腫瘤部位光敏劑濃度檢測

腫瘤部位光敏劑濃度檢測新技術(shù)講座一課題背景及研究目的和意義二國內(nèi)外研究狀況及分析三研究思路及方法四實驗中發(fā)現(xiàn)的問題光動力學(xué)療法（PDT）具有組織選擇性好、對微血管組織的損傷作用強、全身副反應(yīng)少等特點[1,2]。PDT治療：將某種外源性光敏物質(zhì)注射入生物組織中，在激勵光源照射下，光敏物質(zhì)吸收光子能量后，由基態(tài)變成激發(fā)態(tài)，之后又退激發(fā)并返回基態(tài)的過程中生成大量活性氧物質(zhì)(ROS)，其中最主要的是單線態(tài)氧(1O2)，1O2是一種光毒性物質(zhì)，能與多種生物大分子相互作用，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)或影響細(xì)胞功能，從而對病變組織產(chǎn)生治療作用。光動力學(xué)療法有望克服傳統(tǒng)診療方法的缺點和不足，為癌癥的治療提供了新的途徑和可能，由此可見，對其診療癌癥的研究是非常必要的[3]。在臨床上有一定的治療效果，但治療劑量受到光敏劑濃度的影響，所以在治療前需要對光敏劑濃度給予定量檢測。課題背景4研究目的和意義經(jīng)過歸納分析提出：激光、氧和光敏劑是影響光動力學(xué)療法的生物學(xué)效應(yīng)的三要素[4,5]，它們之間的量效關(guān)系相當(dāng)復(fù)雜[6]，治療過程中靶組織內(nèi)光敏劑的含量是影響光動力反應(yīng)效果的重要因素[7]。不同的患者藥代動力學(xué)同，所以在PDT治療前需要實際測量每一位患者腫瘤部位光敏劑含量[8-11]?？紤]到，非接觸式熒光光譜測量載體光敏劑濃度[12]區(qū)別傳統(tǒng)的接觸式的、耗時長的、破壞性的測量方式[13]，對載體動物實驗以至于臨床診斷及治療有著非常重要的作用。載體測量光敏熒光光譜信號會受到測量的腫瘤的形狀、生物組織的吸收和散射等影響[14,15]，導(dǎo)致測得的熒光強度不能精確地反應(yīng)光敏劑濃度。目前在光動力臨床治療中，光敏劑熒光診斷還處于離體測量的階段，不能準(zhǔn)確的獲得臨床載體光敏劑定量測量，無法確定每一患者在注入光敏劑后某些時間段的光敏劑濃度是否達(dá)到光動力治療標(biāo)準(zhǔn)，從而限制了光動力治療疾病的使用。熒光光譜方法測量腫瘤細(xì)胞光敏劑含量國外研究狀況1996年以前，光敏劑熒光診斷光敏劑濃度的方法被廣泛的研究[16-19]，但所有載體輻射熒光檢測不僅受到光敏劑濃度的影響還受到測量腫瘤部位的幾何形狀、生物組織對激勵波長與輻射波長吸收與散射的影響[16-19]。當(dāng)獲得生物組織的吸收、散射等光學(xué)特性參量時，被改變的熒光光譜輪廓可能被修正，由熒光團所確定的光敏劑濃度的準(zhǔn)確度可以達(dá)到±15%[20]。實驗與蒙特卡洛仿真同時證明了通過減少測量樣品的直徑約100um或更少來降低生物組織的散射和吸收的影響，使得熒光強度與英光團濃度呈線性關(guān)系[21，22]。1997年，R.A.Weersink研究小組提出了另一種方法[23]，即反射光譜的漫反射近似可以用于確定光敏劑的濃度，生物組織反射光可以通過帶有多個激勵源與探測分離的面探頭來測量，這里散射與吸收系數(shù)都可以通過漫反射來推算。在皮膚表面及新西蘭白鼠身上，這種方法被用來研究光敏劑濃度。對于內(nèi)臟器官的實際與測量的光敏劑濃度都一致，但在皮膚組織上實際值與測量值相比低了3倍，并且光纖頭太大以至于不適用于內(nèi)窺鏡通道的適用。圖1后向散射光測量方法光纖結(jié)構(gòu)示意圖，其中一根為激勵光纖其他為探測光纖圖2在442nm激勵下探測的熒光強度與后向散射強度的比值隨光敏劑吸收吸收的變化情況1997年，JudithR.Mourant研究小組發(fā)現(xiàn)采用分離式激勵與接收方式（間距約為1.7mm）反射光譜與吸收系數(shù)之間的線性關(guān)系，通過測量生物組織的彈性散射譜來計算組織內(nèi)相關(guān)復(fù)合物的濃度[23]。在1999年該方法被用于組織內(nèi)光敏劑藥物濃度的檢測[24]。2000年，該研究小組采用分光手段提出一個無創(chuàng)的實時光敏劑治療藥物濃度檢測方法，如圖1所示。該方法通過穩(wěn)態(tài)的熒光光譜儀對熒光的后向散射進行測量，發(fā)現(xiàn)熒光強度與激勵光后向散射光強度的比值與光敏劑吸收系數(shù)存在線性關(guān)系，如圖2所示。2000年，BrianW.Pogue[26]研究小組采用了一個實驗方案如圖3所示，證明了微小采樣方法（選用間隔700um多路直徑為100um的光纖）可以增加探測返回?zé)晒庑盘柕膹姸?，減小生物組織對光敏劑熒光的影響。圖3左圖為光纖測試系統(tǒng)示意圖，右圖為微小采樣的多路光纖束浸入生物組織的示意圖，注本圖沒有顯示出所有的光纖個數(shù)，實驗中采用37路光纖束。圖4在注入AIS2Pc光敏劑后測得的熒光強度隨化學(xué)萃取法測量的浸入濃度變化情況，左圖為動物內(nèi)臟右圖為肌肉組織在同一個人的測量結(jié)果，兩圖給出的斜率相似表明生物住在的類型對本探測響應(yīng)幾乎無關(guān)。該研究小組進行了小鼠肝臟與肌肉組織下注射光敏劑的活體實驗，驗證了不同組織的光敏熒光信號強度隨光敏劑（ALS2Pc）浸入濃度（通過對組織提取測量的結(jié)果）的響應(yīng)斜率較為相近11%，如圖4所示。表明探測器響應(yīng)幾乎不受到生物組織的影響，所以該實驗方法可以減少生物組織熒光噪聲對光敏劑熒光的影響。2007年，WilsonBC研究小組探索了新的光動力計量方法，提出通過特定的單線態(tài)氧熒光探測與基于光敏劑漂白計量方式相結(jié)合的全光的計量方法[27]，如圖5所示。圖5單線態(tài)氧光譜強度與光敏劑熒光探測系統(tǒng)的示意圖。熒光光譜方法測量腫瘤細(xì)胞光敏劑含量國內(nèi)研究狀況1.目前國內(nèi)在光敏劑濃度方面的研究主要有解放軍總醫(yī)院顧英教授與北京理工大學(xué)于常青副教授進行研究，在2008年該研究小組對皮膚表面鮮紅斑痣光動力治療中皮膚光敏劑含量的光譜信息提取方面的研究[28]。該實驗方案主要有半導(dǎo)體激光器作為光源、單路激勵光纖與多路接收光纖探頭、光纖光譜儀以及手提電腦的實驗設(shè)備來完成如圖6所示。在440nm的激發(fā)下對皮膚組織的熒光光譜及注射光敏劑（PSD007）后的熒光光譜給予測量，并觀察了注射光敏劑幾分鐘后光譜的紅移譜峰，如圖7，8所示。圖6熒光光譜儀的各個組成部分圖7注射光敏劑后PDT治療中PWS皮膚和正常皮膚的熒光光譜對照圖8照光前后PSD007白蛋白緩沖溶液的熒光光譜圖8顯示出670nm處又出現(xiàn)了一個熒光峰，這是光敏劑受光照射后產(chǎn)生光產(chǎn)物的特征峰皮膚熒光主要來自于皮膚自體熒光、光敏劑熒光和光產(chǎn)物熒光認(rèn)為PWS皮膚實測光譜在排除血紅蛋白和黑色素的吸收后主要為三種基本熒光物質(zhì)的熒光光譜的疊加：皮膚自體熒光（主要熒光物質(zhì)來源是黃素腺嘌呤二核苷酸，簡稱FAD）、光敏劑熒光以及光產(chǎn)物熒光?；诠庾V在腫瘤組織部位的疊加原理需要從各自的水溶液中提取FAD、光敏劑、光產(chǎn)物的特征光譜，并通過實際測量取得人體皮膚血紅蛋白和黑色素的吸收譜。由于PSD007熒光特征峰、光產(chǎn)物熒光特征峰以及血紅蛋白吸收峰較為對稱且接近高斯形態(tài)，因而對其采用高斯擬合；而FAD的熒光峰以及黑色素吸收譜都不對稱，采取多項式擬合方式。由于熒光光譜采集數(shù)據(jù)間隔很小，數(shù)據(jù)量很大，數(shù)據(jù)分布均勻，且互不相關(guān)，方程組求解采用一般的最小二乘回歸即可兩個患者的臨床測量結(jié)果與擬合結(jié)果的對比圖圖9臨床實測光譜與擬合光譜對比結(jié)果2.在2008年，哈爾濱工業(yè)大學(xué)張治國教授課題組建立了用于牙結(jié)石的熒光比例方法[29]，并取得較高的靈敏度。離體的腫瘤細(xì)胞的光敏劑熒光與自體熒光密度譜線一定波長范圍積分的比值與光敏劑濃度存在線性關(guān)系，熒光比例的公式為：OP=(SB-SC)/SAOP=SB/SA?α，α=SC/SA上式中α定義為自體熒光系數(shù)，對于同一物質(zhì)

α為一常數(shù)，通過計算得出不加光敏劑的Eca-109細(xì)胞所對應(yīng)的α

為0.145。該公式的圖像表示形式如圖10所示，其值與光敏劑濃度獲得的線性關(guān)系如圖11所示。圖10光敏劑濃度參量的原理圖SA是以490nm的熒光峰為中心，兩端為熒光強度衰減到初始的1/e處的熒光曲線下的面積，表征了細(xì)胞自體熒光的強度。SB是以630nm的熒光峰為中心，兩端為熒光強度衰減到初始的1/e處的熒光曲線下的面積。SC是不加光敏劑的Eca-109細(xì)胞在以630nm的熒光峰為中心，兩端為熒光強度衰減到初始的1/e處的熒光曲線下的面積，(SB?SC)表征了HMME光敏劑的熒光強度。圖11不同濃度HMME溶液OP值擬合曲線三、研究思路及方法1.理想定標(biāo)：確定純光敏劑不同濃度與激發(fā)光敏劑特征峰值熒光光譜相對強度線性關(guān)系。2.離體定標(biāo)：a，確定浸入腫瘤細(xì)胞內(nèi)光敏劑不同濃度與激發(fā)光敏劑特征峰值熒光光譜相對強度線性關(guān)系；b，確定浸入腫瘤細(xì)胞內(nèi)光敏劑不同濃度與激發(fā)光敏劑熒光和自體熒光特征峰比值的線性關(guān)系。3.載體測量：對小鼠體表腫瘤在注入一定劑量光敏劑后，每間隔一定時間進行激發(fā)腫瘤獲得其熒光光譜相對強度，并根據(jù)其強度值及已知的線性關(guān)系，推算此時腫瘤細(xì)胞內(nèi)的光敏劑濃度值。4.閾值濃度：可進行有意義的光動力治療時最小的光敏劑濃度值。實驗方案設(shè)計載體測量實驗光敏劑濃度，腫瘤與非腫瘤熒光相對強度比值，閾值光敏劑濃度光敏劑濃度，腫瘤與非腫瘤熒光相對強度比值，閾值光敏劑濃度對比分析理想定標(biāo)實驗離體定標(biāo)實驗線性關(guān)系理論模型一（這里給出理想檢測時吸收激勵光與激發(fā)熒光之間的關(guān)系，未考慮腫瘤細(xì)胞對激勵光的散射、吸收、收集效率及腫瘤形狀等因素）（1）（2）線性關(guān)系物理模型二：單一波長激勵下光敏劑熒光相對與自體熒光的相對強度與光敏劑濃度線性關(guān)系。在波長激發(fā)下的公式關(guān)系（4）（5）（6-1）（6-2）考慮實際測量光譜值并非理論真實值，則定義如下關(guān)系式：（7）則（7）式可改寫為：（8）上式中，N/R被認(rèn)為待測熒光組織及返回激發(fā)光產(chǎn)生的背景噪聲。物理模型三：雙波長激勵下可消去噪聲對線性關(guān)系的影響。同理另一個波長激勵下（9）(8)式與(9)式相減：（10）令則有（11）當(dāng)待測腫瘤細(xì)胞濃度確定時，為常量。光譜分析實驗研究實驗方案：

采用熒光質(zhì)量分析儀對正常細(xì)胞、PSD007孵化腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞熒光光譜進行檢測。

正常細(xì)胞：大鼠的脾臟白細(xì)胞；腫瘤細(xì)胞:LG12實驗內(nèi)容：

確定細(xì)胞自體熒光、PSD007光敏劑熒光、ALA光敏劑熒光特征峰的位置，對激發(fā)光源波長進行指導(dǎo)。PSD007吸收光譜測量結(jié)果No. 波長(nm)吸收值 1 619.50 0.275

2 568.00 0.560 3 540.00 0.629 4 505.50 0.852 5 405.00 3.456 6 360.00 4.039 7 352.00 4.039 8 338.00 3.914 405nm激發(fā)下正常組織細(xì)胞熒光譜400nm激發(fā)下腫瘤+PSD007光敏劑熒光譜635nm激勵下未發(fā)現(xiàn)熒光信號細(xì)胞實驗研究-理想定標(biāo)離體細(xì)胞定標(biāo)實驗方案：激發(fā)光源：405nm連續(xù)激光器、熒光質(zhì)量分析儀待測樣品：純不同濃度PSD007、孵化白血病腫瘤細(xì)胞光線探頭：平頭多纖芯NA=0.22醫(yī)用光纖光譜儀：USB400、tristan光纖光譜儀（300-1000nm）

實驗內(nèi)容：找到合適的光纖光譜儀積分時間。調(diào)節(jié)光纖探頭位置，找到距離待測樣品的合適位置。測量不同濃度下光敏劑熒光相對強度。激光激勵與熒光質(zhì)量分析儀兩種方法下測量結(jié)果進行對比。熒光質(zhì)量分析儀獲得不同濃度PSD007光敏劑測量結(jié)果熒光特征峰614nm處相對強度與光敏劑濃度之間線性關(guān)系濃度范圍0.019ug/ml-5ug/ml濃度范圍0.019ug/ml-0.625ug/ml理想定標(biāo)線性關(guān)系曲線——熒光質(zhì)量分析儀PSD007孵化白血病腫瘤細(xì)胞測量結(jié)果——低濃度405nm光源激發(fā)下不同孵化濃度腫瘤細(xì)胞光敏劑熒光強度405nm光源激發(fā)下腫瘤細(xì)胞裂解后光敏劑熒光強度裂解前激發(fā)腫瘤細(xì)胞獲得光敏劑熒光強度（高濃度孵化）裂解后激發(fā)純光敏劑熒光強度（高濃度孵化）PSD007孵化白血病腫瘤細(xì)胞測量結(jié)果——高濃度孵化濃度為（6.25ug/ml-100ug/ml）PSD007，浸入細(xì)胞內(nèi)濃度與光敏劑熒光特征峰（616nm）強度的線性關(guān)系孵化細(xì)胞后離體定標(biāo)線性關(guān)系曲線——熒光質(zhì)量分析儀光譜儀405nm激光器待測樣品光纖探頭高精度三維手動位移臺激光器連接頭光譜儀連接頭405nm激勵下PSD007的熒光光譜信號低濃度光敏劑與激發(fā)熒光特征峰值(614.9nm)的線性關(guān)系405nm激發(fā)下的線性標(biāo)定曲線——LD光源405nm激光激發(fā)下白血病腫瘤細(xì)胞熒光信號裂解前細(xì)胞內(nèi)光敏劑的熒光光譜信號裂解后的熒光光譜信號405nm激光激發(fā)裂解后提取PSD007熒光光譜注：裂解前405nm激光激發(fā)腫瘤細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)熒光信號孵化濃度（ug/ml）100502512.56.25浸入濃度（ug/ml）熒光質(zhì)量分析儀0.5902910.3605720.204140.1177780.07524激光激發(fā)0.430620.2693620.2195620.1389330.07609孵化濃度為（6.25ug/ml-50ug/ml）PSD007，浸入細(xì)胞內(nèi)濃度與光敏劑熒光特征峰（613nm）強度的線性關(guān)系兩種實驗條件下同樣待測樣品獲得光敏劑孵化濃度推算結(jié)果如下表生物組及其腫瘤實驗研究實驗方案：激發(fā)光源：405nm連續(xù)激光器、熒光質(zhì)量分析儀待測樣品：PSD007浸入小鼠直腸及小鼠皮下植入腫瘤組織光線探頭：平頭多纖芯NA=0.22醫(yī)用光纖光譜儀：USB400、tristan光纖光譜儀（300-1000nm）

實驗內(nèi)容：小鼠分別采用涂抹與靜脈注射兩種方式給藥。40