工程合成生物構(gòu)建技術(shù)

工程合成生物構(gòu)建技術(shù)第一頁，共八十頁，2022年，8月28日現(xiàn)代制藥工藝學-生物制藥部分的基本要求(1)了解前沿進展(2)掌握基本原理和技術(shù)(3)能設計相關(guān)工藝實驗研究的技術(shù)方案(4)重點掌握授課內(nèi)容(5)下載相關(guān)文獻,掌握其中核心知識和技術(shù)第二頁，共八十頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容第一講工程生物的構(gòu)建原理與技術(shù)第二講青蒿素前體的合成生物技術(shù)第三講重組人干擾素產(chǎn)品創(chuàng)新與工藝研究第三頁，共八十頁，2022年，8月28日工程生物engineeredorganisms通過基因工程、轉(zhuǎn)基因、合成生物學等工程技術(shù)創(chuàng)造的生物重組微生物，合成微生物轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動物工程生物第四頁，共八十頁，2022年，8月28日1998-2002年，歐盟第五框架計劃實施細胞工廠(cellfactory)項目，其目的是全面了解應用微生物。美國：生物學角度，最小基因組(minimizedgenome)是由一套生物生存必需的最小基因組成。日本：2001年，從工業(yè)應用角度，具有最小基因組的工業(yè)微生物就是最小基因組工廠（minimizedgenomefactory）。最小基因組工廠是具有工業(yè)生產(chǎn)必需基因，而非必需基因和有害基因已經(jīng)被刪除的微生物。它不僅簡單，而且是又容易工業(yè)過程控制。2002年創(chuàng)辦國際刊物《MicrobialCellFactories》，報道微生物細胞作為重組蛋白、天然產(chǎn)物的生產(chǎn)者，或生物轉(zhuǎn)化的催化劑等方面的研究進展和論文。中國：2010年以后，人工細胞工廠，人工生物體系，人工生物系統(tǒng)最小基因組工廠第五頁，共八十頁，2022年，8月28日繼人類基因組研究之后，生物領(lǐng)域一熱門學科，是整體系統(tǒng)論生物學思潮在工程學領(lǐng)域的再現(xiàn)。

合成生物學（syntheticbiology）的概念合成生物學按照人類的目的設計并創(chuàng)造新的生命元件器件，功能模塊乃至自然界不存在的生命系統(tǒng);對現(xiàn)有的生命體進行有意義的工程改造，賦予其新的功能。合成生物學的核心思想是，認為生命的所有元件都能由化學方法來合成制造，并進而通過工程化方式組裝成實用的生物體。第六頁，共八十頁，2022年，8月28日1911：《柳葉刀》，出現(xiàn)“合成生物學”2000年以后，迅速發(fā)展，注意力轉(zhuǎn)向該領(lǐng)域2004年（MIT）Technology

Review，合成生物學評為“將改變世界的十大新技術(shù)”之一2004年開始，全球iGEM比賽（大學生遺傳機器作品）2004年6月：MIT，第1屆合成生物學國際會議(SB1.0)2005年5月：UC伯克利,SB2.0；2007年6月，瑞士，SB3.02008年10月：香港，SB4.0；2011年6月:StanfordU,SB5.02013年7月，英國倫敦，SB6.02012年，ACSSyntheticBiology合成生物學的學術(shù)交流合成生物學

概述第七頁，共八十頁，2022年，8月28日2002年Cello等合成脊髓灰質(zhì)炎病毒的cDNA（Science,

2002，297：1016-1018），2005年Endy等合成噬菌體T7基因組（MolSystemsBiology，2005，1：1-10）2007年CraigJ.Venter研究所（CJVI）實現(xiàn)了基因組的物種間人工移植（Science，2007，317:632-638）2008年該所人工全合成了生殖衣原體細菌基因組（Science,2008，319：1215-1220）2009年利用酵母對克隆的基因組進行工程化組裝（Science,2009，325:1693-1696），2010年CJVI合成活細菌2011年合成酵母染色體臂2014年，合成酵母III號染色體基因組合成的技術(shù)發(fā)展第八頁，共八十頁，2022年，8月28日從頭合成DNA的里程碑事件1955,二聚體dTdT(2nt)1968,酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移RNA(77nt)1981,人干擾素a(514bp)2002,脊髓灰質(zhì)炎病毒(7501bp)2004,6脫氧紅霉素內(nèi)酯B合成酶基因簇DEBS(31656bp)2008,支原體基因組(582970bp)2010,支原體細菌2014，酵母染色體基因組工程基因組合成基因合成第九頁，共八十頁，2022年，8月28日合成生物學合成生物的單元合成生物的設計與優(yōu)化生物元器件生物元器件第十頁，共八十頁，2022年，8月28日類型計算機生命系統(tǒng)system全局全球網(wǎng)生命體局部局域網(wǎng)組織或器官個體單臺細胞器件devices芯片基因組，復制/轉(zhuǎn)錄/翻譯裝置功能單元模塊代謝途徑元件parts電子元件生物元件合成生物學與計算機工程的層階比較

合成生物學第十一頁，共八十頁，2022年，8月28日1、基因元件基因（生物）元件：具有某種特定的生物學功能的DNA，是設計和合成生物的基本單位。特性：信號接受和輸入功能，信號發(fā)送和產(chǎn)物輸出功能，調(diào)節(jié)信息流、代謝和生物合成的功能，和其他元件相互作用，具有特定的工作環(huán)境。功能元件：編碼1個/組生化反應酶功能基因/基因簇；編碼組成細胞組分蛋白質(zhì)的基因界面調(diào)控元件:包括功能基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯與修飾、功能酶反應等的調(diào)控基因。合成生物的單元合成生物學生物元器件第十二頁，共八十頁，2022年，8月28日基因元件的圖形編碼-制圖復制子

啟動子

阻遏子

誘導子

終止子

RBS

功能基因

MCS

抗性

合成生物學生物元器件基因（生物）元件：具有某種特定的生物學功能的DNA，是設計和合成生物的基本單位。第十三頁，共八十頁，2022年，8月28日生物部件：由一個或多個基因元件組成最簡單的能行使催化功能的生物部件是完整的編碼酶基因表達盒。啟動區(qū)功能基因終止區(qū)合成生物學生物元器件第十四頁，共八十頁，2022年，8月28日生物模塊是一組細胞內(nèi)區(qū)域化的生物部件，由內(nèi)在功能聯(lián)系在一起，執(zhí)行特定的復雜功能。如代謝途徑、信號轉(zhuǎn)導途徑、調(diào)控途徑等。模塊：通過某種（邏輯/功能）關(guān)系把生物元件連接而成與電子科學中的電路類似，在合成生物學，不同功能的生物磚聯(lián)接后，能像電路一樣運行，形象地稱為基因線路（geneticcircuit）。按功能分為:代謝線路,調(diào)控線路,信號線路等生物模塊與基因電路合成生物學生物元器件第十五頁，共八十頁，2022年，8月28日EndyD提出了合成生物學設計的工程策略：標準化、解耦聯(lián)和抽提。標準化：確立基本生物元件的方法、對生物功能的定義和特征描述。解耦聯(lián)：復雜系統(tǒng)解分成具有獨立功能的簡單組分。抽提：建立元件和模塊的層階。合成生物的設計與優(yōu)化合成生物學生物元器件第十六頁，共八十頁，2022年，8月28日抽提：一個反應對應一個酶，一個酶對應一個基因。功能模式：基因表達調(diào)控的操縱子模型。優(yōu)化：功能基因密碼子、啟動子、核糖體結(jié)合位點。適合于不同宿主表達的生物元件。1、生物元件的設計與優(yōu)化合成生物學生物元器件第十七頁，共八十頁，2022年，8月28日生物磚構(gòu)建基因電路的困難是，把相同功能的不同生物來源的生物磚集成基因電路后，不一定具有功能。優(yōu)化方法可以是基于數(shù)學模擬的理性設計，也可以是生物元件的直接進化。2.基因電路的設計與優(yōu)化合成生物學生物元器件第十八頁，共八十頁，2022年，8月28日iGEM（InternationalGeneticallyEngineeredMachine）競賽，在美國麻省工學院（MIT）收集每年參賽者貢獻的生物元器件，建立了標準生物元件庫（RegistryofStandardBiologicalParts）()。經(jīng)過10年的收集，該文庫的元器件以BBa為字頭，容量已達到約2萬個。生物元件庫合成與裝配第十九頁，共八十頁，2022年，8月28日數(shù)據(jù)庫RegulonDB中，大腸桿菌天然操縱基因中有1000余個啟動子，及其他功能元件序列。數(shù)據(jù)庫BIOFAB（InternationalOpenFacilityAdvancingBiotechnology，/data）有數(shù)千個人工合成并表征的啟動子、核糖體結(jié)合位點等元件。天津大學生物信息學中心建有必需基因數(shù)據(jù)庫（/deg），包括大腸桿菌、芽孢桿菌、結(jié)核桿菌等31種原核生物，人、小鼠、線蟲、果蠅、酵母、擬南芥等10余種真核生物。生物元件庫合成與裝配第二十頁，共八十頁，2022年，8月28日合成生物學的研究與應用第二十一頁，共八十頁，2022年，8月28日自然細胞基因組（龐大）人工細胞細胞網(wǎng)絡（松散）genegeneRNAprotein目標產(chǎn)物細胞工廠（低效）細胞網(wǎng)絡（緊湊）人工細胞工廠（高效,新功能）RNAprotein目標產(chǎn)物genegene功能模塊合成簡化解耦ATCG…合成生物學的研究思路底盤細胞能源/藥物底盤構(gòu)建重構(gòu)自然細胞新功能/用途人工合成新生物系統(tǒng)模塊設計ABCDEFG抽提第二十二頁，共八十頁，2022年，8月28日工程生物構(gòu)建的基本過程基因元件設計基因線路合成制藥工程生物功能底盤細胞遺傳轉(zhuǎn)化底盤細胞設計基因組編輯基因元件合成適配性篩選氨基酸，維生素，抗生素，抗癌藥物，聚酮，萜類等第二十三頁，共八十頁，2022年，8月28日第一講工程生物的構(gòu)建原理與技術(shù)DNA體外重組技術(shù)/基因工程生物元件的組裝技術(shù)/元件工程基因組的編輯技術(shù)/基因組工程第二十四頁，共八十頁，2022年，8月28日體外重組是把不同來源的DNA分子用特異性酶切割，然后將兩者連接成雜合分子。體外重組的兩大工具:核酸限制性內(nèi)切酶和連接酶，如同剪刀和膠水。DNA片段1DNA片段2

酶切可連接的片段

載體重組DNA分子

連接酶DNA元件的體外重組第二十五頁，共八十頁，2022年，8月28日基因的體外重組基因重組示意圖第二十六頁，共八十頁，2022年，8月28日載體/質(zhì)粒酶：限制性內(nèi)切酶，連接酶，聚合酶DNA體外重組工具第二十七頁，共八十頁，2022年，8月28日基因元件載體載體kb容量kb宿主導入方式復制子質(zhì)粒載體3-55-10Ec轉(zhuǎn)化ColE1λ噬菌體30-447-23Ec轉(zhuǎn)導ColE1黏粒5-830-45Ec轉(zhuǎn)導ColE1P13070-100Ec轉(zhuǎn)導P1PAC20130-150Ec電轉(zhuǎn)化P1BAC7-9120-300Ec電轉(zhuǎn)化FYAC10-15250-2000Yeast轉(zhuǎn)化ARS載體/質(zhì)粒Vector：基因的攜帶者第二十八頁，共八十頁，2022年，8月28日復制起始點選擇標記多克隆位點質(zhì)粒載體基因元件的載體1.結(jié)構(gòu)第二十九頁，共八十頁，2022年，8月28日自主復制性:復制起始點以及控制復制頻率的調(diào)控基因。不相容性:具有相同或相似復制子結(jié)構(gòu)及特征的的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地存在于同一受體細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)移性：從一個宿主細胞轉(zhuǎn)移到另一個宿主細胞。選擇標記：抗生素抗性基因等。表達功能:能轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外源基因的產(chǎn)物?；蛟妮d體2.質(zhì)粒的特性第三十頁，共八十頁，2022年，8月28日克隆質(zhì)粒：用于克隆和擴增外源基因。測序質(zhì)粒：用于基因測序。整合質(zhì)粒：用于外源基因與宿主染色體整合。穿梭質(zhì)粒：能在兩種宿主細胞存在。表達質(zhì)粒：能表達基因產(chǎn)物。基因元件的載體3.質(zhì)粒的類型第三十一頁，共八十頁，2022年，8月28日噬菌粒載體：由絲狀噬菌體DNA復制起始位點序列與質(zhì)粒組成的雜合分子。M13噬菌體間隔區(qū)克隆到質(zhì)粒上，形成噬菌粒。特點：象質(zhì)粒一樣，自主復制而穩(wěn)定遺傳。象噬菌體一樣，包裝成顆粒，分泌胞外?；蛟贛13載體和質(zhì)粒載體之間的轉(zhuǎn)移。激活過程：輔助絲狀噬菌體感染帶有噬菌粒的受體細胞，反式激活噬菌粒上的間隔區(qū)位點，啟動噬菌粒以絲狀噬菌體DNA的復制模式進行復制。分別包裝成顆粒并分泌到受體細胞外。基因元件的載體噬菌粒載體第三十二頁，共八十頁，2022年，8月28日含有噬菌體f1間隔區(qū)的載體：pBS，pGEM11Zf，pBluescript?；蛟妮d體第三十三頁，共八十頁，2022年，8月28日由λDNA的cos區(qū)與質(zhì)粒DNA重組而成，主要用于基因文庫的構(gòu)建。λDNAcos位點及其附近區(qū)域的DNA片段為1.7kb質(zhì)粒DNA為3.3kb構(gòu)成的黏粒總共5kb最大裝載量達45kb基因元件的載體黏粒載體，考斯質(zhì)粒第三十四頁，共八十頁，2022年，8月28日大腸桿菌-哺乳動物細胞穿梭載體第三十五頁，共八十頁，2022年，8月28日pUC復制子，ΦC31

整合酶，位點特異性整合在鏈霉菌基因組的att位點

oriT

大腸桿菌與鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移aac3(IV)

安普抗性基因，大腸桿菌和鏈霉菌中篩選標記BamHI克隆位點：天然產(chǎn)物生物合成基因簇大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體第三十六頁，共八十頁，2022年，8月28日pRS313,大腸桿菌-酵母穿梭載體酵母復制子大腸桿菌篩選標記大腸桿菌復制子酵母篩選標記多克隆位點第三十七頁，共八十頁，2022年，8月28日大腸桿菌-鏈霉菌-酵母穿梭載體第三十八頁，共八十頁，2022年，8月28日大腸桿菌-棒桿菌穿梭載體KanR，可移動整合表達載體游離表達載體第三十九頁，共八十頁，2022年，8月28日概念：在特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應的限制性片段。種類：I類限制性內(nèi)切酶：識別位點和切點不同，切斷部位不定。II類限制性內(nèi)切酶：嚴格識別,特異性切割。III類限制性內(nèi)切酶：特異性切割，識別部位和切點不同。1.概念與種類限制性核酸內(nèi)切酶第四十頁，共八十頁，2022年，8月28日基本名稱：生物拉丁文名稱屬名的第一個大寫字母和種名的前兩各小寫字母縮寫構(gòu)成（斜體）。如果酶存在于一種菌株中，加株名的一個大寫字母。如果酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，用一個大寫字母表示這些非染色體的遺傳物質(zhì)。酶名稱的最后部分為羅馬數(shù)字，表示該生物體中發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。舉例：HindⅢ，Haemophilusinfluenzaed株中發(fā)現(xiàn)第三個酶。2.Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶的命名規(guī)則基因的體外重組第四十一頁，共八十頁，2022年，8月28日4、5或6個堿基對，而且具有180°旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu)。EcoRI的識別序列為：5′—GAATTC—3′3′—CTTAAG—5′有些酶切割后產(chǎn)生平末端,大部分酶切割后產(chǎn)生黏末端，5′或3′突出末端。3.內(nèi)切酶的識別序列基因的體外重組第四十二頁，共八十頁，2022年，8月28日EcoRⅠ酶切后形成5′突出端

EcoRⅤ酶切后形成平末端

PstⅠ酶切后形成3′突出端

基因的體外重組第四十三頁，共八十頁，2022年，8月28日活性單位（1U）定義：為50μl反應體系中，特定溫度下經(jīng)過1小時反應，完全分解1μgDNA所需酶量。甲基化：從帶有DNA甲基化酶基因的宿主中分離制備DNA，其堿基一部分被甲基化，影響酶識別和切割能力，甚至不能切割。星號活性：限制性酶對底物的特異性降低，導致切割非特異識別位點，電泳彌散（smear）。盡可能降低甘油濃度，在中性pH和高鹽離子濃度下進行酶切反應。4.影響酶切的因素基因的體外重組第四十四頁，共八十頁，2022年，8月28日緩沖液與溫度：每種酶都有最適反應緩沖液，應在最佳工作溫度下和反應緩沖液中進行。酶量與反應時間：增加酶量，相應縮短時間。質(zhì)粒純度不很高，酶切反應通常在數(shù)倍過量酶的條件下進行?；虻捏w外重組4.影響酶切的因素第四十五頁，共八十頁，2022年，8月28日DNA連接酶催化的基本反應:DNA雙鏈上相鄰的3′羥基和5′磷酸基因共價結(jié)合形成3′—5′磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來。T4噬菌體的DNA連接酶:以ATP作為輔助因子，它在與酶形成復合物的同時釋放出焦磷酸基團。大腸桿菌DNA連接酶:以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作為輔助因子?；罨蟮拿笍秃衔锝Y(jié)合在DNA的缺口處，修復磷酸二酯鍵，并釋放AMP。T4-DNA連接酶比大腸桿菌連接酶具有更廣泛底物適應性。連接反應與連接酶基因的體外重組第四十六頁，共八十頁，2022年，8月28日基因的體外重組DNA連接酶的各種特性連接酶平端/℃突端/℃切口補平/℃T4DNA連接酶15-25437大腸桿菌DNA連接酶—10-1537熱穩(wěn)定性DNA連接酶—24-3765-72第四十七頁，共八十頁，2022年，8月28日DNA/RNA聚合酶：催化合成DNA/RNA分子的酶。體外進行聚合反應與體內(nèi)相似，一般需要模板，合成產(chǎn)物為模板的互補序列。根據(jù)聚合酶依賴的模板，可分為：依賴于DNA的DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I及其大片段、T4和T7DNA聚合酶及熱穩(wěn)定性DNA聚合酶；用于DNA復制和擴增依賴于DNA的RNA聚合酶：轉(zhuǎn)錄酶，基因的轉(zhuǎn)錄依賴于RNA的DNA聚合酶：反轉(zhuǎn)錄酶，病毒的復制不依賴于模板的聚合酶：把核苷酸加到DNA分子的末端，即末端轉(zhuǎn)移酶。四、DNA聚合反應與聚合酶基因的體外重組第四十八頁，共八十頁，2022年，8月28日各種聚合酶特性基因的體外重組酶溫度℃模板聚合活性外切活性大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ16-22ssDNA,ssRNA5→35→33→5Klenow片段16-22ssDNA,ssRNA5→33→5T4DNA聚合酶37ssDNA5→33→5末端轉(zhuǎn)移酶37dsDNA5→3無多核苷酸聚合酶37ssRNA5→3無T7RNA聚合酶37dsDNA5→3無SP6RNA聚合酶40dsDNA5→3無第四十九頁，共八十頁，2022年，8月28日5′→3′外切活性3′→5′外切活性5′→3′聚合活性5′→3′聚合活性3′→5′外切活性

5′→3′外切活性基因的體外重組聚合酶活性第五十頁，共八十頁，2022年，8月28日大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段Klenow酶用途：1）3’凹端補平，使之成為平末端；2）對DNA片段進行標記，合成探針；3）用于催化cDNA第二鏈的合成；4）用于雙脫氧末端終止法測定DNA的序列。T4-DNA聚合酶：修平非平頭的cDNA分子以及由某些限制性核酸內(nèi)切酶水解產(chǎn)生的3’突出末端。

基因的體外重組聚合酶的用途Klenow酶第五十一頁，共八十頁，2022年，8月28日末端轉(zhuǎn)移酶：轉(zhuǎn)移活性比其他聚合酶高，用于RT和PCR反應物、載體末端加同聚物和3末端標記反應。多核苷酸聚合酶：用于RNA3標記和加poly(A)。RNA聚合酶：可用于合成RNA探針、體外翻譯，可用T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)在大腸桿菌、酵母中表達外源基因?；虻捏w外重組聚合酶的用途末端轉(zhuǎn)移酶第五十二頁，共八十頁，2022年，8月28日堿性磷酸酶來源于大腸桿菌和牛小腸。細菌堿性磷酸單酯酶和牛小腸堿性磷酸單酯酶（CIAP）均能催化DNA、RNA核苷酸的5′端單酯水解，除去磷酸，需要輔基Zn2＋，但不能催化磷酸二酯和三酯的水解。在DNA重組實驗中，該酶用于載體DNA的5′末端除磷操作，以提高重組效率。外源DNA片段的5′端除磷磷酸基，則可有效防止外源DNA片段之間的連接，提高重組效率。在核酸5′末端標記前，用堿性磷酸酶除去磷酸，可得到較高的標記效率?；虻捏w外重組聚合酶的用途堿性磷酸酶第五十三頁，共八十頁，2022年，8月28日基因的體外重組聚合酶的用途其他酶核酸酶模板用途核糖核酸酶HDNA/RNAcDNA克隆、除去mRNApoly(A)末端。核糖核酸酶ARNA除去質(zhì)?；駾AN-RNA、RNA-RNA雜合體中未雜交的單鏈RNA，突變檢測S1核酸酶ssRNA,ssDNAS1作圖，dsDNA末端平化，除去DNA－DNA和RNA－DNA雜交體中的單鏈部分綠豆核酸酶ssRNA/ssDNA雜交作圖，雙鏈DNA末端平化外切酶IIIdsDNA測序，DNA缺失，DNA－蛋白質(zhì)相互作用分析脫氧核糖核酸酶IssDNAdsDNA體外轉(zhuǎn)錄后除去模板DNA，切口平移反應，DNA－蛋白質(zhì)相互作用分析，降解RNA中的DNA第五十四頁，共八十頁，2022年，8月28日PCR(Polymerasechainreaction,PCR)：聚合酶鏈式反應，是由DNA聚合酶催化下，對特定的DNA序列進行的復制反應。本質(zhì)：根據(jù)生物體的DNA復制原理在體外合成基因。發(fā)明者：Mullis，1983年，生物技術(shù)革命性象征。PCR及其衍生技術(shù)-目標基因組裝一、PCR技術(shù)目標基因組裝第五十五頁，共八十頁，2022年，8月28日(2)退火（55℃）(4)完成一個循環(huán)(3)延伸（72℃）

目標基因擴增(1)變性（94℃）1.PCR單反應原理與過程第五十六頁，共八十頁，2022年，8月28日產(chǎn)物計算：Yn＝Y(jié)0（1＋X）n其中Yn為n循環(huán)后的拷貝數(shù)，Y0為起始拷貝數(shù)，X為擴增效率，n為循環(huán)數(shù)。

2.PCR循環(huán)目標基因擴增第五十七頁，共八十頁，2022年，8月28日模板DNA：目標序列,100－10000bp,pg引物：兩條寡核苷酸。脫氧核苷酸：4種dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPDNA聚合酶:Taq聚合酶，耐高溫緩沖溶液：50mMKCl、10mMTris－HCl,1.5mMMgCl23.PCR擴增的反應體系組成目標基因組裝第五十八頁，共八十頁，2022年，8月28日長度：20～30bp，與模板配對長度18～25bp。GC含量:40～60％，4種堿基分布均勻。Tm值計算:15～20bp，Tm＝2（A＋T）＋4（C＋G）。

14～40bp：Tm＝81.5℃＋16.6(lg[K+])＋0.41([G+C]%)引物Tm之差不能大于5℃，產(chǎn)物Tm值與引物Tm值之差不能低于10℃。一般在50℃～65℃之間，溫度越高特異性越強。4.PCR操作指南——引物設計目標基因擴增第五十九頁，共八十頁，2022年，8月28日酶識別序列堿基對數(shù)0123ApaIGGGCC↓C－－±＋BamHIG↓GATCC－±＋＋ClaIA↓TCGAT－±＋＋EcoRIG↓AATTC－±＋＋EcoRVGAT↓TAC－＋＋＋HindIIIA↓AGCTT－－－＋NotIG↓CGGCCGC－－＋＋PstICTGCA↓G－－±＋SacIGAGCT↓C－±＋＋SalIG↓TCGAC＋＋＋＋SmaICCC↓GGG－±＋＋SpeIA↓CTAGT＋

XbaIT↓CTAGA－±＋＋XhoIC↓TCGAG－－±＋4.PCR操作指南——酶切位點設計目標基因擴增第六十頁，共八十頁，2022年，8月28日聚合酶外切活性溫度℃穩(wěn)定性錯誤率×10－6Taq

5→375～8097.5℃,9min20～100rTth5→375～8097.5℃,20min20Tbr5→375～8096℃,150min－Pwo3→560～65100℃,2hr－DeepVent3→570～80100℃,480min20～45Pfu3→572～7895℃,240min1.6Tli3→570～80100℃,100min20～45Tfl

07070℃,120min100Taqstoffel075～8097.5℃,21min504.PCR操作指南——DNA聚合酶的選擇目標基因擴增第六十一頁，共八十頁，2022年，8月28日Mg離子濃度：1.5~5.0mM。退火溫度：根據(jù)產(chǎn)物基因的Tm值和長度計算。退火時間：一般30秒至2分鐘，根據(jù)長度計算。延伸時間：一般1－3分鐘。循環(huán)次數(shù)：25－40次，根據(jù)模板含量。PCR反應應該包括正、負對照，無模板、無引物、無聚合酶等對照，以便檢測PCR的進行和結(jié)果分析。整個過程在PCR儀內(nèi)，編程后自動完成。4.PCR操作指南——循環(huán)參數(shù)設計目標基因擴增第六十二頁，共八十頁，2022年，8月28日常規(guī)操作：冷啟動，在冰上把反應物混合后，設計最佳程序，直接進行。熱啟動操作：先把引物和模板混合并加熱到高于非特異性結(jié)合溫度，加入聚合酶，啟動PCR。降序操作：PCR過程優(yōu)化的最佳選擇。前兩個擴增循環(huán)的復性溫度比富含GC引物與模板完全配對的熔鏈溫度高3℃。隨后的循環(huán)中，復性溫度逐漸降低1℃?？傆幸粋€溫度點是特異性擴增的溫度。用于兼并引物、模板DNA序列復雜和進行多重PCR。降低非特異性擴增。5.PCR操作方式目標基因擴增第六十三頁，共八十頁，2022年，8月28日反轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR,RT?PCR）:以mRNA為起始材料，通過反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成DNA片段。應用：克隆基因的末端序列、表達的功能區(qū)段檢測基因表達和診斷遺傳病和感染的病毒等二、反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)目標基因擴增第六十四頁，共八十頁，2022年，8月28日第一步:反轉(zhuǎn)錄反應第二步:PCR擴增反應1.RT－PCR原理與過程目標基因擴增第六十五頁，共八十頁，2022年，8月28日2.RT反應體系的組成目標基因擴增成分濃度用量mRNA1pg～100ng緩沖液10×2μl4種dNTPs混合液20mmol/L1μl引物5～20pmol/L1μlRNase抑制劑20U1μlMgCl250mmol/L1μl反轉(zhuǎn)錄酶100～200U1μlH2O13μl總體積20μl第六十六頁，共八十頁，2022年，8月28日3.反轉(zhuǎn)錄酶特性與選擇目標基因擴增酶溫度℃模板聚合活性RNaseH產(chǎn)物AMV41-45ssRNA,ssDNA5→3強短MMLV37ssRNA,ssDNA5→3弱或無長第六十七頁，共八十頁，2022年，8月28日（1）樣品變性。75℃變性RNA5分鐘，冰上冷卻。（2）反轉(zhuǎn)錄。加入其他成分，混合。在42℃或37℃下，合成cDNA第一鏈，一般1小時。（3）終止反應。95℃加熱5分鐘，使反轉(zhuǎn)錄酶失活。設置相關(guān)的正負對照，便于監(jiān)測反應過程和分析反應結(jié)果。反轉(zhuǎn)錄之后，對產(chǎn)物稀釋至一定倍數(shù)，然后作為模板，建立PCR反應體系，進行PCR擴增。4.RT反應操作目標基因擴增第六十八頁，共八十頁，2022年，8月28日溶菌酶和SDS處理:破裂細胞后，釋放出內(nèi)容物。堿變性:蛋白質(zhì)、細菌染色體和質(zhì)粒都發(fā)生變性。蛋白質(zhì)、細胞壁碎片和染色體DNA相互纏繞形成大型復合物，被SDS包裹。酸中和：加入乙酸鉀，使堿性溶液至中性，染色體分子巨大，無法復性，質(zhì)粒很快復性,進入上清液SDS包裹蛋白質(zhì)、染色體及細胞碎片被沉淀下來。離心:除去蛋白質(zhì)、染色體DNA及細胞碎片等沉淀，質(zhì)粒保留在上清，最后用乙醇或異丙醇沉淀。質(zhì)粒載體的分離與純化原理1.SDS堿裂解制備提取質(zhì)粒的原理基因的體外重組第六十九頁，共八十頁，2022年，8月28日去污劑：TritonX100煮沸加熱：使細胞壁裂解，同時使蛋白質(zhì)、核酸等變性沉淀。降低溫度：冰浴迅速降溫，質(zhì)粒得以復性，其他生物大分子不能有效復性.離心:除去雜質(zhì)，收集質(zhì)粒。加熱裂解制備提取質(zhì)粒的原理:基因的體外重組第七十頁，共八十頁，2022年，8月28日質(zhì)粒大?。捍笥?5kb，溫和的SDS堿法提取，操作過程也要盡量輕柔，避免質(zhì)粒被機械剪切而斷裂。小于10kb的質(zhì)粒可用劇烈的加熱裂解法提取。堿或加熱處理時間：對提取質(zhì)粒的質(zhì)量影響很大，時間延長會使質(zhì)粒不可逆變性，應注意避免。除去RNA：由于含有大量的RNA，要用RNaseA處理。RNaseA可在第一步加入，節(jié)省時間。溶菌酶：小量提取，不加溶菌酶。大量提取時添加7％溶菌酶，并給予一定時間處理。注意事項基因的體外重組第七十一頁，共八十頁，2022年，8月28日質(zhì)粒的電泳檢查：2～3帶：2～3種螺旋構(gòu)型質(zhì)粒的電泳速率不同最亮帶：負超螺旋質(zhì)粒中間帶：缺口開環(huán)質(zhì)粒滯后帶：兩條鏈都斷裂的