山羊和黃牛源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法編制說明

編制說明項目名稱： 山羊和黃牛源性成分同步檢測方法 實時熒光PCR法項目編號： 內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函〔2018〕307號編制單位： 錫林郭勒職業(yè)學(xué)院一、工作簡況本項目來源于2018年第3批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目（內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函〔2018〕307號）。起草單位為錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，協(xié)作單位為錫林郭勒食品檢驗檢測和風(fēng)險評估中心。主要起草人：郭梁、郭元晟、廖成松、雅梅、錢俊平、羅建興。二、制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義山羊奶深受消費者的喜愛，是農(nóng)畜產(chǎn)品市場中重要組成部分。市場中存在用低價牛奶冒充山羊奶的欺詐違法行為，亟需制定針對肉乳制品的山羊和黃牛源性成分同步檢測方法。目前，已經(jīng)存在一項山羊源性檢測方法標(biāo)準(zhǔn)：動物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實時熒光PCR檢測方法（SN/T2980-2011）。在采用上述檢測標(biāo)準(zhǔn)后發(fā)現(xiàn)：目前缺乏基于同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的山羊和黃牛源性成分同步檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)是基于多重實時熒光 PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的山羊和黃牛源性成分同步檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，具有快速、高通量以及去除假陰性等特征。三、主要起草過程本標(biāo)準(zhǔn)制定工作從2018年10月開始，組織成立了標(biāo)準(zhǔn)起草團隊。起草團隊首先進行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、專利以及論文的收集和整理工作，制定了基于多重實時熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的動物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的研發(fā)目標(biāo)，計劃形成山羊Caprahircus）、黃牛（Bostaurus）、綿羊（Ovisaries）、馬Equuscaballus）、水牛（Bubalusbubalis）、牦牛（Bosgrunniens）、豬（Susscrofa）、驢（Equusasinus）、雙峰駝（Camelusbactrianus）、梅花鹿（Cervusnippon）、雞（Gallusgallus）、鴨Anasplatyrhynchos）及鵝（Anseranser）等13個物種、針對肉（鮮肉、肉干及香腸）和乳（鮮乳、發(fā)酵乳、乳酪及乳粉）的常見動物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)體系。具體實驗過程如下：（一） 在NCBI中下載不同物種（山羊、黃牛、綿羊、馬、水牛、牦牛、豬、驢、雙峰駝、梅花鹿、雞、鴨及鵝等 13個物種）的線粒體序列。為了保證引物和探針的物種適用性，每個物種下載5-20個品種或品系的線粒體序列；利用生物信息學(xué)軟件（ClustalX或MAGE5）對所下載的線粒體序列進行比對。篩選物種間特異品種間保守的序列為目標(biāo)靶向區(qū)域（5-10個），針對目標(biāo)靶向區(qū)域設(shè)計5組引物和探針組合。上游引物的3’端距離探針的5’端為1-20bp，探針的5’端避免出現(xiàn)G，探針Tm要高于引物Tm值10℃左右；不同物種的探針用不同的熒光基團標(biāo)記FAM、HEX、ROX以及CY5）；如果探針Tm值和引物Tm值接近，探針3’端可以選擇MGB基團；（二）收集各種來源于不同動物的肉（鮮肉、肉干及香腸）和乳（鮮乳、發(fā)酵乳、乳酪及乳粉）。利用改良CTAB法提取樣品的DNA（A260nm/A280nm≈1，.8瓊脂糖凝膠電泳主帶無拖尾，Nanodrop和Qubit定量一致性較高）；（三） 特異性分析：利用實時熒光 PCR對5組引物和探針進行檢測，有典型擴增曲線且 Ct值≤35計為檢出。在陽性對照檢出、陰性對照未檢出、對 5組引物和探針進行特異性的分析評價。反應(yīng)體系（20μL）：TransStartProbeqPCRSuperMix10 （μL北京全式金生物技術(shù)有限公司），引物各1μL，探針各0.5μL，模板DNA1μL，補水至20μL。反應(yīng)條件：94℃、30s，1個循環(huán)；94℃、5s，60℃、31s，40個循環(huán)；（四） 絕對靈敏度分析：以來源于不同肉乳制品的高質(zhì)量 DNA為模板母液，用滅菌 ddH2O稀釋模板母液，共稀釋 10個梯度，稀釋后質(zhì)量濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00001ng/。μL以不同稀釋濃度的DNA為模板對5組引物和探針進行檢測，根據(jù)PCR反應(yīng)的Ct值分析此方法對于不同濃度模板DNA的檢測靈敏度。檢出限（LOD）統(tǒng)計分析參照Probitanalysis。比較5組引物和探針的絕對靈敏度，分析引物和探針的特異性和保守性與絕對靈敏度之間的相關(guān)性；（五） 摻假檢出限（相對靈敏度）分析：首先，制備模擬摻假混合樣品（0.1%、1%、10%、30%、70%、90%、99%、99.9%），以上述摻假組為模板對 5組引物和探針進行檢測，根據(jù) PCR反應(yīng)的Ct值分析此方法對于不同濃度摻假的摻假檢出限。檢出限（LOD）統(tǒng)計分析參照 Probitanalysis。比較5組引物和探針的摻假檢出限（相對靈敏度），分析引物和探針的特異性和保守性與摻假檢出限之間的相關(guān)性；（六） 定量分析：以模板質(zhì)量濃度和摻假濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和摻假定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析引物和探針的特異性和保守性與擴增效率和相關(guān)系數(shù)的相關(guān)性；利用已知濃度的盲樣驗證定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的適用性，通過擴增效率（90%-110%）、相關(guān)系數(shù)R2（≥0.99）以及回收率（90%-110%）評價5組引物和探針的定量分析能力，分析引物和探針的特異性和保守性與定量分析能力之間的關(guān)系；（七）相關(guān)數(shù)據(jù)已經(jīng)進行論文投稿以及專利申請。目前發(fā)表SCI論文2篇，在投稿SCI論文3篇，中文核心論文8篇，申請國家發(fā)明專利8項（授權(quán)1項）。最終通過上述實驗確定山羊和黃牛源性成分同步檢測的引物和探針以及絕對靈敏度（1pg）和相對靈敏度（0.1-1%）。此方法具有山羊和黃牛源性的特異性，來源于山羊和黃牛的肉乳樣品均出現(xiàn)相應(yīng)探針的典型擴