植物細(xì)胞培養(yǎng)

第5章植物細(xì)胞培養(yǎng)與次級代謝產(chǎn)物制備植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體條件下，將愈傷組織或其它易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)增殖，獲得大量細(xì)胞的一種技術(shù)。5.1植物細(xì)胞培養(yǎng)及特點2/4/20231細(xì)胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)的區(qū)別1979年國際組織培養(yǎng)協(xié)會專業(yè)術(shù)語委員會建議：組織培養(yǎng)：從機(jī)體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理條件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存或生長成組織。細(xì)胞培養(yǎng)：動植物細(xì)胞在體外條件下的存活或生長，此時細(xì)胞不再形成組織。2/4/20232植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點與微生物相比細(xì)胞大（30-100倍）成團(tuán)不耐剪切生長慢，周期長易污染（培養(yǎng)基適于微生物生長）光照影響較大，氧氣、二氧化碳含量影響較大。2/4/202335.2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)5.2.1培養(yǎng)基5.2.2植物單細(xì)胞分離與小規(guī)模培養(yǎng)2/4/202345.2.2.1單細(xì)胞分離方法（一）機(jī)械法具體做法：將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖床振蕩獲得分散的單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點：細(xì)胞不受酶傷害；有利于進(jìn)行細(xì)胞的生理和生化研究。2/4/20235（二）酶解法酶對細(xì)胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶法時，必須加入甘露醇等滲透壓保護(hù)劑；可通過加入硫酸葡聚糖鉀來提高游離細(xì)胞的產(chǎn)量。(纖維素酶，果膠酶)優(yōu)點可獲得較多的葉肉游離細(xì)胞（但對禾本科植物葉片效果不好）。5.2.2.1單細(xì)胞分離方法2/4/20236細(xì)胞懸浮過濾與培養(yǎng)基混合植板培養(yǎng)克隆愈傷組織（三）愈傷組織誘導(dǎo)法振蕩、或加酶解。5.2.2.1單細(xì)胞分離方法2/4/202375.2.2.1植物單細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)方法（一）看護(hù)培養(yǎng)（二）飼養(yǎng)層培養(yǎng)（三）液體淺層靜止培養(yǎng)（四）細(xì)胞同步化培養(yǎng)（五）細(xì)胞平板培養(yǎng)（六）微室培養(yǎng)2/4/20238（一）看護(hù)培養(yǎng)（nurseculture）Muir(1953)首創(chuàng)此法獲得煙草單細(xì)胞體系。優(yōu)點：簡便易行，效果好。缺點：不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞分裂、生長過程2/4/20239（二）飼養(yǎng)層培養(yǎng)Horsch等（1980）建立培養(yǎng)皿培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞層培養(yǎng)細(xì)胞看護(hù)濾紙轉(zhuǎn)移濾紙2/4/202310（三）液體淺層靜止培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)皿三角瓶靜止2/4/202311（四）細(xì)胞的同步化培養(yǎng)細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時通過細(xì)胞周期的某一特定時期。植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中容易團(tuán)聚并進(jìn)入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達(dá)到完全同步化是十分困難的。同一培養(yǎng)體系的植物細(xì)胞經(jīng)常不能處于同一細(xì)胞周期，這種差異使懸浮細(xì)胞分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等復(fù)雜化。通過一定的理化措施可以使同一體系中的細(xì)胞達(dá)到相對同步化。什么措施？2/4/202312細(xì)胞周期2/4/202313（1）體積選擇法依據(jù)：細(xì)胞體積大小方法常規(guī)分選方法是梯度離心精細(xì)的分選可采用流式細(xì)胞儀優(yōu)點操作簡單分選細(xì)胞維持了自然生長狀態(tài)，不會有其它處理帶來的副作用缺點分選精細(xì)度較差2/4/202314（2）低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細(xì)胞較好地同步化。梅興國等（2001）采用6℃低溫處理紅豆杉細(xì)胞也獲得較明顯同步化效果?？赡艿脑虿煌臏囟葘?xì)胞的有絲分裂有極明顯的影響，在一定范圍內(nèi)，溫度下降使細(xì)胞分裂速度減慢，細(xì)胞周期延長，從而相應(yīng)地延長了分裂期的時間，使分裂指數(shù)提高，細(xì)胞同步化率升高。2/4/202315（3）饑餓法饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞分裂受阻常常是使細(xì)胞不能合成DNA，即不能進(jìn)入S期，或細(xì)胞分裂不能進(jìn)行，即不能進(jìn)入M期。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細(xì)胞。氮饑餓時，通常獲得G1期的同步化細(xì)胞磷和碳饑餓時，獲得G1和G2期的同步化細(xì)胞。將饑餓細(xì)胞轉(zhuǎn)入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時，細(xì)胞分裂又可重新恢復(fù)。2/4/202316（4）抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期(G1)的同步化細(xì)胞。常用抑制劑主要有5-氟脫氧尿苷(FudR)和羥基尿(HU)。用羥基尿處理獲得同步化細(xì)胞的方法在小麥、玉米、西芹等植物細(xì)胞培養(yǎng)中已有成功應(yīng)用。利用破壞微管的藥物將細(xì)胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。2/4/202317（五）細(xì)胞平板培養(yǎng)(platingculture)指將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。Bergman(1960)首創(chuàng)單細(xì)胞的分離：一般采用酶分離法，小細(xì)胞團(tuán)不能超過6個細(xì)胞。單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5×103個/毫升植板：將1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為5mm左右。2/4/202318細(xì)胞平板培養(yǎng)（platingculture)平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞總和中所占的比例。每個平板形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)植板率＝每個平板接種的細(xì)胞總數(shù)2/4/202319細(xì)胞平板培養(yǎng)(platingculture)優(yōu)點：單細(xì)胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行定點觀察，是單細(xì)胞株篩選和突變體篩選的常用方法。由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。缺點：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。2/4/202320（六）微室培養(yǎng)

(microchamberculture)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。由Jones等在1960年設(shè)計的。優(yōu)點：可對培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，了解一個細(xì)胞的生長、分裂、分化等過程缺點：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。細(xì)胞起始密度：30～80個/室。2/4/2023212/4/2023225.2.3細(xì)胞系與細(xì)胞株細(xì)胞系（cellline）：是以一種細(xì)胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細(xì)胞群體。細(xì)胞株（cellstrain）：指從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或提高篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。2/4/2023235.2.3.1細(xì)胞株篩選（一）一般步驟（1）愈傷組織的誘導(dǎo)。適宜外植體、培養(yǎng)基、激素（2）單細(xì)胞分離。固體培養(yǎng)基生長較快（3）細(xì)胞無性系的分離。液體培養(yǎng)基生長較快（4）細(xì)胞株篩選。選擇目標(biāo)產(chǎn)物含量高的（5）性能評價?？梢灾性嚕?）細(xì)胞株獲得。2/4/202324（二）定向富集馴化（1）激素自養(yǎng)型細(xì)胞株的篩選馴化（2）耐高劑量有毒物質(zhì)的細(xì)胞株馴化（乙酸鹽苯甲酸鹽）梅興國（2001）通過在培養(yǎng)基中添加1.6mM的L-Phe，篩選出了抗Phe的紅豆杉細(xì)胞懸浮系，其紫杉醇含量高于原型細(xì)胞3～5倍。（3）直選法

李志勇等（2002）直接從起始細(xì)胞中挑選不同細(xì)胞團(tuán)建立了10個大蒜細(xì)胞懸浮系，比較研究顯示，不同懸浮細(xì)胞系的SOD合成能力最大差異可達(dá)5倍。2/4/202325（三）人工誘變篩選細(xì)胞系統(tǒng)：（1）懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)（2）愈傷組織系統(tǒng)（3）原生質(zhì)體系統(tǒng)誘變方法（1）物理方法射線（2）化學(xué)方法亞硝基胍2/4/2023265.2.3.2細(xì)胞株保存（一）繼代培養(yǎng)保存法時間？（二）低溫保存法5-10℃10天（三）冷凍保存 （1）低溫保存-20℃

（2）超低溫保存液氮2/4/2023275.2.4植物細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)◆根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模：小規(guī)模和大規(guī)模（批量）培養(yǎng)◆根據(jù)培養(yǎng)方式：懸浮、平板、看護(hù)培養(yǎng)、固定化 懸浮培養(yǎng)分為：分批培養(yǎng)流加式培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)（恒化培養(yǎng)）◆根據(jù)要求產(chǎn)物：用于誘變和生產(chǎn)次生(級)產(chǎn)物(Secondaryproducts)的細(xì)胞培養(yǎng)2/4/2023285.2.4植物細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)定義與優(yōu)點細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用用于建立懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)具備的特點懸浮系的建立過程成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系特征懸浮細(xì)胞的生長動態(tài)衡量懸浮細(xì)胞生長狀況的方法影響懸浮細(xì)胞生長的因素2/4/202329一、懸浮培養(yǎng)的定義與優(yōu)點（1）定義：懸浮培養(yǎng)(Suspensionculture)是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。（2）優(yōu)點

①

培養(yǎng)細(xì)胞可不斷增殖，且生長速度快。

②

液體狀態(tài)下便于細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細(xì)胞狀態(tài)可以相對保持一致。③可以借鑒發(fā)酵工程的成熟技術(shù)，容易放大實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。2/4/202330二、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用Suspensioncells懸浮細(xì)胞Plants植株Artificialseeds人工種子Protoplasts原生質(zhì)體Mutation突變體Secondaryproducts次級代謝產(chǎn)物2/4/202331①松散性好，疏松易碎。②其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。③呈細(xì)小顆粒狀。④增殖快、再生能力強(qiáng)。適宜懸浮培養(yǎng)適宜再生植株三、用于建立懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)具備的特點：2/4/202332四、懸浮系的建立過程愈傷callus150~250ml搖瓶flask離心分離centrifugeisolation繼代培養(yǎng)subculture1g/10mlmedium100~120rmpculturetransfer1time/3d80rpm2/4/2023332/4/202334五、成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系具備的特征①懸浮培養(yǎng)分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～50個細(xì)胞以下。②均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。③細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般7～10天便可增加一倍。④培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。2/4/2023352/4/202336六、懸浮細(xì)胞的生長動態(tài)2/4/202337七、衡量懸浮細(xì)胞生長狀況的方法根據(jù)不同培養(yǎng)時間的細(xì)胞數(shù)變化，或細(xì)胞質(zhì)量變化。鮮重：真空減壓過濾后稱重，反應(yīng)細(xì)胞生長情況干重：鮮細(xì)胞烘干至衡重，反應(yīng)細(xì)胞質(zhì)量生長速率(p)：不同時間細(xì)胞密度(x)的自然對數(shù)與起始密度(x0)的自然對數(shù)之差與培養(yǎng)時間(t)的比值

p＝(lnx-lnx0)/t2/4/202338八、影響懸浮細(xì)胞生長的因素起始愈傷組織的質(zhì)量接種細(xì)胞密度：懸浮細(xì)胞的起始密度一般在0.5~2.5×105個細(xì)胞/毫升。接種初期的細(xì)胞密度過低往往使延遲期加長。最低有效密度：即能使細(xì)胞分裂、增殖的最低接種量。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基、方式、溫度、繼代周期。2/4/202339八、影響懸浮細(xì)胞生長的因素4.培養(yǎng)基應(yīng)用條件培養(yǎng)基（生長過愈傷組織或懸浮細(xì)胞的液體培養(yǎng)基）提供單細(xì)胞生長和分裂所需的特殊代謝物。基本培養(yǎng)基成分的調(diào)節(jié)視不同的培養(yǎng)目的而定培養(yǎng)基設(shè)計時，一般均以誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行調(diào)整。常用的培養(yǎng)基有MS、B5、LS、N6等。植物激素和其他附加成分的應(yīng)用。2/4/202340八、影響懸浮細(xì)胞生長的因素5.培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動式、攪拌式）；分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)6.溫度25℃7.繼代周期指具有一定起始密度的細(xì)胞，從開始培養(yǎng)到細(xì)胞數(shù)目和總重量增長停止的一個過程。培養(yǎng)周期的長短是由起始細(xì)胞密度、延遲期的長短、生長速率等決定。繼代培養(yǎng)（Subculture）：繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁殖培養(yǎng)過程。2/4/202341植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器一、定義：生物反應(yīng)器是指用于高等生物細(xì)胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。二、用于懸浮培養(yǎng)的反應(yīng)器種類：

1.機(jī)械式

2.氣動式包括氣升式和鼓泡式三、氣動式反應(yīng)器的優(yōu)缺點

1.優(yōu)點剪切力小，對細(xì)胞傷害小，結(jié)構(gòu)簡單，功耗低，

2.缺點難適于細(xì)胞高密度培養(yǎng)2/4/202342四、適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)該具備的特征有適宜的氧傳遞特點。能保證良好的液體流動性。較低的剪切力。方便調(diào)節(jié)光照。2/4/202343五、機(jī)械攪拌式反應(yīng)器

（stirredtankbioreactor)（1）組成（2）優(yōu)點攪拌均勻供氧和混合效果好（3）缺點

剪切力大2/4/2023442/4/202345六、氣升式反應(yīng)器

(air-liftbioreactor)Flash（1）組成：2/4/202346七、鼓泡式反應(yīng)器

（Bubblingreactor）2/4/202347反應(yīng)器類型體積（L）培養(yǎng)植物種類攪拌式7，15D.carota

胡蘿卜攪拌式20，15500N.tabacum

煙草攪拌式5000C.roseus

長春花螺旋攪拌式20C.blumei

五彩蘇提升攪拌式2.5P.elliotii

濕地松鼓泡式20，30，130P.ginseng人參鼓泡式65，1500N.tabacum

煙草外環(huán)氣升式10，30，85C.roseus

長春花導(dǎo)筒氣升式20，210D.lanata

狹葉毛地黃轉(zhuǎn)鼓式1－4V.rosea

長春花植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器2/4/2023485.2.5植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)定義：細(xì)胞固定化（cellimmobilization）是指將游離的細(xì)胞包埋在支持物內(nèi)部或表面，培養(yǎng)液呈流動狀態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方式。優(yōu)勢：（1）細(xì)胞生長較為緩慢，利于次級代謝產(chǎn)物的積累。（2）利于保持培養(yǎng)液流體性質(zhì)（3）剪切力?。?）利于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化2/4/2023495.2.5植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)固定形式：包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽和聚丙烯酰胺等附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫和中空纖維等。Alfermann等(1983)用氣升式系統(tǒng)，采用海藻鈣固定細(xì)胞成功地用30L和200L的反應(yīng)器生產(chǎn)地高辛。Jose等(1983)進(jìn)一步用中空纖維反應(yīng)器培養(yǎng)胡蘿卜和碧東茄生產(chǎn)代謝產(chǎn)物酚類物質(zhì)Flash2/4/2023505.2.6植物細(xì)胞兩相培養(yǎng)（一）兩相培養(yǎng)(two—phaseculture)概念指在植物細(xì)胞培養(yǎng)基中加入有機(jī)溶劑或者有吸附作用的多聚化合物，形成的培養(yǎng)體系。培養(yǎng)體系由于分配系數(shù)不同而形成上、下兩相，細(xì)胞在水相中生長并合成次生代謝物，這些次生代謝物又通過主動或被動運(yùn)輸?shù)姆绞结尫诺桨?，并被另一相所吸附。能夠減少產(chǎn)物反饋抑制作用，提高產(chǎn)物產(chǎn)量。2/4/2023515.2.6植物細(xì)胞兩相培養(yǎng)（二）建立植物細(xì)胞兩相培養(yǎng)體系應(yīng)注意的事項：添加物對細(xì)胞無毒，不影響細(xì)胞生長與目的產(chǎn)物的合成。產(chǎn)物易溶于有機(jī)相或被多聚化合物吸附。兩相容易分離添加相不吸收培養(yǎng)基的有效成分。2/4/2023525.2.6植物細(xì)胞兩相培養(yǎng)（三）兩相類型：液-液系統(tǒng)和液-固系統(tǒng)液-液系統(tǒng)：分離相主要使用液體石蠟、烷類化合物。分離相和培養(yǎng)基的化學(xué)性質(zhì)和比重不同。液-固系統(tǒng)：是指提取相以固態(tài)形式存在于系統(tǒng)中，主要通過吸附分離目的產(chǎn)物，目前使用的主要有活性炭、硅酸鎂載體、沸石、蠶絲以及樹脂。2/4/202353

5.2.6植物細(xì)胞兩相培養(yǎng)（四）紅豆杉細(xì)胞兩相培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇實驗材料：東北紅豆杉細(xì)胞系培養(yǎng)基：第一相：B5培養(yǎng)基，第二相：5％(v/v)的松油醇，產(chǎn)物釋放劑：5％(v/v)二甲基亞砜。接種量:10g(鮮重)/100ml培養(yǎng)基/250mL三角燒瓶。培養(yǎng)條件：25℃，120rpm，黑暗培養(yǎng)。2/4/202354■細(xì)胞干重；▲紫杉醇產(chǎn)量；兩相系統(tǒng)——；單相系統(tǒng)－－ 第二相的加入，使得紫杉醇產(chǎn)量提高到30.19mg/L，比對照增加103%；63％的紫杉醇從胞內(nèi)的釋放出來，其中有75％轉(zhuǎn)移至有機(jī)相。2/4/2023555.3植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)合成有用的天然產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。目前有約25％的法定藥品來自植物，其有效成分均為次級代謝產(chǎn)物。許多植物次級代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可用于殺蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品2/4/202356部分代表性植物次級代謝產(chǎn)物及其植物資源工業(yè)用途次生產(chǎn)物植物資源藥用代謝產(chǎn)物可待因罌粟薯蕷皂苷配基三角葉薯蕷奎寧金雞納樹地高辛狹葉毛地黃莨菪胺曼陀羅長春花堿長春花殺蟲劑除蟲菊酯除蟲菊食品，飲料留蘭香薄荷化妝品茉莉油茉莉花2/4/2023575.3.1植物次級代謝產(chǎn)物的主要類型1.酚類化合物－黃酮類、醌類和簡單酚類黃酮類： 結(jié)構(gòu)：C6-C3-C6

生物合成前體：苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A。 功效：為治理心血管疾病和高血壓的藥物成分。醌類化合物： 結(jié)構(gòu)：由苯式多環(huán)芳烴衍生的芳香二氧化合物， 種類：苯醌、萘醌。 功效：呈現(xiàn)顏色，具有抗菌、抗癌作用。2/4/2023582.萜類化合物組成單元：異戊二烯合成途徑：異戊二烯途徑種類：單萜、倍半萜、二萜、三萜以及甾類化合物。萜類化合物已超過2萬種。單萜和倍半萜是植物揮發(fā)油和香料的主要成分，有的具有重要的藥用價值。倍半萜：抗瘧疾藥物青蒿素。二萜生物堿：抗癌藥物紫杉醇。三萜皂甙：人參皂甙。甾體皂甙：薯蕷皂甙。2/4/2023593.含氮化合物包括：生物堿、胺類、非蛋白質(zhì)氨基酸和生氰苷種類：5500種以上分布：雙子葉植物生物堿的作用：藥用，植物抗毒素。目前對生物合成途徑研究比較清楚的有：煙草的煙堿(nicotine)、毒藜堿(anabasine)和吡咯生物堿

(pyrrolizidinealkaloid)，毛茛科植物的小檗堿(berberine)，曼陀羅屬植物的莨菪堿(tropine)和東莨菪堿(scopolamine)。煙堿2/4/2023605.3.2植物次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑（一）聚酮途徑又稱乙酸丙二酸途徑，乙酰輔酶A通過直線式聚合生成脂肪酸和環(huán)狀次級代謝產(chǎn)物。植物聚酮類化合物主要包括酚類、芪類及類黃酮化合物等（二）莽草酸途徑PEP與4-磷酸赤蘚糖縮合，經(jīng)過莽草酸生成芳香族氨基酸，進(jìn)一步生成生物堿、類黃酮、香豆素等。（三）甲瓦龍酸途徑又稱甲戊二羥酸（甲羥戊酸）途徑，是乙酰輔酶A經(jīng)過甲戊二羥酸生成異戊二烯，再合成萜類、甾體、蒽醌等。2/4/2023615.3.3培養(yǎng)條件下植物細(xì)胞次生產(chǎn)物積累的特性生長偶聯(lián)型產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長成正比如長春花中長春花堿的合成、煙草細(xì)胞煙堿合成、薯蕷中薯蕷皂甙的合成。中間型產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長下降時合成，細(xì)胞處于指數(shù)生長期或停止生長產(chǎn)物都不合成蒽醌類物質(zhì)合成的植物細(xì)胞、莨菪烷類合成的植物細(xì)胞等屬于此類型。非生長偶聯(lián)型產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長停止以后。如紫草寧。2/4/2023625.3.4提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑1.選擇適宜的起始材料－－種類、部位（基因型）梔子（Gardeniajasminoides）胚軸銀杏 子葉當(dāng)歸 根紅豆杉幼嫩的莖茜草葉柄2.培養(yǎng)基既要滿足植物細(xì)胞的生物量增長，還要滿足細(xì)胞合成及積累次生產(chǎn)物的需要。2/4/2023635.3.4提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑3.前體（precursor）的應(yīng)用作用：提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。紫草-L-Phe-紫草素選擇對某一目的產(chǎn)物來講可能有多種前體物質(zhì)同一種前體物質(zhì)又可能有多條代謝路徑從而形成不同的代謝產(chǎn)物。針對其合成的關(guān)鍵生化過程進(jìn)行前體物質(zhì)添加。注意前體物質(zhì)的使用時間。紫蘇-色胺-week2注意前體濃度。過量也可能產(chǎn)生反饋抑制。2/4/202364人參皂甙的生物合成途徑乙酰輔酶A

甲羥戊酸（MVA）反式角鯊烯（C30）

2,3-氧化鯊烯環(huán)阿屯醇達(dá)瑪烯二醇香樹素植物甾醇人參皂甙Rg1人參皂甙Ro2/4/2023655.3.4提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑4.激發(fā)子（elicitor）的應(yīng)用也稱誘導(dǎo)子，是指能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞中某些反應(yīng)，并形成細(xì)胞特征性自身反應(yīng)的分子。非生物激發(fā)子，如輻射、金屬離子、茉莉酸類似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。生物激發(fā)子外源激發(fā)子：菌絲、微生物機(jī)體提取物及微生物產(chǎn)生的多糖、蛋白和脂肪酸等內(nèi)源性激發(fā)子：來源于植物結(jié)構(gòu)的化合物。如降解細(xì)胞壁的酶、細(xì)胞壁碎片、寡聚糖等有機(jī)分子。2/4/2023665.3.4提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑激發(fā)子促進(jìn)次生產(chǎn)物積累與其種類和濃度有關(guān)