產(chǎn)品微生物檢測(cè)方法

微生物檢測(cè)方法江西華清博恩生物科技有限公司夏翔一、產(chǎn)品采集與樣品處理1.1采樣比例于同一批號(hào)的三個(gè)運(yùn)輸包裝中至少抽取12個(gè)最小銷售包裝樣品，1／4樣品用于檢測(cè)，1／4樣品用于留樣，另1／2樣品（可就地封存）必要時(shí)用于復(fù)檢。1.2樣品處理取樣打開用于檢測(cè)的至少3個(gè)包裝準(zhǔn)確稱取10±1g樣品樣液制備剪碎后加入到200mL滅菌生理鹽水中（液體產(chǎn)品用原液直接做樣液）充分混勻，得到一個(gè)生理鹽水樣液待檢制備好的樣液送檢要及時(shí)，一般不超過3h，否則應(yīng)保持在1-5℃的環(huán)境中對(duì)于易死亡病原菌的樣液，可采用培養(yǎng)基培養(yǎng)1.3注意事項(xiàng)抽樣的最小銷售包裝不應(yīng)有破裂，檢驗(yàn)前不得啟開。

檢驗(yàn)應(yīng)在100級(jí)凈化條件采用無菌方法

如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導(dǎo)致不能吸出足夠樣液時(shí)，稀釋液量可按每次50mL遞增，直到能吸出足夠測(cè)試用樣液。在計(jì)算細(xì)菌菌落總數(shù)與真菌菌落總數(shù)時(shí)應(yīng)調(diào)整稀釋度。二、細(xì)菌菌落總數(shù)與初始污染菌檢測(cè)方法2.1操作步驟取樣待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作菌落計(jì)數(shù)接種共接種5個(gè)平皿，每個(gè)平皿中加入1ml樣液，然后用冷卻至45℃左右的熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15~20ml倒入每個(gè)平皿內(nèi)混合均勻。培養(yǎng)待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置于35±2℃培養(yǎng)48h后，計(jì)算平板上的菌落數(shù)。2.2結(jié)果報(bào)告

2.3復(fù)檢方法合格2次結(jié)果平均值都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定不合格有任何1次結(jié)果平均值超過本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定將留存的復(fù)檢樣品依前面操作復(fù)測(cè)2次三、真菌菌落總數(shù)檢測(cè)方法3.1操作步驟取樣待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作真菌計(jì)數(shù)接種共接種5個(gè)平皿，每個(gè)平皿中加入1ml樣液，然后用冷卻至45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養(yǎng)基15~25ml倒入每個(gè)平皿內(nèi)混合均勻培養(yǎng)待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置于25±2℃培養(yǎng)培養(yǎng)7天計(jì)數(shù)分別于3、5、7天觀察，計(jì)算平板上的菌落數(shù)，如果發(fā)現(xiàn)菌落蔓延，以前一次的菌落計(jì)數(shù)為準(zhǔn)3.2與細(xì)菌菌落總數(shù)檢測(cè)的差別細(xì)菌菌落總數(shù)檢測(cè)真菌菌落總數(shù)檢測(cè)培養(yǎng)基類型營養(yǎng)瓊脂沙氏瓊脂培養(yǎng)基容量15~20ml15~25ml培養(yǎng)溫度35±2℃25±2℃培養(yǎng)時(shí)間48h7天計(jì)數(shù)方式直接計(jì)數(shù)分別于3、5、7天觀察，計(jì)算平板上的菌落數(shù)，發(fā)現(xiàn)菌落蔓延，以前一次的菌落計(jì)數(shù)為準(zhǔn)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)小于等于200cfu/g小于等于100cfu/g3.3結(jié)果報(bào)告

3.4復(fù)檢方法將留存的復(fù)檢樣品依前面操作復(fù)測(cè)2次將留存的復(fù)檢樣品依前面操作復(fù)測(cè)2次合格2次結(jié)果平均值都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定不合格有任何1次結(jié)果平均值超過本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定四、大腸菌群檢測(cè)方法4.1操作步驟取樣液5ml接種50ml乳糖膽鹽發(fā)酵管，置35℃±2℃培養(yǎng)24h不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣大腸菌群陰性產(chǎn)酸產(chǎn)氣劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置于35℃±2℃培養(yǎng)18~24h取疑似菌落1~2個(gè)作革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)氣情況。4.2結(jié)果報(bào)告凡乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在伊紅美藍(lán)平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌，可報(bào)告被檢樣品檢出大腸桿菌。典型的大腸菌落為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌落。*相關(guān)拓展——革蘭染色法1、涂片接種環(huán)，挑取菌落，生理鹽水一滴，涂勻2、熱固定通過火焰若干次3、初染結(jié)晶紫一滴，1min，水洗4、媒染盧戈碘液一滴，1min，水洗5、脫色95%乙醇，30s或至無色為止6、復(fù)染復(fù)紅一滴，30s革蘭氏染色陰性革蘭氏染色陽性7、染色結(jié)果五、綠膿桿菌檢測(cè)方法5.1操作步驟取樣液5ml，加入到50mlSCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻，置35℃±2℃培養(yǎng)18~24h。從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板，置于35℃±2℃培養(yǎng)18~24h,觀察菌落特征。取可疑菌落涂片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性菌者應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn)如有綠膿桿菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液表面呈現(xiàn)一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其他菌不長(zhǎng)。氧化酶試驗(yàn)取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻棒挑取可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺試液，30s內(nèi)出現(xiàn)粉紅色或紫紅色，為氧化酶試驗(yàn)陽性，不變色者為陰性。綠膿菌素試驗(yàn)取2~3個(gè)可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基斜面，35℃±2℃培養(yǎng)24h，加入三氯甲烷3~5ml,充分振蕩使培養(yǎng)物中可能存在的綠膿菌素溶解，待三氯甲烷呈藍(lán)色時(shí)，用吸管移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1ml，振蕩后靜置片刻。如上層出現(xiàn)粉紅色或紫紅色即為陽性，表示有綠膿菌素存在。硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)挑取被檢菌落純培養(yǎng)物接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置35℃±2℃培養(yǎng)24h,培養(yǎng)基小倒管中有氣者即為陽性。明膠液化試驗(yàn)取可疑菌落純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置35℃±2℃培養(yǎng)24h取出放于4~10℃，如仍呈液態(tài)為陽性，凝固者為陰性。42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)取可疑培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置42℃培養(yǎng)24~48h,有綠膿桿菌生長(zhǎng)為陽性。5.2結(jié)果報(bào)告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿桿菌試驗(yàn)均為陽性者，即可報(bào)告被檢品中檢出綠膿桿菌。如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。特征性檢驗(yàn)

氧化酶

綠膿菌素

硝酸鹽還原

明膠液化

42℃生長(zhǎng)

試驗(yàn)

試驗(yàn)

產(chǎn)氣試驗(yàn)

試驗(yàn)

試驗(yàn)取菌+1滴接菌，37℃接菌

接菌

接菌二甲基對(duì)24h+氯仿37℃24h

37℃24h

42℃24h苯二胺移出+鹽酸紫紅色（+）紫紅色（+）有氣體（+）溶解成液狀（+）生長(zhǎng)（+）不變色（-）不變色（-）無氣體（-）未溶解（-）不生長(zhǎng)（-）

六、金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法6.1操作步驟取樣液5ml，加入到50mlSCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻，置35℃±2℃培養(yǎng)24h自上述增菌液中取1~2接種環(huán)，劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置35℃±2℃培養(yǎng)24~48h。挑取典型菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄狀，無芽胞與莢膜鏡檢符合上述情況，應(yīng)進(jìn)行甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)及血漿凝固酶試驗(yàn)在血瓊脂平板上該菌菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。6.1操作步驟甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取上述菌落接種甘露醇培養(yǎng)液，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸者為陽性。血漿凝固酶試驗(yàn)：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔血漿挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合5min如血漿內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝固陽性兩者均無凝固陰性鹽水滴與血漿滴均有凝固現(xiàn)象進(jìn)行試管凝固酶試驗(yàn)吸取1：4新鮮血漿0.5ml，放滅菌小試管中，加入等量待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml放35℃±2℃溫箱或水浴中，每半小時(shí)觀察一次,24h之內(nèi)呈現(xiàn)凝塊陽性6.2結(jié)果報(bào)告凡在瓊脂平板上有可疑菌落生長(zhǎng)，鏡檢為革蘭氏陽性葡萄球菌，并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗(yàn)陽性者，可報(bào)告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。七、溶血性鏈球菌檢測(cè)方法7.1操作步驟取液取樣液5ml加入到50ml葡萄糖肉湯，35℃±2℃培養(yǎng)24h接種將培養(yǎng)物劃線接種血瓊脂平板，35℃±2℃培養(yǎng)24h觀察菌落特征溶血性鏈球菌在血平板上為灰白色，半透明或不透明，針尖狀突起，表面光滑，邊緣整齊，周圍有無色透明溶血圈鏡檢挑取典型菌落作涂片革蘭氏染色鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陽性，呈鏈狀排列的球菌鏈激酶試驗(yàn)吸取草酸鉀血漿0.2ml（0.01g草酸鉀加5ML兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液），加入0.8ml滅菌生理鹽水，混勻后再加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml和0.25%氯化鈣0.25ml,混勻，放35℃±2℃水浴中，2min觀察一次（一般10min內(nèi)可凝固），待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時(shí)間。如2h內(nèi)不溶化，繼續(xù)放置24h觀察，如凝塊全部溶