分析化學(xué)吸光光度法定

第6章吸光光度法6.1

概述6.2

吸光光度法基本原理6.3

分光光度計(jì)6.4

顯色反應(yīng)及影響因素6.5

光度分析法的設(shè)計(jì)6.6

吸光光度法的誤差6.7

常用的吸光光度法6.8

吸光光度法的應(yīng)用吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法，屬于分子吸收光譜分析方法是一種基于物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收而建立起來的一種分析方法。6.1

概述吸收光譜發(fā)射光譜散射光譜分子光譜原子光譜包括可見吸光光度法、紫外-可見吸光光度法和紅外光譜法等。吸光光度法同滴定分析法、重量分析法相比，有以下一些特點(diǎn)：(一)靈敏度高(二)準(zhǔn)確度較高一般吸光光度法的相對(duì)誤差為2-5%(三)操作簡(jiǎn)便，測(cè)定速度快

(四)應(yīng)用廣泛6.2

吸光光度法基本原理1

吸收光譜產(chǎn)生的原因光:一種電磁波,波粒二象性

光譜名稱波長(zhǎng)范圍X射線0.1~10nm遠(yuǎn)紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可見光400~750nm近紅外光0.75~2.5um中紅外光2.5~5.0um遠(yuǎn)紅外光5.0~1000um微波0.1~100cm無(wú)線電波1～1000m當(dāng)光子的能量與分子的E匹配時(shí)，就會(huì)吸收光子

E=hu=hc/l原子光譜為線光譜分子光譜為帶光譜電子躍遷能級(jí)分子振動(dòng)能級(jí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)在分子中存在著電子的運(yùn)動(dòng)，以及組成分子的各原子間的振動(dòng)和分子作為整體的轉(zhuǎn)動(dòng)。分子的總能量可以認(rèn)為等于這三種運(yùn)動(dòng)能量之和。即：E分子=E電子+E振動(dòng)+E轉(zhuǎn)動(dòng)二、分子吸收光譜類型

遠(yuǎn)紅外光譜、紅外光譜及紫外-可見光譜三類。分子的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷，需吸收波長(zhǎng)為遠(yuǎn)紅外光，因此，形成的光譜稱為轉(zhuǎn)動(dòng)光譜或遠(yuǎn)紅外光譜。

分子的振動(dòng)能級(jí)差一般需吸收紅外光才能產(chǎn)生躍遷。在分子振動(dòng)時(shí)同時(shí)有分子的轉(zhuǎn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)。這樣，分子振動(dòng)產(chǎn)生的吸收光譜中，包括轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，故常稱為振-轉(zhuǎn)光譜。由于它吸收的能量處于紅外光區(qū)，故又稱紅外光譜。電子的躍遷吸收光的波長(zhǎng)主要在真空紫外到可見光區(qū)，對(duì)應(yīng)形成的光譜，稱為電子光譜或紫外-可見吸收光譜。物質(zhì)的顏色吸收光顏色波長(zhǎng)范圍(l,nm)黃綠黃橙紅紫紅紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠綠黃綠黃橙紅400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-7502

物質(zhì)顏色和其吸收光關(guān)系互補(bǔ)色吸收光譜曲線：物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下吸收光的強(qiáng)度大小

A～l關(guān)系最大吸收波長(zhǎng)lmax：光吸收最大處的波長(zhǎng)3一些基本名詞和概念lmax對(duì)比度(Δl):絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)(lMRmax)與試劑最大吸收波(lRmax)之差Δl吸收光譜特征：（1）不同物質(zhì)具有不同吸收光譜（定性依據(jù)）（2）不同物質(zhì)的吸收光譜總有一最大吸收峰，光吸收程度最大處的波長(zhǎng)，稱為最大吸收波長(zhǎng)，常用λ最大或λmax表示，任何可見光區(qū)內(nèi)、溶液的顏色主要是由這個(gè)數(shù)值決定的。（3）在正常情況下，選用不同濃度的某種溶液，最大吸收波長(zhǎng)也是固定不變的，說明光的吸收與溶液中物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，與入射光強(qiáng)度、吸收池厚度及溶液濃度無(wú)關(guān)。（4）常以最大吸收波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，靈敏度最高4朗伯-比爾定律光吸收定律－朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理論依據(jù)，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa

T=It/I0,T:透射比或透光度

A=lg(I0/It)＝lg(1/T),A:吸光度朗伯定律（1760年）：光吸收與溶液層厚度成正比比爾定律（1852年）：光吸收與溶液濃度成正比當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系－－－朗伯比爾定律－－－光吸收定律

數(shù)學(xué)表達(dá)：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比，

K:比例常數(shù)，b:溶液厚度，c:溶液濃度注意：平行單色光均相介質(zhì)無(wú)發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng)摩爾吸光系數(shù)e靈敏度表示方法A=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物質(zhì)的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度。單位：

(L?mol-1?cm-1)c:g/LA=abca:吸光系數(shù)與入射光的波長(zhǎng)、物質(zhì)的性質(zhì)和溶液的溫度等因素有關(guān)桑德爾(Sandell)靈敏度：S

當(dāng)儀器檢測(cè)吸光度為0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢測(cè)到的吸光物質(zhì)的最低含量。單位：mg/cm2

S=M/e

氯磺酚S測(cè)定鋼中的鈮

50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm測(cè)定光吸收，A＝0.43,求S.(Nb原子量92.91)。有兩種做法：根據(jù)A=εbC,求ε＝3.3×104L·mol-1·cm-1

吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A

=e1bc1+e2bc2

根據(jù)吸光度的加和性可以進(jìn)行多組分的測(cè)定以及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的測(cè)定在某一波長(zhǎng)，溶液中含有對(duì)該波長(zhǎng)的光產(chǎn)生吸收的多種物質(zhì)，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個(gè)吸光物質(zhì)的吸光度之和1分光光度計(jì)的組成光源單色器樣品池檢測(cè)器讀出系統(tǒng)6.3

吸光光度計(jì)一．分光光度計(jì)的主要部件和工作原理：0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示常用光源光源波長(zhǎng)范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見，近紅外氙燈180~1000紫外、可見（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段單色器作用:產(chǎn)生單色光常用的單色器：棱鏡和光柵樣品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材質(zhì)：玻璃比色皿－－可見光區(qū)石英比色皿－－可見、紫外光區(qū)檢測(cè)器

作用：接收透射光，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)常用檢測(cè)器：光電管光電倍增管光二極管陣列光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用625－1000nm波長(zhǎng)；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200－625nm波長(zhǎng)目視比色法—比色管光電比色法—光電比色計(jì)

光源、濾光片、比色池、硒光電池、檢流計(jì)分光光度法與分光光度計(jì)

722型分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)圖1.光源；2.濾光片；3,8聚光鏡4,7.狹縫；5.準(zhǔn)直鏡；6.光柵9.比色池；10.光電管二、分光光度計(jì)的類型：（一）單光束分光光度計(jì)：0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示（二）單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)比值光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示光束分裂器雙光束分光光度計(jì)是自動(dòng)比較了透過參比溶液和樣品溶液的光的強(qiáng)度，它不受光源（電源）變化的影響。雙光束分光光度計(jì)還能進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，并自動(dòng)記錄下各波長(zhǎng)下的吸光度，很快就可得到試液的吸收光譜。所以能用于定性分析。光源單色器單色器檢測(cè)器切光器狹縫吸收池（三）雙光束雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)：雙波長(zhǎng)分光光度法21XAY∵∴Y

的存在不干擾X的測(cè)定三、分光光度計(jì)的校正通常在實(shí)驗(yàn)室工作中，驗(yàn)收新儀器或?qū)嶒?yàn)室使用過一段時(shí)間后都要進(jìn)行波長(zhǎng)校正和吸光度校正。建議采用下述的較為簡(jiǎn)便和實(shí)用的方法來進(jìn)行校正：鐠銣玻璃或鈥玻璃都有若干特征的吸收峰，可用來校正分光光度計(jì)的波長(zhǎng)標(biāo)尺，前者用于可見光區(qū)，后者則對(duì)紫外和可見光區(qū)都適用。也可用K2CrO4標(biāo)準(zhǔn)溶液來校正吸光度標(biāo)度。10.4顯色反應(yīng)及影響因素要求：a.選擇性好b.靈敏度高

(ε>104)c.產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定d.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定e.反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別

(l>60nm)沒有顏色的化合物，需要通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測(cè)定－－顯色反應(yīng)1顯色反應(yīng)絡(luò)合反應(yīng)氧化還原反應(yīng)2顯色反應(yīng)類型離子締合反應(yīng)成鹽反應(yīng)褪色反應(yīng)

Zr(IV)-偶氮胂III絡(luò)合物測(cè)定草酸吸附顯色反應(yīng)

達(dá)旦黃測(cè)定Mg(II),Mg(OH)2吸附達(dá)旦黃呈紅色3顯色劑無(wú)機(jī)顯色劑:

過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀有機(jī)顯色劑：偶氮類：偶氮胂III三苯甲烷類三苯甲烷酸性染料鉻天菁S三苯甲烷堿性染料結(jié)晶紫

鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟4多元絡(luò)合物混配化合物

Nb-5-Br-PADAP-酒石酸

V-PAR-H2O離子締合物

AuCl4--羅丹明B金屬離子-配體-表面活性劑體系

Mo-水楊基熒光酮-CTMAB

a.溶液的酸度（pH值及緩沖溶液）

(1)酸度對(duì)被測(cè)物質(zhì)存在狀態(tài)的影響大部分高價(jià)金屬離子都容易水解，當(dāng)溶液的酸度降低時(shí)，最終將導(dǎo)致沉淀的生成。顯然，金屬離子的水解，對(duì)于顯色反應(yīng)的進(jìn)行是不利的，故溶液的酸度不能太低。5影響因素

(2)酸度對(duì)顯色劑濃度和顏色的影響

光度分析中所用的大部分顯色劑都是有機(jī)弱酸。

M+HR＝MR+H+

從反應(yīng)式可以看出，溶液的酸度影響著顯色劑的離解,并影響著顯色反應(yīng)的完全程度。

(3)對(duì)絡(luò)合物組成和顏色的影響對(duì)于某些逐級(jí)形成絡(luò)合物的顯色反應(yīng)、在不同的酸度時(shí)，生成不同絡(luò)合比的絡(luò)合物。例如鐵與水楊酸的絡(luò)合反應(yīng)，當(dāng)

pH＜4[Fe3+(C7H4O3)2-]+

紫色

4＜pH＜9[Fe3+(C7H4O3)22-]-

紅色

pH＞9[Fe3+(C7H4O3)32-]3-

黃色在這種情況下，必須控制合適的酸度，才可獲得好的分析結(jié)果。合適酸度也必須通過實(shí)驗(yàn)確定,做A-pH曲線即可求出b顯色劑的用量(P226)稍過量，處于平臺(tái)區(qū)顯色就是將被測(cè)組分轉(zhuǎn)變成有色化合物，表示：

M+R=MR(被測(cè)組分)(顯色劑)(有色化合物)

反應(yīng)在一定程度上是可逆的。為了減少反應(yīng)的可逆性，根據(jù)同離子效應(yīng)，加入過量的顯色劑是必要的，但也不能過量太多，否則會(huì)引起副反應(yīng)，對(duì)測(cè)定反而不利。合適用量必須通過實(shí)驗(yàn)確定,做A-V曲線即可求出c顯色反應(yīng)時(shí)間針對(duì)不同顯色反應(yīng)確定顯示時(shí)間顯色反應(yīng)快且穩(wěn)定；顯色反應(yīng)快但不穩(wěn)定；顯色反應(yīng)慢，穩(wěn)定需時(shí)間；顯色反應(yīng)慢但不穩(wěn)定顯色反應(yīng)的速度有快有慢。實(shí)驗(yàn)方法是配制一份顯色溶液，從加入顯色劑計(jì)算時(shí)間、每隔幾分鐘測(cè)定一次吸光度，繪制A-t曲線，根據(jù)曲線來確定適宜的時(shí)間。d顯色反應(yīng)溫度

加熱可加快反應(yīng)速度，導(dǎo)致顯色劑或產(chǎn)物分解不同的顯色反應(yīng)需要不同的溫度，一般顯色反應(yīng)可在室溫下完成。但是有些顯色反應(yīng)需要加熱至一定的溫度才能完成；也有些有色絡(luò)合物在較高溫度下容易分解。因此，應(yīng)根據(jù)不同的情況選擇適當(dāng)?shù)臏囟冗M(jìn)行顯色。溫度對(duì)光的吸收及顏色的深淺也有一定的影響，故標(biāo)樣和試樣的顯色溫度應(yīng)保持一樣。合適顯色溫度也必須通過實(shí)驗(yàn)確定,做A-C曲線即可求出。

e.有機(jī)溶劑和表面活性劑溶劑對(duì)顯色反應(yīng)的影響表現(xiàn)在下列幾方面。（1）溶劑影響絡(luò)合物的離解度（2）溶劑改變絡(luò)合物顏色（3）溶劑影響顯色反應(yīng)的速度表面活性劑的加入可以提高顯色反應(yīng)的靈敏度，增加有色化合物的穩(wěn)定性。

f.共存離子的干擾及消除共存離子存在時(shí)對(duì)光度測(cè)定的影響有以下幾種類型：

(1)與試劑生成有色絡(luò)合物。如用硅鉬藍(lán)光度法測(cè)定鋼中硅時(shí)，磷也能與鉬酸銨生成絡(luò)合物，同時(shí)被還原為鉬藍(lán)，使結(jié)果偏高。

(2)干擾離子本身有顏色。如Co2+(紅色)、Cr3+(綠色)、Cu2+(藍(lán)色)。

(3)與試劑結(jié)合成無(wú)色絡(luò)合物消耗大量試劑而使被測(cè)離子絡(luò)合不完全。如用水揚(yáng)酸測(cè)Fe3+時(shí)，Al3+、Cu2+等有影響。

(4)與被測(cè)離子結(jié)合成離解度小的另一化合物。如由于F-的存在，能與Fe3+以FeF63-形式存在，F(xiàn)e(SCN)3本不會(huì)生成，因而無(wú)法進(jìn)行測(cè)定。

消除干擾的方法主要有以下三種：（1）控制酸度控制顯色溶液的酸度，是消除干擾的簡(jiǎn)便而重要的方法。最適合的pH值須通過實(shí)驗(yàn)方法來確定。（2）加入掩蔽劑在顯色溶液里加一種能與干擾離子反應(yīng)生成無(wú)色絡(luò)合物的試劑，也是消除干擾的有效而常用的方法。例如用硫氰酸鹽作顯色劑測(cè)定Co2+,Fe3+有干優(yōu)可加入氟化物，使Fe3+與F-結(jié)合生成無(wú)色而穩(wěn)定的FeF63-，就可以消除干擾。在另外的情況下，也可通過氧化—還原反應(yīng)，改變干擾離子的價(jià)態(tài)以消除于擾。（3）采用萃取光度法用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑萃取有色組分,如用丁二酮肟測(cè)定鈀時(shí),鈀與丁二酮肟所形成的內(nèi)絡(luò)鹽,可被氯仿從酸性溶液中選擇性地萃取。許多干擾離子則不被萃取。（4）在不同波長(zhǎng)下測(cè)定兩種顯色配合物的吸光度,對(duì)它們進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。（5）尋找新的顯色反應(yīng)如將二元配合物改變?yōu)槿浜衔?。?）分離干擾離子在沒有適當(dāng)掩蔽劑時(shí)，干擾離于可用電解法，淀法或離子交換法等分離除去。此外，還可以通過選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)量條件，消除干擾離子的影響。10.5光度分析法的設(shè)計(jì)1.選擇顯色反應(yīng)2.選擇顯色劑3.優(yōu)化顯色反應(yīng)條件4.選擇檢測(cè)波長(zhǎng)5.選擇合適的濃度6.選擇參比溶液7.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量條件選擇1測(cè)定波長(zhǎng)選擇選擇原則：“吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性2測(cè)定濃度控制控制濃度吸光度A：0.2～0.8減少測(cè)量誤差

3.參比溶液的選擇參比溶液是用來調(diào)節(jié)儀器工作零點(diǎn)的，抵消某些干擾，若參比溶液選得不適當(dāng)，則對(duì)測(cè)量讀數(shù)準(zhǔn)確度的影響較大。選擇的辦法是：（1）溶劑空白：當(dāng)試液、試劑、顯色劑均無(wú)色時(shí)，可用蒸餾水作參比液。（2）試劑空白：如果顯色劑或加入的其它試劑在測(cè)量波長(zhǎng)處略有吸收。（3）樣品參比：試劑和顯色劑均無(wú)色時(shí)，而樣品溶液中其他離子有色時(shí)，應(yīng)采用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。（4）褪色參比：試劑和顯色劑均有顏色時(shí)，可將一份試液加入適當(dāng)掩蔽劑，將被測(cè)組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，然后把顯色劑、試劑均按操作手續(xù)加入，以此做參比溶液，這樣可以消除一些共存組分的干擾。4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律相同條件下測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度AA～c作圖1.一般方法

A-c標(biāo)準(zhǔn)曲線法：配制一系列濃度成適當(dāng)比例的待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)溶液與試液在同一實(shí)驗(yàn)條件下，分別測(cè)定其吸光度，然后在坐標(biāo)紙上以A為縱坐標(biāo)，以C為橫坐標(biāo)作A-C曲線，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出試液吸光度所對(duì)應(yīng)的濃度。例:測(cè)定啤酒中二氧化硫殘留量時(shí)，吸取樣品１０.０ｍＬ，加入四氯汞鈉吸收液后定容１００ｍＬ，然后吸取１.０ｍＬ于25mL比色管中.另吸取2ug/mL的二氧化硫標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL分別置于25mL比色管中進(jìn)行比色測(cè)定，測(cè)得其吸光度分別為0.300、0.00、0.097、0.200、0.304、0.408、0.510、0.613，計(jì)算樣品中二氧化硫含量（ｇ／Ｌ）10.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)吸光度測(cè)量的誤差

對(duì)朗伯-比爾定律的偏移1非單色光引起的偏移復(fù)合光由l1和l2組成，對(duì)于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時(shí)線性關(guān)系向下彎曲。非均勻介質(zhì)

膠體，懸浮、乳濁等對(duì)光產(chǎn)生散射，使實(shí)測(cè)吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎2物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-PAR的偶氮－醌腙式化學(xué)反應(yīng)吸光度標(biāo)尺刻度不均勻3吸光度測(cè)量的誤差A(yù)＝0.434

，T＝36.8%

時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小A=0.2~0.8,T=15~65%，相對(duì)誤差<4%

dc/c=dA/A=dT/TlnT

Er=dc/c×100％=dA/A×100％=dT/TlnT×100％令ST=0.01,計(jì)算T不同值時(shí)的Sc/c，當(dāng)TlnT對(duì)T進(jìn)行微分時(shí)，其值為零時(shí)，Sc/c最小，此時(shí)T=0.368。1.示差吸光光度法目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度解決高(低)濃度組分(A在0.2~0.8以外)問題分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法特點(diǎn)：以標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白原理：A相對(duì)

=A=bcx-bc0=bc準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展,相對(duì)誤差減少,

c0愈接近c(diǎn)x,準(zhǔn)確度提高愈顯著10.7常用的吸光光度法例：硫脲還原－硫氰酸鹽比色法測(cè)定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸－高氯酸介質(zhì)中，硫脲還原鐵（III）為鐵(II),除干擾，還原鉬（VI）為五價(jià)，2.00mg/100ml的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線和測(cè)定樣品溶液的吸光度,480nm測(cè)定A。2.雙波長(zhǎng)吸光光度法目的：解決渾濁樣品光度分析消除背景吸收的干擾