細(xì)胞培養(yǎng)基本知識

細(xì)胞培養(yǎng)孫國杰1.1前言（一）細(xì)胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點（1）研究對象是活的細(xì)胞。（2）研究的條件可以人為地控制。（3）研究的樣本，具有均一性。（4）研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。（5）研究的范圍比較廣。（6）研究的費用相對經(jīng)濟。（二）研究的方面（1）細(xì)胞內(nèi)的活動：（2）細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞外界之間的作用：（3）細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用：（4）細(xì)胞內(nèi)的流動：（5）遺傳學(xué)：（三）應(yīng)用領(lǐng)域（1）病毒學(xué)（2）免疫學(xué)（3）遺傳學(xué)（4）腫瘤學(xué)（5）分化與發(fā)育（6）細(xì)胞毒試驗（7）臨床醫(yī)學(xué)及生物技術(shù)方面的應(yīng)用

1.2培養(yǎng)細(xì)胞的特征培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型（一）貼附生長型細(xì)胞

（1）成纖維細(xì)胞型細(xì)胞：（2）上皮型細(xì)胞:

（3）游走型細(xì)胞（4）多形型細(xì)胞（二）懸浮生長型細(xì)胞

懸浮生長細(xì)胞：血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等。這類細(xì)胞特點：胞體始終是球形、密度較高，培養(yǎng)效率高、易大規(guī)模生產(chǎn)。1.2.2細(xì)胞增殖的特點貼附

(1)一般認(rèn)為與電荷有關(guān)。

(2)促吸附因子：層連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴展因子可能參與細(xì)胞貼附過程。

(3)A細(xì)胞-細(xì)胞黏附分子，主要與相應(yīng)的細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)；B細(xì)胞與底物由整合素所介導(dǎo)；C跨膜蛋白多糖，與基質(zhì)成分如其他蛋白多糖或膠原相互作用運動的接觸抑制及增殖的密度抑制（1）當(dāng)兩個細(xì)胞移動而互相靠近時，其中一個或兩個將停止移動并向另一方向離開，這保證兩個細(xì)胞將不會重疊。（2）細(xì)胞生長的密度抑制。培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程

細(xì)胞周期間期

1、前期：形成染色體

2、中期:得到完整的染色體群3、后期:4、末期

細(xì)胞系的生長過程原代期傳代期衰退期1.原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期：

也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時，細(xì)胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低，即細(xì)胞獨立生存性差?？寺⌒纬陕始醇?xì)胞群被稀釋分散成單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時，形成細(xì)胞小群（克隆）的百分?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。組織塊培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)2．傳代期

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（DiploidCellLine）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。初代培養(yǎng)細(xì)胞系（連續(xù)細(xì)胞系）老化傳代期02468101214周16141210863．衰退期：

此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系（InfiniteCellLine），也稱連續(xù)細(xì)胞系（ContinuousCellLine）。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。二培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法

A培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法

所謂培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法，就是將培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，再放人培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

早期的培養(yǎng)瓶是玻璃培養(yǎng)瓶，目前主要用一次性的塑料培養(yǎng)瓶。與一般瓶子不同，采用的材料都是透明、對生物細(xì)胞無毒的材料。采用的玻璃大多是硼硅酸玻璃。形狀主要采用適合細(xì)胞貼壁生長和顯微鏡觀察的扁平形狀。

與此相關(guān)的一種方法是蓋玻片+培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，就是以蓋玻片為生長表面，將擬培養(yǎng)的組織、細(xì)胞接種于蓋玻片上，然后放進(jìn)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。這樣具有以下幾優(yōu)點：。

(1)可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響。

(2)可以方便地進(jìn)行顯微鏡觀察、染色等操作，以及永久保存。（3）增加了培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積。B培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法曾被稱為微量培養(yǎng)法，是現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)最為常用的方法之一。具體做法是將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。最常用的培養(yǎng)板有6孔、24孔和96孔培養(yǎng)板，后者最為常用。一般都是一次性使用。原代培養(yǎng)包括：取材、分散細(xì)胞、接種、培養(yǎng)等．在所有操作中，多都要注意保持培養(yǎng)物及生長環(huán)境的無菌條件。組織塊也可用兩只手術(shù)刀片將組織塊切碎，這樣對細(xì)胞損傷較小，但操作時間長，容易污染。對某些軟組織如腫瘤、胚眙、腦等可將碎組織塊放人注射器玻璃管中擠壓分離。根據(jù)細(xì)胞生長的特點，傳代方法有3種：1．懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。傳代培養(yǎng)2．半懸浮生長細(xì)胞傳代此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。3．貼壁生長細(xì)胞傳代貼壁細(xì)胞細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，對細(xì)胞進(jìn)行傳代擴增。1.首先將超凈工作臺用紫外

光燈照射滅菌20-30分鐘；

貼壁細(xì)胞傳代-消化過程2.關(guān)閉超凈工作臺內(nèi)的紫外光燈,點燃酒精燈(一切操作均需在酒精燈火焰下進(jìn)行)

3.將消毒過的所用物品放入超

凈工作臺中；

4.將培養(yǎng)好的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)

皿放入超凈工作臺中；5.用無菌吸管將細(xì)胞上原有的

培養(yǎng)液吸凈，棄去培養(yǎng)液。

6.分別取1毫升0.25%胰酶消化液放入培養(yǎng)皿中7.將加有胰酶消化液的培養(yǎng)皿

放入37℃溫箱中消化1分鐘

8.從溫箱中取出培養(yǎng)皿后

用手輕輕拍打培養(yǎng)皿的邊緣；

9.用倒置式顯微鏡觀察細(xì)胞

是否完全脫落細(xì)胞完全皺縮變圓，此時應(yīng)棄去胰酶，加入培養(yǎng)基后輕搖可將細(xì)胞從細(xì)胞瓶壁上洗下，將細(xì)胞懸液用吸管吹散后傳代：

有經(jīng)驗后，可肉眼對光觀察貼壁半透明的細(xì)胞層，判斷消化程度。10.待細(xì)胞完全脫離后，加入適量的含血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)如消化過頭，會見到許多細(xì)胞脫落隨棄去的胰酶溶液流失。也可以在倒數(shù)第二、三步時棄去胰酶，用瓶中殘留的胰酶繼續(xù)作用至最后一步的消化程度，這樣略有點過也影響不大。剛加入胰酶，細(xì)胞仍呈致密單層：

細(xì)胞開始皺縮但不明顯，仍維持細(xì)胞正常形態(tài)：

細(xì)胞基本皺縮變圓，此時細(xì)胞吹打可下：

檢查細(xì)胞形態(tài)及活力：狀態(tài)良好的細(xì)胞應(yīng)是輪廓不十分清晰，而生長不良的細(xì)胞輪廓反而清晰，細(xì)胞間隙增大，有空泡、脂滴、顆粒出現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。檢查營養(yǎng)液PH及污染：新鮮的呈桃紅色，PH在7.2-7.4之間。培養(yǎng)一段時間后，PH下降，培養(yǎng)液變黃。ＣＯ２培養(yǎng)箱可自動控制5%ＣＯ２的含量。細(xì)胞計數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計數(shù)相同。血細(xì)胞計數(shù)器：手工計數(shù)細(xì)胞Coulter計數(shù)儀：人工計數(shù)程序

用酒精沖洗計數(shù)板后擦凈，將蓋片覆在計算板上，微微移向一側(cè)，以便滴加細(xì)胞懸液.取一吸管伸入培養(yǎng)瓶，輕輕吹打細(xì)胞懸液，混勻。從蓋片邊緣滴加細(xì)胞懸液，使其充滿計數(shù)板和蓋片間的空隙中。注意：勿使液體漫過蓋片或出現(xiàn)氣泡。鏡下觀察計數(shù)：計算計數(shù)板四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線者只計算左側(cè)和上方的,右側(cè)和下方的不計算在內(nèi)。

按下式計算：細(xì)胞數(shù)/毫升原液=

注意：鏡下計數(shù)，有時偶爾有兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團，應(yīng)按單個細(xì)胞計算。如細(xì)胞團占10%以上,說明消化不充分；細(xì)胞數(shù)少于200個/10平方毫米或多于500個/10平方毫米

時，均說明稀釋不當(dāng)，需重新置備細(xì)胞懸液,再計算。細(xì)胞計數(shù)：

細(xì)胞懸液制備后，要計算所含的細(xì)胞數(shù)量。一般以細(xì)胞數(shù)/毫升表示。用品：細(xì)胞懸液,培養(yǎng)液,計數(shù)板。

1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

計數(shù)法:

尋根問底胰蛋白酶真的不會把細(xì)胞消化掉嗎？為什么？提示：胰蛋白酶除了可以消化細(xì)胞間的蛋白外，長時間的作用也會消化細(xì)胞膜蛋白，對細(xì)胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時間。貼壁生長細(xì)胞傳代小結(jié)加消化液得到分散的單細(xì)胞

倒掉消化液

加培養(yǎng)液終止消化吹打成細(xì)胞懸液接種2-4個培養(yǎng)瓶生長貼壁培養(yǎng)的材料與系統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的表面要求具有凈陽電荷和高度的表面活性。如果是有機物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。主要材料有：玻璃、塑料、金屬、微載體。貼壁培養(yǎng)的系統(tǒng)主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)的核心是采用可以搖動或轉(zhuǎn)動的圓筒培養(yǎng)容器，能使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣。但是，該系統(tǒng)具有表面積有限、培養(yǎng)條件檢測受到限制、勞動強度大、占用空間大等不足。凡·維茨爾開發(fā)的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)一定程度上克服了這些缺陷。微載體培養(yǎng)動物細(xì)胞是一種適合大規(guī)模生產(chǎn)動物細(xì)胞生物制品的一種非常有價值的培養(yǎng)技術(shù)貼壁生長的細(xì)胞生長特性原本為圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就可鋪滿生長表面，形成致密的細(xì)胞單層。這種方法易于觀察細(xì)胞生長狀況，適宜于實驗室研究。但是如需繼續(xù)培養(yǎng)，需將單層細(xì)胞再分散，稀釋后再重新接種，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。貼壁生長的細(xì)胞一般生長過程是：

(1)游離期：接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)，由于細(xì)胞質(zhì)的回縮，各種形狀的細(xì)胞都開始變圓。

(2)吸附期：細(xì)胞類型不同，貼壁時間有所差異。單個細(xì)胞、傳代細(xì)胞較快，組織塊、較大細(xì)胞團較慢。一般多數(shù)細(xì)胞都可在24h內(nèi)貼壁，平均貼壁時間大約5-20min。而細(xì)胞狀態(tài)不好及瀕死細(xì)胞、培養(yǎng)基偏酸或偏堿、培養(yǎng)瓶不潔等不利條件都不利于細(xì)胞貼壁。

(3)繁殖期：圓形懸浮細(xì)胞貼壁后延展成極性細(xì)胞，此時雖有細(xì)胞運動，卻無細(xì)胞分裂。經(jīng)過一段停滯，開始分裂。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，細(xì)胞間開始接觸并連接成片，這時細(xì)胞的運動及分裂都會停止。這種由于細(xì)胞間的接觸而發(fā)生抑制的現(xiàn)象稱之為接觸性抑制。

(4)退化期：細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶壁達(dá)到一定密度后，隨著營養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，細(xì)胞開始退化。細(xì)胞輪廓變強，細(xì)胞內(nèi)有膨脹的線粒體顆粒堆積。如不及時傳代，細(xì)胞會從瓶壁上脫下來。貼壁培養(yǎng)優(yōu)點(1)貼壁培養(yǎng)比較容易更換培養(yǎng)基。(2)容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的。(3)更有效地表達(dá)同一產(chǎn)品。(4)可以方便地調(diào)節(jié)培養(yǎng)液和細(xì)胞比例。(5)易于觀察細(xì)胞生長狀況。【思考題】多細(xì)胞動物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識，思考并討