酶工程學(xué)第十十一周固定化

第一節(jié)概述第二節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素第三節(jié)固定化酶的制備第四節(jié)固定化細(xì)胞第五節(jié)固定化輔酶和原生質(zhì)體第六節(jié)酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用內(nèi)容提要第一頁(yè)，共九十一頁(yè)。生物催化劑細(xì)胞酶非生長(zhǎng)生長(zhǎng)可溶固定化懸浮固定化連續(xù)間歇吸附包埋交聯(lián)化學(xué)連續(xù)材料膜固定酶液凝膠吸附化學(xué)連接物固定化再循環(huán)系統(tǒng)凝膠吸附連續(xù)半連續(xù)分批間歇連續(xù)活塞模式攪拌連續(xù)反應(yīng)器間歇連續(xù)活塞模式攪拌連續(xù)反應(yīng)器圖6-1生物催化劑作用方式示意第二頁(yè)，共九十一頁(yè)。第一節(jié)概述游離酶的缺點(diǎn)：1.酶的穩(wěn)定性較差，在溫度、pH、和無(wú)機(jī)離子等外界因素的影響下，容易變性失活。2.酶一般都是在水溶液中與底物反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后酶難以回收。3.反應(yīng)結(jié)束后，酶成為產(chǎn)物的雜質(zhì)。第三頁(yè)，共九十一頁(yè)。固定化酶：固定化酶是指固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增強(qiáng)穩(wěn)定性，可反復(fù)或連續(xù)使用以及易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開(kāi)等顯著特點(diǎn)。直接固定菌體或菌體碎片的，稱為固定化菌體或固定化死細(xì)胞。第四頁(yè)，共九十一頁(yè)。水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第五頁(yè)，共九十一頁(yè)。固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)多次使用可以裝塔連續(xù)反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：純化簡(jiǎn)單提高產(chǎn)物質(zhì)量應(yīng)用范圍廣缺點(diǎn)：首次投入成本高大分子底物較困難第六頁(yè)，共九十一頁(yè)。第二節(jié)固定化酶的制備一、一般方法及特點(diǎn)二、酶的固定化方法第七頁(yè)，共九十一頁(yè)。一、選擇方法依據(jù)：（1）酶的性質(zhì)（2）載體的性質(zhì)（3）制備方法的選擇第八頁(yè)，共九十一頁(yè)。二、酶的固定化方法（一）吸附法（二）結(jié)合法（三）交聯(lián)法（四）包埋法第九頁(yè)，共九十一頁(yè)。（一）吸附法1.物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。

選擇載體的原則：（1）要有巨大的比表面積（2）要有活潑的表面（3）便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。第十頁(yè)，共九十一頁(yè)。常用載體：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：結(jié)合力不勞、容易脫落。吸附法常用的載體及優(yōu)、缺點(diǎn)操作簡(jiǎn)單、條件溫和、載體廉價(jià)易得、可反復(fù)使用。第十一頁(yè)，共九十一頁(yè)。（二）結(jié)合法離子鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法定義：選擇適宜載體，使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。第十二頁(yè)，共九十一頁(yè)。1.離子鍵結(jié)合法概念：通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。常用載體:DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強(qiáng)度、溫度++++++++++++----------------++++++++第十三頁(yè)，共九十一頁(yè)。2.共價(jià)鍵結(jié)合法概念：通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)：游離氨基，游離羧基，巰基，咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚基，二硫鍵常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無(wú)機(jī)載體第十四頁(yè)，共九十一頁(yè)。共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)然后活化該活潑基團(tuán)最后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵第十五頁(yè)，共九十一頁(yè)。載體活化的方法A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應(yīng)法D．硅烷化法E．溴化氰法第十六頁(yè)，共九十一頁(yè)。A．重氮法反應(yīng)式：第十七頁(yè)，共九十一頁(yè)。目前在我們國(guó)內(nèi)用的較多的載體：該方法需要載體具有芳香族氨基氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素瓊脂糖葡聚糖凝膠瓊脂……第十八頁(yè)，共九十一頁(yè)。反應(yīng)式及原理第十九頁(yè)，共九十一頁(yè)。B疊氮法例：用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶步驟如下：酯化肼解疊氮化偶聯(lián)第二十頁(yè)，共九十一頁(yè)。C．烷基化反應(yīng)法含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。第二十一頁(yè)，共九十一頁(yè)。D．硅烷化法載體特點(diǎn)：①機(jī)械強(qiáng)度好，表面積大。②耐有機(jī)溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長(zhǎng)等。常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。第二十二頁(yè)，共九十一頁(yè)。第二十三頁(yè)，共九十一頁(yè)。第二十四頁(yè)，共九十一頁(yè)。第二十五頁(yè)，共九十一頁(yè)。E．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。第二十六頁(yè)，共九十一頁(yè)。第二十七頁(yè)，共九十一頁(yè)。（三）交聯(lián)法定義：借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。第二十八頁(yè)，共九十一頁(yè)。1.交聯(lián)法常用試劑戊二醛己二胺順丁烯二酸酐雙偶氮苯4,4ˊ-雙(二甲氨基)偶氮苯第二十九頁(yè)，共九十一頁(yè)。2.交聯(lián)法的形式交聯(lián)法有2種形式：酶直接交聯(lián)法酶輔助蛋白交聯(lián)法第三十頁(yè)，共九十一頁(yè)。酶直接交聯(lián)法：在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。EEEEEE第三十一頁(yè)，共九十一頁(yè)。酶輔助蛋白交聯(lián)法：為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過(guò)程中因化學(xué)修飾而引起酶失活，可使用第二個(gè)"載體"蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來(lái)增加蛋白質(zhì)濃度，使酶與惰性蛋白質(zhì)共交聯(lián)。EEE第三十二頁(yè)，共九十一頁(yè)。（四）包埋法定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。瓊脂瓊脂糖海藻酸鈉角叉菜膠明膠聚丙烯酰胺……載體：第三十三頁(yè)，共九十一頁(yè)。1．網(wǎng)格型定義：將酶或含酶菌體包埋在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。第三十四頁(yè)，共九十一頁(yè)。2．微囊型包埋法定義：將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。第三十五頁(yè)，共九十一頁(yè)。微囊化法制備固定化酶有兩種方法界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。界面聚合法：是用化學(xué)手段制備微囊的方法。利用油水界面上發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚合體而將酶包裹起來(lái)。癸二酰氯，氯仿酶，水，乙二胺第三十六頁(yè)，共九十一頁(yè)。第三節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素一、影響固定化酶性質(zhì)的因素二、固定化后酶性質(zhì)的變化三、評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)第三十七頁(yè)，共九十一頁(yè)。一、影響固定化酶性質(zhì)的因素1．酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。2．載體的影響（1）分配效應(yīng)（2）空間障礙效應(yīng)（3）擴(kuò)散限制效應(yīng)3.固定化方法的影響第三十八頁(yè)，共九十一頁(yè)。二、固定化后酶性質(zhì)的變化1．固定化對(duì)酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降原因：酶結(jié)構(gòu)的變化空間位阻2．固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響（1）操作穩(wěn)定性提高（2）貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。（3）對(duì)熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。（4）對(duì)分解酶的穩(wěn)定性提高。（5）對(duì)變性劑的耐受力升高第三十九頁(yè)，共九十一頁(yè)。三、固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接。酶活力的釋放是緩慢的。抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。第四十頁(yè)，共九十一頁(yè)。四、pH的影響（一）pH對(duì)酶活性的影響：（1）改變酶的空間構(gòu)象（2）影響酶的催化基團(tuán)的解離（3）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。第四十一頁(yè)，共九十一頁(yè)。（二）pH對(duì)固定化酶的影響1.載體帶負(fù)電荷，pH向堿性方向移動(dòng)。2.載體帶正電荷，pH向酸性方向移動(dòng)。

微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。第四十二頁(yè)，共九十一頁(yè)。催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高。催化反應(yīng)的產(chǎn)物為堿性時(shí)，固定化酶的pH值比游離酶的pH值低。（三）產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)體系pH的影響第四十三頁(yè)，共九十一頁(yè)。（四）最適溫度變化作用于低分子底物的酶，特異性沒(méi)有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特異性往往會(huì)變化。一般與游離酶差不多，但有些會(huì)有較明顯的變化。（五）底物特異性變化第四十四頁(yè)，共九十一頁(yè)。（六）米氏常數(shù)Km的變化，Km值隨載體性質(zhì)變化（1）載體與底物帶相同電荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，Km’<Km。第四十五頁(yè)，共九十一頁(yè)。五、評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：1.酶活定義（IU)：在特定條件下，每一分鐘催化一個(gè)微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個(gè)酶活單位。2.酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位（一）游離酶第四十六頁(yè)，共九十一頁(yè)。1.固定化酶的比活：

每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍?jiǎn)挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：

連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間（t1/2），是衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。（二）固定化酶第四十七頁(yè)，共九十一頁(yè)。5.相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力

3.4.酶活力回收率也稱偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)。第四十八頁(yè)，共九十一頁(yè)。六、固定化酶的活力測(cè)定方法介紹1.振蕩測(cè)定法：2.酶柱測(cè)定法：3.連續(xù)測(cè)定法：利用連續(xù)分光光度法等測(cè)定方法可以對(duì)固定化酶反應(yīng)液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，從而測(cè)定固定化酶的酶活力。第四十九頁(yè)，共九十一頁(yè)。第四節(jié)微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞固定化細(xì)胞特性比較細(xì)胞種類植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞大小/um20-3001-1010-100倍增時(shí)間/h>120.3-6>15營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜光照要求大多數(shù)要光照不要求不要求對(duì)剪切力敏感大多數(shù)不敏感敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗體、酶第五十頁(yè)，共九十一頁(yè)。固定化細(xì)胞定義：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞.該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。第五十一頁(yè)，共九十一頁(yè)。固定化細(xì)胞的特點(diǎn)類型：微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞生理狀態(tài)：死細(xì)胞（完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器）活細(xì)胞（增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、完整細(xì)胞）形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。

使用周期：理論上講，固定化增殖細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部活性，只要載體不解體，不污染就可以長(zhǎng)期使用。第五十二頁(yè)，共九十一頁(yè)。細(xì)胞固定化方法吸附法包埋法第五十三頁(yè)，共九十一頁(yè)。吸附法定義：通過(guò)載體與細(xì)胞間的靜電引力，即細(xì)胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細(xì)胞固定在載體上的。pH3－5------------++++++++第五十四頁(yè)，共九十一頁(yè)。影響吸附法的主要因素

Z-電位：Z-電位能近似地代表表面電荷密度的大小細(xì)胞的性質(zhì)和細(xì)胞壁的組成：細(xì)胞壁的電荷性質(zhì)載體的性質(zhì)：特別是玻璃、陶瓷等無(wú)機(jī)材料第五十五頁(yè)，共九十一頁(yè)。包埋固定法

包理法是在細(xì)胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學(xué)鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內(nèi)的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點(diǎn)是能較好的保持細(xì)胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細(xì)胞那樣進(jìn)行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。第五十六頁(yè)，共九十一頁(yè)。包埋法常用載體：瓊脂海藻酸鈣角叉菜膠明膠聚丙烯酰胺第五十七頁(yè)，共九十一頁(yè)。舉例：海藻酸鈣包埋法基本原理是：稱取一定量的海藻酸鈉配成水溶液，經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細(xì)胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器或滴管將冷懸液滴入一定濃度的凝固浴中（常用CaCl2溶液），形成球狀固定化細(xì)胞。第五十八頁(yè)，共九十一頁(yè)。研究熱點(diǎn)——光交聯(lián)樹脂包埋法

例：相對(duì)分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃，然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得。第五十九頁(yè)，共九十一頁(yè)。第五節(jié)固定化原生質(zhì)體和輔酶一、原生質(zhì)體的制備二、固定化三、輔酶固定化第六十頁(yè)，共九十一頁(yè)。一、原生質(zhì)體的制備將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集——懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中——加入水解酶——分離——得到原生質(zhì)體第六十一頁(yè)，共九十一頁(yè)。二、原生質(zhì)體固定化的方法將原生質(zhì)替制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體。第六十二頁(yè)，共九十一頁(yè)。三、輔酶固定化原因有機(jī)輔因子中具有某些特殊的化學(xué)基團(tuán)，參與酶的催化反應(yīng)有機(jī)輔因子在使用過(guò)程中要流失，并且不能自行再生有機(jī)輔因子價(jià)格昂貴——工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機(jī)輔因子的保留和再生第六十三頁(yè)，共九十一頁(yè)。輔酶固定化的方法固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后固定在超濾器中。輔酶固定化必須解決輔酶在多個(gè)酶之間傳遞的障礙。

第六十四頁(yè)，共九十一頁(yè)。輔酶的固定化第六十五頁(yè)，共九十一頁(yè)。第六十六頁(yè)，共九十一頁(yè)。輔酶固定化的形式第六十七頁(yè)，共九十一頁(yè)。第六節(jié)酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用酶反應(yīng)器介紹反應(yīng)器選擇的依據(jù)反應(yīng)器和酶穩(wěn)定性固定化酶和細(xì)胞的應(yīng)用（工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、分析化學(xué)、酶電極、親和色譜、環(huán)境保護(hù)、能源開(kāi)發(fā)、基礎(chǔ)理論研究）第六十八頁(yè)，共九十一頁(yè)。一、酶反應(yīng)器1．分批攪拌反應(yīng)器。2．連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器。3．連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器4．填充床反應(yīng)器5．循環(huán)反應(yīng)器6．流化床反應(yīng)器定義：用于各種酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備。類型：第六十九頁(yè)，共九十一頁(yè)。1．分批攪拌反應(yīng)器反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不需要特殊裝置，適與小規(guī)模試驗(yàn)第七十頁(yè)，共九十一頁(yè)。2．連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器第七十一頁(yè)，共九十一頁(yè)。3．連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器酶循環(huán)第七十二頁(yè)，共九十一頁(yè)。4．填充床反應(yīng)器第七十三頁(yè)，共九十一頁(yè)。5．循環(huán)反應(yīng)器第七十四頁(yè)，共九十一頁(yè)。6．流化床反應(yīng)器與連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器類似，是讓適量的顆粒狀酶懸浮于反應(yīng)床中，不用攪拌器，而是底物向上流過(guò)固定酶床，因此流速要適當(dāng)控制。第七十五頁(yè)，共九十一頁(yè)。反應(yīng)器選擇酶的形式：底物的物理性質(zhì)：酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶的穩(wěn)定性操作要求、應(yīng)用和可塑性成本第七十六頁(yè)，共九十一頁(yè)。反應(yīng)器和酶的穩(wěn)定性反應(yīng)器中酶催化活性損失的原因：酶本身失效酶從載體上脫落載體肢解擴(kuò)散限制效應(yīng)第七十七頁(yè)，共九十一頁(yè)。二、固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用1.

固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用2．固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用3．固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用4．固定化酶和親和色譜5．固定化酶與環(huán)境保護(hù)6．新能源開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用7．固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用第七十八頁(yè)，共九十一頁(yè)。1．固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用葡萄糖異構(gòu)酶——世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶固定化酵母細(xì)胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類熱點(diǎn)：固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用第七十九頁(yè)，共九十一頁(yè)。2．固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用例1固定化青霉素?；福灰淖僷H值等條件，就可以生成不同的產(chǎn)物。第八十頁(yè)，共九十一頁(yè)。青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素

7-ACAasnucleus第八十一頁(yè)，共九十一頁(yè)。7-ACCAor7-ADCA