié)晶中含核酸和蛋白質(zhì)兩種成分，而只有核酸具感染和復(fù)制能力，并因此而或諾貝爾獎(jiǎng)。1952：Hershey和Chase證實(shí)噬菌體的遺傳物質(zhì)僅僅是DNA,開創(chuàng)了病毒分子生物學(xué)。1971后：陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各種亞病毒——類病毒、朊病毒、和擬病毒。二、病毒的定義和特點(diǎn)形體極其微小，必須在電子顯微鏡下才能觀察，一般都可通過細(xì)菌濾器；沒有細(xì)胞構(gòu)造，故也稱分子生物；其主要成分僅是核酸和蛋白質(zhì)兩種；每一種病毒只含有一種核酸，DNA或RNA；既無產(chǎn)能酶系也無蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)；在宿主細(xì)胞協(xié)助下，通過核酸復(fù)制和核酸蛋白裝配的形式進(jìn)行增殖，無個(gè)體生長和二分裂等繁殖方式；營宿主的活細(xì)胞內(nèi)專性寄生；離體條件下以化學(xué)大分子狀態(tài)存在，可形成結(jié)晶；對(duì)一般抗生素不敏感，但對(duì)干擾素敏感。病毒是一類超顯微的，沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只含有一種類型的核酸，其基因組在特定的活細(xì)胞中利用宿主細(xì)胞的合成系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制增殖的超級(jí)微生物。病毒的定義

它們在活體外具有一般大分子特征，一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞又具有生命特征，又被認(rèn)為大分子微生物。迄今仍無一個(gè)科學(xué)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)亩x三、宿主范圍幾乎所有的生物都可以感染相應(yīng)的病毒。病毒的宿主范圍感染原核微生物：噬菌體感染真核微生物真菌噬菌體植物病毒動(dòng)物病毒無脊椎動(dòng)物脊椎動(dòng)物昆蟲四.病毒的培養(yǎng)與純化同微生物學(xué)其他學(xué)科分支一樣，病毒學(xué)的進(jìn)步完全得益于研究方法和技術(shù)手段的發(fā)展。通過病毒的分離與純化獲得純化的、有感染性的病毒制備物是病毒學(xué)研究和實(shí)踐的基本技術(shù)。1.病毒的培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)：二元培養(yǎng)物法噬菌體細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)液營養(yǎng)瓊脂平板變清亮殘跡平板

若是噬菌體經(jīng)過適當(dāng)稀釋再接種細(xì)菌平板，經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)，在細(xì)菌菌苔上可形成圓形局部透明區(qū)域，即噬斑（plague）。

如同對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)一樣，形成的噬菌斑也可用于對(duì)噬菌體的數(shù)目進(jìn)行估算。動(dòng)物病毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雞胚多種細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物病毒感染敏感細(xì)胞培養(yǎng)能產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng),例如細(xì)胞聚集成團(tuán)、腫大、圓縮、脫落，細(xì)胞融合形成多核細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體,乃至細(xì)胞裂解等。若標(biāo)本經(jīng)過適當(dāng)稀釋進(jìn)行接種并輔以染色處理，病毒可在培養(yǎng)的細(xì)胞單層上形成肉眼可見的局部病損區(qū)域，即蝕斑（plaque）或稱空斑。植物病毒敏感植物葉片產(chǎn)生壞死斑，或稱枯斑

蛋白質(zhì)提純方法2.病毒純化標(biāo)準(zhǔn)病毒制備物應(yīng)保持其感染性病毒是有感染性的生物體病毒具有化學(xué)大分子的屬性病毒制備物的理化性質(zhì)應(yīng)具有均一性方法主要組成為蛋白質(zhì)具有一定的大小、形狀和密度差速離心梯度離心第二節(jié)病毒(毒粒)的形態(tài)、

構(gòu)造和組分一、大小大小恒定測定大小的單位是納米（10－9)，多數(shù)病毒的直徑在100nm以下；絕大多數(shù)病毒是能通過細(xì)菌濾器；須用電鏡才能觀察到其具體形態(tài)和大小.二.毒粒的形態(tài)球狀桿狀、絲狀蝌蚪狀1.個(gè)體形態(tài)球狀病毒桿狀病毒蝌蚪狀病毒彈狀病毒磚形病毒2.病毒的群體形態(tài) 噬菌體感染細(xì)菌后，使細(xì)菌細(xì)胞破裂死亡，連續(xù)重復(fù)感染使大量的細(xì)菌死亡，在培養(yǎng)細(xì)菌的平板上，可以看到一個(gè)個(gè)透明不長細(xì)菌的小圓斑，稱為噬菌斑。 人工培養(yǎng)的單層動(dòng)物細(xì)胞感染病毒后，也會(huì)形成類似噬菌斑的動(dòng)物病毒群體，稱為空斑。 單層動(dòng)物細(xì)胞受到腫瘤病毒的感染后，會(huì)使動(dòng)物細(xì)胞惡性增生，形成類似細(xì)菌菌落的病灶，稱為病斑。 煙草花葉病毒感染煙草后，在葉片上出現(xiàn)的一個(gè)個(gè)壞死的病灶，稱為枯斑。包涵體：寄主細(xì)胞經(jīng)病毒感染后形成的一種在光學(xué)顯微鏡下可見的含有或不含有病毒粒子的蛋白質(zhì)性質(zhì)的小體。多為圓形、卵圓形成不定型，在細(xì)胞中呈現(xiàn)的大小、數(shù)量不一。顆粒性包涵體多角體包涵體三、構(gòu)造——結(jié)構(gòu)——對(duì)稱性

1病毒粒子的結(jié)構(gòu)病毒粒子(virion)——成熟的（結(jié)構(gòu)完整）、具有侵染力的單個(gè)病毒，又稱病毒顆粒(virusparticle)。結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)輔助結(jié)構(gòu)核心：DNA或RNA衣殼(外殼)：包在核質(zhì)外由衣殼粒組成核衣殼----病毒粒子被膜：包在核衣殼外的膜結(jié)構(gòu)其它：刺突等病毒粒子衣殼：由衣殼粒以對(duì)稱而有規(guī)律的排列成桿狀、球狀、二十面體等形狀。核衣殼：衣殼與病毒核髓合稱為核衣殼或核殼體。囊膜：包在病毒核衣殼外的一層或二層較寬松的膜結(jié)構(gòu)、亦稱被膜、外膜、封套。刺突：有些病毒囊膜上的多糖同蛋白質(zhì)合成粒狀，嵌在脂類中向外突出呈刺狀。衣殼粒：由1－6個(gè)同種的多肽鏈折疊而成的蛋白質(zhì)亞單位，電鏡下呈子粒狀。病毒粒子：成熟或結(jié)構(gòu)完整的，具有感染性的病毒顆粒。囊膜、刺突2病毒的對(duì)稱性三類典型形態(tài)的病毒：廿面體對(duì)稱的結(jié)構(gòu)(球狀)螺旋對(duì)稱的結(jié)構(gòu)(桿狀)復(fù)合對(duì)稱的結(jié)構(gòu)(蝌蚪狀)

1)螺旋狀對(duì)稱型：煙草花葉病毒（TMV）

呈直桿狀，長300nm，寬15nm，中空內(nèi)徑4nm，由158個(gè)氨基酸組成一個(gè)皮鞋狀的衣殼粒，相對(duì)分子量為17500，總共2130個(gè)衣殼粒，排列成130圈螺旋，核酸核心是單鏈的RNA，相對(duì)分子質(zhì)量為260萬，含有6390個(gè)核苷酸，每3個(gè)核苷酸與一個(gè)衣殼粒相結(jié)合，盤繞于蛋白質(zhì)的中空內(nèi)徑中。二十面體具有12個(gè)角、20個(gè)面和30條棱。腺病毒的衣殼是典型的二十面體對(duì)稱，由252個(gè)衣殼組成，沒有包膜。腺病毒的核心是由線狀雙鏈DNA構(gòu)成的。其基因組的大小都約為36500個(gè)核苷酸對(duì)。2)二十面體對(duì)稱型：

T4由頭部（核心是雙鏈線狀DNA）、頸部和尾部（尾鞘、尾管、基板、刺突和尾絲）三個(gè)部分構(gòu)成。3)復(fù)合對(duì)稱型：Ｔ偶數(shù)噬菌體四、化學(xué)組成病毒的主要成分為核酸(DNA或RNA)和蛋白質(zhì)。有的病毒還含有脂質(zhì)、糖類等其他組分?！粢环N病毒至含有一種核酸（DNA或RNA）。植物病毒絕大多數(shù)含DNA;少數(shù)含RNA；動(dòng)物病毒一部分含DNA，一部分含RNA；細(xì)菌病毒普遍含DNA，含RNA的極少?！舨《镜暮怂犷愋蜆O為多樣化：▼▼病毒的DNA與RNA均有單鏈和雙鏈：dsDNAssDNAdsRNAssRNA1.病毒的核酸▼病毒DNA分子有線裝和環(huán)狀之分。▼病毒核酸有正鏈（＋）和負(fù)鏈（—）的區(qū)分：規(guī)定：將堿基序列與mRNA一致的核酸單鏈定位正鏈，將堿基序列與mRNA互補(bǔ)的核酸單鏈定位負(fù)鏈。因此，就病毒核酸鏈的單與雙以及正和負(fù)有以下6種類型：(±)DNA——大部分DNA病毒(±)RNA——?jiǎng)游锖裟c孤病毒（＋）DNA——大腸桿菌X174噬菌體（＋）RNA——所有單鏈RNA病毒\大部分植物病毒（—）DNA——腺病毒（—）RNA——流感病毒病毒核酸結(jié)構(gòu)2.病毒的蛋白質(zhì)▼有的病毒只有一種蛋白質(zhì)，多數(shù)含有為數(shù)不多的幾種蛋白質(zhì)。▼病毒蛋白質(zhì)的氨基酸組成與其他生物一樣，但不同病毒蛋白質(zhì)的氨基酸組成和含量各不相同。▼病毒蛋白質(zhì)主要在構(gòu)成病毒結(jié)構(gòu)、病毒的侵染與增殖過程中發(fā)揮作用：1、結(jié)構(gòu)功能2、吸附3、破壞宿主細(xì)胞壁與細(xì)胞膜4、增殖3.其他成分1)脂質(zhì)病毒的脂質(zhì)主要有磷脂、膽固醇、中性脂肪。2)多糖主要以糖蛋白、糖脂的形式存在，具有特異性的粘附到宿主細(xì)胞和破壞細(xì)胞膜成份的作用。3)微量金屬離子第三節(jié)各類病毒及其繁殖方式一、原核生物的病毒—噬菌體 噬菌體：是病毒中的一種，一般把侵染細(xì)菌、放線菌的病毒叫噬菌體。（把侵染真菌的病毒叫噬真菌體） 噬菌體在自然界廣泛存在，在1995年發(fā)表的ICTV的病毒分類與命名第六次報(bào)告中共報(bào)道了4000余種，分別劃歸為49個(gè)病毒科.據(jù)Bradley(1967)歸納，噬菌體共有六類形態(tài)。1.形態(tài)與分類噬菌體共有六類形態(tài)：★T-系噬菌體——T-系噬菌體是研究的最廣泛而又深入的細(xì)菌噬菌體，按發(fā)現(xiàn)的先后順序進(jìn)行從T1---T7編號(hào)，后來發(fā)現(xiàn)其中偶數(shù)者的形態(tài)都相同（蝌蚪形收縮性長尾），故統(tǒng)稱T偶數(shù)噬菌體。由于絕大多數(shù)噬菌體為蝌蚪形，現(xiàn)以E.coliT4為例，介紹蝌蚪形噬菌體的結(jié)構(gòu)：大腸桿菌T4噬菌體構(gòu)造偶數(shù)噬菌體的形態(tài)構(gòu)造2、噬菌體的繁殖 病毒粒子并無個(gè)體的生長過程，而只有其兩種基本成分的合成和裝配，即：

核酸復(fù)制+蛋白質(zhì)合成核蛋白（病毒粒子）噬菌體的繁殖一般可分五個(gè)階段，即吸附侵入增殖（復(fù)制與生物合成）成熟（裝配）裂解（釋放）★Twoprimarytypesofbacteriophages：溫和噬菌體（temperatephrage）——噬菌體感染細(xì)胞后，將其核酸整合（插入）到宿主的核DNA上，并且可以隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，在一般情況下，不引起寄主細(xì)胞裂解的噬菌體。烈性噬菌體（virulentphage）——感染細(xì)胞后,能在寄主細(xì)胞內(nèi)增殖，產(chǎn)生大量子代噬菌體并引起細(xì)菌裂解的噬菌體。尾絲尖端與宿主細(xì)胞表面的特異性受體接觸，可觸發(fā)尾絲散開，附著在受體上，隨之把刺突、基板固定（1）吸附病毒吸附蛋白與細(xì)胞受體間的結(jié)合力來源于空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，相互間的電荷、氫鍵、疏水性相互作用及范得華力。病毒吸附受體1（2）侵入吸附尾釘固著尾鞘收縮尾管穿入DNA注入尾部的酶水解細(xì)胞壁的肽聚糖，使細(xì)胞壁產(chǎn)生小孔；尾鞘收縮，核酸通過中空的尾管壓入胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；PhageT4infectingitshostE.colicell

（3）增殖

病毒利用宿主的生物合成機(jī)構(gòu)和場所，使病毒核酸表達(dá)和復(fù)制，產(chǎn)生大量的病毒蛋白質(zhì)和核酸。Fig.4:LateReplication

Fig.3:EarlyReplication

（4）成熟（裝配）T4噬菌體的裝配是一個(gè)極為復(fù)雜的自我裝配的過程（5）裂解（釋放）Fig.6:ReleaseFig.5:Maturation

吸附侵入早期：病毒特異性酶的合成病毒核酸復(fù)制病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成裝配釋放病毒大分子合成3、噬菌體效價(jià)的測定效價(jià)——表示每毫升試樣中所含有的具侵染性的噬菌體粒子數(shù).又稱噬菌斑形成單位（pfu）或感染中心測定的方法——雙層平板法用雙層平板法測出的效價(jià)比用電鏡直接記數(shù)得到的效價(jià)低。

前者是計(jì)有感染力的噬菌體粒子，后者是計(jì)噬菌體的總數(shù)。

一步生長曲線可分為三個(gè)時(shí)期：

①潛伏期是指菌體的核酸侵入宿主細(xì)胞后至第一個(gè)噬菌體粒子裂解前的一段時(shí)間。又分隱藏期和胞內(nèi)積累期②裂解期是指溶液中噬菌體粒子急劇增多的一段時(shí)間。③穩(wěn)定期溶液中噬菌體總數(shù)達(dá)到最高點(diǎn)后的時(shí)期。4、一步生長曲線 定量描述烈性噬菌體生長規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線稱作一步生長曲線5、溶源性溫和噬菌體或稱溶源性噬菌體（lysogenicphage）：感染宿主細(xì)胞后不能完成復(fù)制循環(huán)，噬菌體基因組長期存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，沒有成熟噬菌體產(chǎn)生。這一現(xiàn)象稱做溶源性（lysogeny）現(xiàn)象附著或融合在溶源性細(xì)菌染色體上的溫和噬菌體的核酸稱為原噬菌體或前噬菌體。

前噬菌體★烈性噬菌體與溫和噬菌體的生活史比較：吸附侵入增殖成熟裂解整合同步復(fù)制自發(fā)或誘導(dǎo)多次循環(huán)裂解性循環(huán)溶原性循環(huán)6.噬菌體的應(yīng)用與防治噬菌體的危害：主要是引起發(fā)酵中的噬菌體污染例：丙酮、丁醇發(fā)酵中的噬菌體污染抗生素發(fā)酵中的噬菌體污染食品工業(yè)上的噬菌體污染防治：控制活菌排放選育抗性生產(chǎn)菌株生產(chǎn)中輪換使用菌種藥物防治例如用金霉素、四環(huán)素等。噬菌體與發(fā)酵工業(yè)噬菌體的應(yīng)用：1.作為分子生物學(xué)研究的工具2.用于鑒定未知菌3.用于臨床治療傳染病4.檢驗(yàn)植物病原菌5.測定輻射劑量植物病毒沒有專門的吸附結(jié)構(gòu)，通過昆蟲口器、摩擦傷口和人為傷口進(jìn)入寄主細(xì)胞。植物病毒在入住宿主細(xì)胞后脫去蛋白質(zhì)外殼。TMV的衣殼粒以雙層盤的形式組裝成衣殼，PH的改變、RNA的嵌入對(duì)衣殼的裝配起關(guān)鍵作用。二.植物病毒三.人類和脊椎動(dòng)物病毒脊椎動(dòng)物病毒包括DNA和RNA病毒，動(dòng)物病毒的釋放方式多種多樣，主要有以下幾種形式：1.無包膜的病毒，如腺病毒通過細(xì)胞裂解或局部破裂而釋放。2.有包膜的DNA病毒，如皰疹病毒，以細(xì)胞質(zhì)中通道釋放到細(xì)胞外。3.有包膜的RNA病毒，如副流感病毒用出芽方式通過寄主細(xì)胞膜，釋放到細(xì)胞外并獲得細(xì)胞源性的包膜和產(chǎn)生刺突。腺病毒的復(fù)制可代表DNA病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒的復(fù)制可代表RNA病毒1.吸附：腺病毒吸附在宿主細(xì)胞表面的糖蛋白受體上。2.穿入：通過吞噬作用進(jìn)入胞內(nèi)。3.脫殼：寄主細(xì)胞的蛋白酶水解腺病毒衣殼。4.在宿主細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄早期mRNA并翻譯早期蛋白。5.在宿主細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制出病毒的DNA和晚期mRNA。

一些帶有囊膜的病毒，如單純皰疹病毒，當(dāng)它們的核酸和衣殼蛋白組裝完畢后，它們將以“出芽”的方式，包裹寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜或核膜，從寄主細(xì)胞中釋放出來。

獲得性免疫缺陷綜合癥(AcquiredImmuneDeficiencySyndromes)人類免疫缺陷病毒（HIV）

獲得性免疫缺陷綜合癥(AcquiredImmuneDeficiencySyndromes)人類免疫缺陷病毒（HIV）

獲得性免疫缺陷綜合癥(AcquiredImmuneDeficiencySyndromes)人類免疫缺陷病毒（HIV）（四）昆蟲病毒多數(shù)昆蟲病毒可在宿主細(xì)胞內(nèi)形成光鏡下呈多角形的包涵體，稱多角體，成分為堿溶性結(jié)晶蛋白，其內(nèi)包裹著數(shù)目不等的病毒粒。核形多角體病毒（NPV）：在昆蟲細(xì)胞核內(nèi)增殖、具有蛋白質(zhì)包涵體的桿狀病毒質(zhì)形多角體病毒（CPV）：在昆蟲細(xì)胞質(zhì)內(nèi)增殖、可形成蛋白質(zhì)包涵體的球狀病毒顆粒體病毒（GV）：具有蛋白質(zhì)包涵體，每個(gè)包涵體內(nèi)通常僅含一個(gè)病毒粒的昆蟲桿狀病毒主要有三種類型：第四節(jié)亞病毒1971年T.O.Diener闡明馬鈴薯紡錘形塊莖病毒的病原是一種具有感染性和自主復(fù)制能力的低分子RNA（類病毒，Diener,1971）以后又發(fā)現(xiàn)了稱之為擬病毒(Randles,1981)的植物病毒Prusiner發(fā)現(xiàn)了朊病毒(