第四章紫外可見分光光度法

三、吸光系數(shù)

吸光系數(shù)k的物理意義為：液層厚度為1cm的單位濃度溶液的吸光度，它表示物質(zhì)對特定波長光的吸收能力。一個物質(zhì)在一定條件下的吸光系數(shù)為定值。通常有兩種表示方法：

摩爾吸光系數(shù)ε

百分吸光系數(shù)

吸光系數(shù)k

物理意義是指樣品濃度為1mol·L-1的溶液置于1cm樣品池中，在一定波長下測得的吸光度值。量綱為L·mol-1·cm-1

。ε104102中強吸收弱吸收強吸收（一）摩爾吸光系數(shù)ε（二）百分吸光系數(shù)

物理意義是指溶液濃度在1%（1g/100mL），液層厚度為1cm時，在一定波長下的吸光度值。量綱為100mL·g-1·cm-1。

百分吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)有如下關(guān)系：

例4-1用氯霉素（分子量為323.15）純品配制100mL含2.00mg的溶液，使用1.00cm的吸收池，在波長為278nm處測得其透射率為24.3%，試計算氯霉素在278nm波長處的摩爾吸光系數(shù)和比吸光系數(shù)。解：已知λ=278nmM=323.15g/mol

c=2.00×10-3%T=24.3%

S2S1S0hAhhh吸收光譜四、吸收光譜測量某物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度，以波長（）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸光度隨波長的變化可得一曲線，此曲線即為吸收光譜。它清楚地描述了溶液對不同波長的光的吸收情況。從吸收曲線可以得到什么？1.同一濃度的有色溶液對不同波長的光有不同的吸光度;2.對于同一有色溶液，相同的入射光波長，濃度愈大，吸光度也愈大；

3.對于同一物質(zhì)，不論濃度大小如何，最大吸收峰所對應(yīng)的波長(最大吸收波長λmax)不變.并且曲線的形狀也完全相同。4.吸收曲線可作為吸光光度法中波長選定的依據(jù)，測定時一般選擇λmax

的單色光作為入射光。鄰菲羅啉－亞鐵溶液的吸收曲線濃度大?。孩?gt;Ⅱ>ⅢⅠⅡⅢ討論：定性分析與定量分析的基礎(chǔ)定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)物質(zhì)對光的選擇吸收ABA在一定的實驗條件下，物質(zhì)對光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比。AC增大§2.2光度計及其基本部件1.分光光度計分光光度計9.2.1基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示2.2.2主要部件1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射180～375nm的連續(xù)光譜。2.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任意波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光;棱鏡或光柵3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池(比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測系統(tǒng)

將光強度轉(zhuǎn)換成電流來進行測量。光電檢測器。要求：對測定波長范圍內(nèi)的光有快速、靈敏的響應(yīng)，產(chǎn)生的光電流應(yīng)與照射于檢測器上的光強度成正比。(1)光電管(2)光電二極管陣列電容器再次充電的電量與每個二極管檢測到的光子數(shù)目成正比，而光子數(shù)又與光強成正比。通過測量整個波長范圍內(nèi)光強的變化就可得到吸收光譜。電容器充電電容器放電光照射再次充電測量周期§4.3分析條件的選擇分析條件的選擇測量波長狹縫寬度吸光度的范圍儀器條件的選擇顯色劑反應(yīng)的要求顯色條件的選擇溶劑參比溶液試劑參比溶液樣品參比溶液平行操作參比溶液參比溶液顯色條件選擇

一、儀器條件的選擇

（一）測量波長

通常選擇最強吸收峰的最大吸收波長λmax為入射波長。在該波長處，吸收度大，靈敏度較高。

如在該波長有干擾，可選次強吸收峰的最大吸收波長λmax

為吸收波長

（二）狹縫寬度

狹縫寬度靈敏度↓↑↓↑通常選在不減少吸光度時的最大狹縫寬度為適宜的狹縫寬！光線譜帶變窄；光線強度減弱光線譜帶變寬；光線強度增加變窄變寬

（三）吸光度的范圍當(dāng)吸光度A在0.3～0.7范圍內(nèi)時，實驗的測量誤差較小。通常實驗時，將吸光度的測量范圍控制在0.2～0.8內(nèi)。

如果待測組分本身沒有顏色或本身顏色很淺，那么就無法直接進行測定，需利用顯色反應(yīng)將待測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩镔|(zhì)，然后進行測定。這種將試樣中待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的化學(xué)反應(yīng)，叫顯色反應(yīng)。與待測組分形成有色化合物的試劑叫顯色劑。

二、顯色條件的選擇

例如：Fe2+本身顏色很弱。如加入顯色劑鄰二氮菲，則生成穩(wěn)定橙紅色絡(luò)合物，該絡(luò)合物吸光能力強，用于含量測定效果佳。

（一）顯色劑反應(yīng)的要求

1.顯色反應(yīng)靈敏度高顯色反應(yīng)產(chǎn)物的ε愈大，靈敏度愈高；

2.顯色劑選擇性高顯色劑應(yīng)盡量只與待測組分反應(yīng)，而不與溶液中其他共存組分反應(yīng)。3.顯色劑的對照性要高

顯色劑的顏色應(yīng)與顯色反應(yīng)產(chǎn)物的顏色有較大區(qū)分，使實驗結(jié)果更為準(zhǔn)確；4.顯色產(chǎn)物穩(wěn)定顯色反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)有一定的穩(wěn)定性。（二）顯色條件的選擇

1.顯色劑濃度及用量

最適宜顯色劑濃度及用量可通過實驗確定。

2.溶液pH

顯色劑一般本身為弱酸或弱堿，溶液的pH值可顯著影響顯色劑的解離程度和顯色反應(yīng)的完成程度?？赏ㄟ^實驗確定最合適pH。3.顯色反應(yīng)的時間和溫度

顯色反應(yīng)一般需要一定時間，顯色程度會隨著時間變化而變化?？勺黠@色反應(yīng)時間-吸光度曲線，最合適的時間為曲線中的平坦部分3.顯色反應(yīng)的時間和溫度

顯色溫度通常選在室溫下進行，有的顯色反應(yīng)發(fā)生較慢，可適當(dāng)升高溫度。靈芝多糖溶液加入顯色劑后的時間-吸光度曲線1.溶劑參比溶液當(dāng)樣品簡單，無顯色劑或顯色劑無吸收，直接用溶劑作參比溶液。2.試劑參比溶液對于顯色反應(yīng)，顯色劑如有吸收，可在溶劑中加入與樣品溶液相同含量的顯色劑的溶液作參比溶液。

三、參比溶液

3.樣品參比溶液對于樣品較為復(fù)雜的顯色反應(yīng)，可用不加顯色劑的樣品溶液為參比溶液。4.平行操作參比溶液

若顯色劑、樣品溶液中各組分均在設(shè)定波長下有吸收，則可采用顯色劑與除待測組分外的其他共存組分混合作為參比溶液?！?.4紫外-可見分光光度法的應(yīng)用定性分析定量分析應(yīng)用光譜對照特征數(shù)據(jù)比較吸光度比值的比較單一組分的測定多組分的測定

一、定性分析1.光譜對照同樣條件下測定待測物和標(biāo)準(zhǔn)物的吸收光譜，如果兩者吸收光譜一樣，可認為是同一物質(zhì)。如無標(biāo)準(zhǔn)物，也可比較標(biāo)準(zhǔn)譜圖集里的光譜。2.特征數(shù)據(jù)比較最大吸收波長λmax和吸光系數(shù)，是用于定性鑒別的主要光譜數(shù)據(jù)。3.吸光度比值的比較

有些物質(zhì)的光譜上有幾個吸收峰，可在不同的吸收峰（谷）處測得吸光度的比值作為鑒別的依據(jù)。

二、定量分析

定量分析的依據(jù)是1.單一組分的測定（1）吸光系數(shù)法查得吸光系數(shù)后根據(jù)吸光度求得樣品濃度

例4-5已知維生素B12在361nm處的百分吸光系數(shù)為207。精密稱取樣品30.0mg，加水溶解后稀釋至1000mL，在該波長處用1.00cm吸收池測定溶液的吸光度為0.618，計算樣品溶液中維生素B12的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。解：已知A=0.618,=207,l=1.00cm由A=klc樣品中維生素B12含量為

（2）標(biāo)準(zhǔn)比對法相同條件下，分別配制待測溶液X和標(biāo)準(zhǔn)溶液S，并分別測定吸光度。根據(jù)郎伯-比爾定律，可寫出例4-6為測定維生素B12原料藥含量，準(zhǔn)確稱取試樣25.0mg，用蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度后，搖勻。另稱取同樣重量的B12標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解后，稀釋至1000ml，搖勻。在361nm波長處，用1cm比色皿分別測得樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度分別為0.512和0.518。求試樣中B12的百分含量。解：已知Ax

=0.512As

=0.518兩溶液配制、稀釋方法一致（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線法用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測鐵的濃度為例：①配一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液，依次測定吸光度②作c-A圖，即標(biāo)準(zhǔn)曲線③將待測溶液吸光度AX代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀出濃度三磺基水楊酸合鐵配合物波長420nm2.多組分的測定當(dāng)溶液內(nèi)有兩個及以上組分并需測得各自含量時，就是多組分的測定。（a）吸收光譜互不重疊（b）吸收光譜部分重疊（c）吸收光譜相互重疊（1）吸收光譜互不重疊此種情況下可以按單組分測定的方法分別求得各個組分濃度（2）吸收光譜部分重疊例如右圖，可先在無干擾處λ2求得a的濃度，再求得b的濃