果樹遺傳育種

姓名：王俊學號：2013308812分子標記技術(shù)的發(fā)展生化標記分子標記細胞學標記形態(tài)學標記遺傳標記RFLPRAPDAFLPSSRISSRSNP常見分子標記什么是遺傳標記（GeneticMarker）?

遺傳標記指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段、某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標記。

遺傳標記的類型主要有四大類：

1.形態(tài)標記(morphologicalmarker

)2.細胞學標記(

cytologicalmarker

)

3.生化標記

(

biochemicalmarker

)

4.分子標記

(

molecularmarker

)

主要包括肉眼可見的能明顯顯示遺傳多態(tài)性的外部形態(tài)特征，如：矮稈、紫鞘、卷葉等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病蟲性等有關(guān)的一些特性。

優(yōu)點:形態(tài)學標記簡單直觀、易于觀察。

缺點:(1)形態(tài)標記的數(shù)量在多數(shù)植物中是很有限的;(2)遺傳表達不穩(wěn)定，表現(xiàn)易受環(huán)境影響;(3)有一些標記與不良性狀連鎖;(4)形態(tài)標記的獲得需要通過誘變、分離純合的過程，周期較長。形態(tài)學標記形態(tài)標記（Morphologicalmarker）形態(tài)學上如何區(qū)分

能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的細胞學特征。染色體的結(jié)構(gòu)特征，形態(tài)特征及數(shù)量特征是常見的細胞學標記，它們反映里染色體結(jié)構(gòu)上，形態(tài)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。其中染色體的結(jié)構(gòu)特征包括染色體的核型和帶型。

優(yōu)點:

能進行一些重要基因的染色體或染色體區(qū)域定位。

缺點:(1)材料需要花費較大的人力和較長時間來培育，難度很大。

(2)有些變異難以用細胞學方法進行檢測。細胞學標記人類22對常染色體細胞分裂中期（Metaphase）染色體組karyotype(Chromosomephenotype)

analysis細胞學標記概念：主要包括貯藏蛋白、同工酶等標記，也指以基因表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物為主的一類遺傳標記系統(tǒng)。種類：可分為酶蛋白質(zhì)和非酶蛋白質(zhì)兩類。在非酶蛋白質(zhì)中用得最多的是種子貯藏蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白）。同工酶（isoenzyes)：催化功能相同，但結(jié)構(gòu)和生理性質(zhì)不同的一類酶。生化標記的優(yōu)點：數(shù)量更豐富，受環(huán)境影響更小。生化標記的缺點：蛋白質(zhì)受生物體發(fā)育的時空影響很大。生化標記（BiochemicalMarker）主要內(nèi)容：

一、分子標記的相關(guān)概念及分類

二、幾種常見分子標記的原理及方法

三、分子標記技術(shù)的應用

分子標記技術(shù)

分子標記來源于DNA水平的突變突變(Mutation)：是指DNA水平的可遺傳的變異，不管這種DNA變異能不能導致可檢測的表型或生化改變。突變產(chǎn)生的變異是自然選擇的基礎(chǔ)。可遺傳的突變在群體中擴散從而產(chǎn)生多態(tài)性。多態(tài)性(Polymorphism)：－群體內(nèi)同一DNA序列的兩種或多種變異形式，統(tǒng)計表明：群體內(nèi)任何兩個生物個體平均每1000～10000個堿基對有一對有差別，這種差別就是多態(tài)性。

1.廣義的分子標記(molecularmarker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。eg:蛋白質(zhì)標記如種子貯藏蛋白同工酶（指由一個以上基因位點編碼的酶的不同分子形式）

2.狹義的分子標記（DNAmarker)概念只是指DNA標記

能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。一.分子標記相關(guān)概念

分子標記的概念：是以直接檢測DNA核苷酸序列的差異為基礎(chǔ)的遺傳標記，又叫DNA分子標記。分子標記（DNAmarker）

分子標記的特點：

(相對形態(tài)，細胞，生化標記具有的優(yōu)點)

（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達與否等問題；

（2）數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；

（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；

（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達；

（5）許多標記表現(xiàn)為共顯性的特點，能區(qū)別純合體和雜合體。

在遺傳學研究中廣泛應用的DNA分子標記已經(jīng)發(fā)展了很多種，一般依其所用的分子生物學技術(shù)大致可以分為三大類：第一類：是以分子雜交為核心的分子標記，包括RFLP、DNA指紋技術(shù)等，這類分子標記被稱為第一代分子標記；第二類：是以PCR為核心的分子標記，包括隨機擴增多態(tài)性RAPD、簡單序列重復SSR、擴增片段長度多態(tài)性AFLP、序列標簽位點STS等，為第二代分子標記；第三類：是一些新型的分子標記，如：SNP標記、表達序列標簽EST標記等，也以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，為第三代分子標記。分子標記的分類英文縮寫英文名稱中文名稱RFLPRestrictionfragmentIength

polymorphism限制性片段長度多態(tài)性STSSequencetaggedsite序列標簽位點RAPDRandomamplifiedpolymor-phicDNA隨機擴增多態(tài)性DNAAFLPAmplifiedfrangmentlengthPolymorphism擴增片斷長度多態(tài)性SSRSimplesequencerepeat簡單序列重復SNPSimplemucleotide

polymor-phism單核苷酸多態(tài)性幾種主要的ＤＮＡ分子標記1.RFLP2.RAPD3.AFLP

4.SSR5.ISSR6.SNP二、幾種常見分子標記的原理及方法RFLP-限制性長度多態(tài)性利用限制性內(nèi)切酶切割不同個體基因組DNA后，含同源序列的酶切片段在長度性的差異RFLP不同個體DNA的提取酶切凝膠電泳分開DNA片段轉(zhuǎn)膜Southern雜交數(shù)據(jù)分析PCR擴增目的片段原理優(yōu)點：1可靠性高2來源自然變異3多樣性4共顯性5數(shù)量性缺點：1費時2具有種屬特異性3多態(tài)信息含量低RAPD隨機擴增多態(tài)性建立在ＰＣＲ技術(shù)上，使用一系列１０個堿基左右的單鏈隨機引物，對基因組的ＤＮＡ全部進行ＰＣＲ擴增，以檢測多態(tài)性。正?；驂A基發(fā)生改變后技術(shù)原理福建古荔枝樹RAPD部分引物分析

AFLP—擴增片段長度多態(tài)性標記

(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)

起源：1992年由荷蘭科學家Zabeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的新方法。

定義:由于單核甘酸突變或插入及缺失突變導致增加或減少限制性酶切位點，這種差異可通過選擇性的PCR擴增而檢測。AFLP是在RFLP的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，差別在于檢測手段。核心技術(shù)：AFLP的關(guān)鍵是設(shè)計選擇性擴增引物以及不同引物組合。

AFLP的原理

PrincipleofAFLP基本原理：對基因組DNA用兩種限制性內(nèi)切酶進行消化，連上相應的雙鏈人工接頭，根據(jù)接頭的核苷酸序列和酶切位點設(shè)計引物，并在3’端添加1-2個隨機堿基對酶切連接后的DNA進行選擇性擴增。此后再進行第二次PCR擴增，所用的引物是在第一次PCR中使用的選擇性引物的3’端又附加了1-3個隨機堿基。擴增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠檢測，銀染顯色。多態(tài)性源自限制性酶切位點的變異。AFLP的實驗操作

ProceduresforAFLPAFLP技術(shù)主要包括模板DNA制備、引物設(shè)計、酶切片段擴增及凝膠電泳分析4個步驟。各步驟具體的過程有：

1.DNA模板酶切和接頭連接（EcoRI/MseI）

2.在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴增。

3.PCR產(chǎn)物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。

4.多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析?；静襟EAFLPDNA提取兩種限制性內(nèi)切酶酶切DNA寡聚核苷酸接頭的連接對限制性酶切片段的選擇性擴增擴增產(chǎn)物的電泳分析AFLP技術(shù)路線1.基因組DNA被酶切成小片段：通常用一個四個堿基識別位點的限制性內(nèi)切酶如MseI和一個六個堿基識別位點的酶如EcoRI，其中MseI確保產(chǎn)生合適大小的DNA片段，這些片段能在序列膠上進行有效的分離；而六堿基識別位點酶EcoRI能夠限制擴增片段數(shù)目，確保DNA多態(tài)性的正常檢測；2.接頭與酶切片段的連接：接頭序列包括：一個核心序列和酶切位點特異序列，MSE接頭和ECORI接頭，核心序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列；3.預擴增：應用一對引物對酶切片段進行第一輪擴增，目的是富聚目標片段，減少本底，擴增引物序列為接頭序列加一個選擇核甘酸。只有一端為EcoRI切點，一端為MseI切點的DNA酶切片段，同時也與選擇核甘酸配對的DNA序列才能被擴增。1～3步的產(chǎn)物可以通過Agarose膠檢測。4.選擇擴增：應用含有接頭序列和三個選擇核甘酸序列的引物進行選擇擴增。通過這一輪擴增，進一步降低擴增片段數(shù)量，同時一個引物被同位素或熒光染料標記（也可用銀染），電泳后壓片檢測。

AFLP的原理

PrincipleofAFLPDNA提取兩種限制性內(nèi)切酶酶切DNA寡聚核苷酸接頭的連接對限制性酶切片段的選擇性擴增擴增產(chǎn)物的電泳分析

AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD兩種技術(shù)的優(yōu)點1、具有分辨率高2、穩(wěn)定性好3、效率高的優(yōu)點AFLP特點1、試驗成本高2、對DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高缺點：優(yōu)點：兩對引物對39個荔枝品種進行AFLP品分析SimpleSequenceRepeat基本原理：微衛(wèi)星DNA是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡單重復序列，每個重復單元的長度在1—10bp之間，常見的微衛(wèi)星如TGTG……TG=(TG)n或AATAAT……AAT=(AAT)n等，不同數(shù)目的核心序列呈串聯(lián)重復排列，而呈現(xiàn)出長度多態(tài)性。在基因組中，因每個SSR序列的基本單元重復次數(shù)在不同基因型間差異很大，從而形成其座位的多態(tài)性。而且每個SSR座位兩側(cè)一般是相對保守的單拷貝序列，據(jù)此可設(shè)計引物，其關(guān)鍵是首先要了解SSR座位的側(cè)翼序列(FlankingRegion)，尋找其中的特異保守區(qū)。

SSR分子基礎(chǔ)SSR基本步驟SSRDNA酶切收集酶切片段連接載體合成末端標記的SSR探針篩選含SSR的陽性克隆用于測序根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物進行PCR擴增SSR優(yōu)點:

數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子實驗重復性好，結(jié)果可靠所需DNA量少，對DNA質(zhì)量要求不高缺點：由于創(chuàng)建新的標記時需知道重復序列兩端的序列信息，對于許多物種需構(gòu)建文庫，因此其開發(fā)有一定困難，費用也較高。SSRInterSimpleSequenceRepeatbyZietkiewiczetal.(1994)基本原理：在SSR的5’或3’端加錨l～4個嘌呤或嘧啶堿基，然后以此為引物，對兩側(cè)具有反向排列SSR的一段基因組DNA序列進行擴增。在SSR的3’端或5’端錨定1-4個簡并堿基的優(yōu)點是在基因組上只有那些與錨定的核苷酸匹配的位點才能被靶定，因而避免了SSR在基因組上的滑動大大提高了PCR擴增的專一性。ISSR分子基礎(chǔ)ISSR銀杏5個群體66個個體進行擴增的13種有效ISSR引物的特點

ISSR圖引物UBC845擴增ＴＭ群體15棵植株基因組DNA的ISSR電泳圖

ISSRSNPSNP主要是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。也即SNP是同一物種不同個體間染色體