混合菌的分離

混合菌的分離實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握常用的分離純化微生物的方法。2.學(xué)習(xí)倒平板的方法，進(jìn)一步掌握無(wú)菌操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。在分子生物學(xué)的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過(guò)分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。本實(shí)驗(yàn)將采用不同的培養(yǎng)基，通過(guò)稀釋涂布平板法和平板劃線法，從混合菌液中分離微生物。涂布平板法：做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，制成無(wú)菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。平板劃線法：是指把雜菌樣品通過(guò)在平板表面劃線稀釋而獲得單菌落的方法。一般是將混雜在一起的不同種微生物或同種微生物群體中的不同細(xì)胞，通過(guò)在分區(qū)的平板表面上作多次劃線稀釋，形成較多的獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)而繁殖成相互獨(dú)立的多個(gè)單菌落。通常認(rèn)為這種單菌落就是某微生物的“純種”。具體的劃線形式有多種，這里介紹一種經(jīng)過(guò)我們長(zhǎng)期實(shí)踐并證明可獲得良好實(shí)驗(yàn)效果的方法：將一個(gè)平板分成A、B、C、D4個(gè)面積不同的小區(qū)進(jìn)行劃線，A區(qū)面積最小，作為待分離菌的菌源區(qū)，B和C區(qū)為經(jīng)初步劃線稀釋的過(guò)渡區(qū)，D區(qū)則是關(guān)鍵的單菌群收獲區(qū)，它的面積最大，出現(xiàn)單菌群的概率也最高。由此可知，這4個(gè)區(qū)的面積安排應(yīng)做到D>C>B>A。實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)材料:混合菌夜（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基試劑鏈霉素、工業(yè)酒精實(shí)驗(yàn)儀器:試管、涂布器、0.1-0.2ml無(wú)菌吸管、接種環(huán)，酒精燈、無(wú)菌培養(yǎng)皿、試管架、培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、記號(hào)筆、廢液缸1.配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基配方：*牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（1000ml）牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH7.0-7.2(后調(diào))*馬丁氏培養(yǎng)基（1000ml）蛋白胨0.5g，葡萄糖10.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.5g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH自然*高氏一號(hào)培養(yǎng)基（1000ml）可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH7.4-7.6注意：高氏一號(hào)培養(yǎng)基配制時(shí)要將可溶性淀粉用蒸餾水調(diào)成混懸液然后在加入到熱水中，配制成淀粉漿，然后在加入其它的藥品。（1）根據(jù)實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基用量計(jì)算培養(yǎng)中各藥品的用量，每實(shí)驗(yàn)臺(tái)（4個(gè)小組）共同配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基400ml、馬丁氏培養(yǎng)基400ml、高氏一號(hào)培養(yǎng)基400ml（2）需要準(zhǔn)備一下物品：錐形瓶500ml3支（盛裝培養(yǎng)基，每大組）試管3支（小組，裝有蒸餾水一支9ml，另兩支4.5ml，塞好棉塞包扎）移液管1ml3支（小組）培養(yǎng)皿9套（小組）吸耳球1支（小組）

2.加熱、包扎、滅菌a.將培養(yǎng)基根據(jù)要求調(diào)pH值，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基pH7.0－7.2；馬丁氏培養(yǎng)基pH自然，加瓊脂進(jìn)行加熱溶解，煮制澄清時(shí)停止加熱，每小組各分裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2支，塞好棉塞，備用。b.包扎將錐形瓶3支、培養(yǎng)皿9套、盛裝蒸餾水的試管3支、裝有培養(yǎng)基的試管2支、移液管3支、吸耳球1支分別按照要求使用報(bào)紙包扎好，備用。c.滅菌將準(zhǔn)備好的物品放入滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，121℃，25mind.倒平板將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻55℃左右時(shí)，進(jìn)行分裝。每種培養(yǎng)基分裝倒3個(gè)平板。在倒培養(yǎng)基之前將培養(yǎng)皿底部做好標(biāo)記，然后無(wú)菌操作倒培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的厚度約為培養(yǎng)皿整個(gè)高度的1/3。讓培養(yǎng)基充分凝固，備用。注：滅菌物品取出之后立即將裝有培養(yǎng)基的試管擺好斜面。斜靠在玻璃棒或書(shū)本等合適的支撐物上，形成斜面，斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的1/2，備用。

3.混合菌夜稀釋液的制備：取混合菌夜1ml，加入盛有9ml無(wú)菌水的試管中，稀釋濃度為10-1，從濃度為10-1試管中取0.5ml稀釋液加入盛有4.5ml無(wú)菌水的試管中，以此類推，分別制成稀釋度為10-2～10-3的稀釋液。4.涂布平板法：將上述每種培養(yǎng)基平板底面標(biāo)記稀釋度，然后用無(wú)菌吸管從最后三種稀釋度中即10-1、10-3試管中吸取0.1ml對(duì)號(hào)放入平板上，用玻棒涂布。5.平板劃線法a.作分區(qū)標(biāo)記在皿底將整個(gè)平板分成A、B、C、D四個(gè)面積不等的區(qū)域。各區(qū)之間的交角應(yīng)為120度左右（平板轉(zhuǎn)動(dòng)一定角度約60度），一遍充分利用整個(gè)平板的面積，而且采用這種分區(qū)法可使D區(qū)和A區(qū)劃出的線條相平行，并可避免此兩區(qū)線條相接觸。b.劃線操作（1）用接種環(huán)挑取10-1少量混合菌夜；（2）劃A區(qū)，劃3-4條平行線（線條的多少依據(jù)挑取的菌量多少而定）。劃完A區(qū)后應(yīng)立即燒掉環(huán)上的殘菌，以免因菌過(guò)多而影響后面各區(qū)的分離效果。在接種時(shí)，左手持皿底并將其覆蓋在皿蓋上方（不要放入皿蓋內(nèi)），以防止雜菌污染。（3）劃其他區(qū)：將燒去殘菌后的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基邊緣冷卻一下，并使B區(qū)轉(zhuǎn)到上方，接種環(huán)通過(guò)A區(qū)（菌源區(qū)）將菌帶到B區(qū)，隨即劃數(shù)條致密的平行線。再?gòu)腂區(qū)作C區(qū)的劃線。最后經(jīng)C區(qū)作D區(qū)的劃線，D區(qū)的線條應(yīng)與A區(qū)平行，但話D區(qū)時(shí)切勿重新接觸A、B區(qū)，以免該兩區(qū)中濃度的菌夜帶到D區(qū)，影響單菌落的形成。隨即將皿底放入皿蓋中。燒去接種環(huán)上的菌線。6.培養(yǎng)：馬丁氏倒置培養(yǎng)于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)1-2d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.平板劃線法中檢查每個(gè)平板分離的結(jié)果，繪制菌苔或菌落的分布圖。2.涂布平板法中用下圖描述菌落生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)物生長(zhǎng)情況（+或-）染菌情況（+或-）牛肉膏10-1牛肉膏10-3馬丁氏10-1馬丁氏10-3注意事項(xiàng)1.藥品稱量要符合稱量規(guī)則2.調(diào)pH值，應(yīng)小心操作，避免過(guò)頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度3.加熱過(guò)程中要不斷攪拌，控制火力，防止培養(yǎng)基因暴沸而溢出或瓊脂沉淀在瓶底燒