丁二胺與戊二胺的介紹

關于兩種二元胺微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的介紹李小剛目錄1,5—戊二胺談第二章1,4—丁二胺談第三章胺談第一章第一章胺什么是胺？氨分子中的氫原子被烴基取代后的產(chǎn)物。R=烷基：脂肪胺芳基：芳香胺伯胺(一級胺)仲胺(二級胺)叔胺(三級胺)季胺(四級胺)4第二章戊二胺2.11,5—戊二胺的性質(zhì)1,5—戊二胺又稱為尸胺，是一種多胺,又名1,5一二氨基戊烷,是一種粘稠狀液體,沸點178一180度,折光率為1.463，易溶于水、乙醇、難溶于乙醚,深度冷凍可凝固結晶,但在常溫下又熔為液體，有六氫吡啶的臭味,在空氣中發(fā)煙,能形成二水化合物。它是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿,它在腐爛的尸體中可以分離得到。52.21,5—戊二胺的應用在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學、工業(yè)等領域有著廣泛的應用1在農(nóng)業(yè)上，1，5－戊二胺作為第三信使可用于調(diào)節(jié)植物衰老過程、促進雌雄蕊的發(fā)育2在醫(yī)學上，可作為一種有效治療痢疾的藥物，也是微生物細胞內(nèi)調(diào)節(jié)鐵離子濃度的“鐵親和系統(tǒng)”的主要組成成分；3在工業(yè)上，作為一種重要的工業(yè)化工原料，是由可再生原料衍生得到的生物聚酰胺，廣泛應用于各種聚酰胺產(chǎn)品；可以替代傳統(tǒng)的由化工方法生產(chǎn)的生物胺———己二胺，與二元酸進行聚合反應可合成優(yōu)質(zhì)高分子材料———新型尼龍5662.31,5—戊二胺的生產(chǎn)微生物轉化法

談微生物直接發(fā)酵法直接提取法談7尸胺是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿,它在腐爛的尸體中可以分離得到，但是由于含量較低,不適合大量生產(chǎn)直接提取法8產(chǎn)量72g/L2009年德國學者學者Martin·費爾科特,B·恩斯特等人以C.glutamicum為出發(fā)菌株，經(jīng)發(fā)酵、pH調(diào)控、熱處理、萃取、蒸餾純化等過程，經(jīng)80h發(fā)酵后，最終獲得戊二胺產(chǎn)量可達72g/L。2005年日本東麗尖端融合研究所通過對賴氨酸工業(yè)生產(chǎn)上所用的谷氨酸棒桿菌進行轉基因操作,把來源于大腸桿菌的賴氨酸脫梭酶基因的表達單元插入高絲氨酸脫氫酶基因座，發(fā)酵15小時生產(chǎn)出2.5g/L產(chǎn)量2.5g/L2010年天津科技大學牛濤等通過PCR擴增獲得蜂房哈夫尼菌

中的賴氨酸脫羧酶基因ldc，以大腸/谷氨酸棒桿菌

穿梭質(zhì)粒pXMJ19為載體，將目的基因ldc克隆至谷氨酸棒桿菌中，經(jīng)36h發(fā)酵，產(chǎn)量為0.96g/L產(chǎn)量0.96g/L微生物直接發(fā)酵法9產(chǎn)率38%日本學者Takahshi研究大腸桿菌

的游離細胞，以D，L－賴氨酸為底物通過LDC不對稱降解L－賴氨酸獲得D－賴氨酸和1，5－戊二胺，經(jīng)過多步驟的產(chǎn)物分離過程，可達到38%的產(chǎn)率。產(chǎn)物分離過程復雜,成本高，細胞無重復使用性。

蔣麗麗等研究了4種固定化蜂房哈夫尼菌菌體細胞的材料和方法,包括海藻酸鈣包埋法，半透膜透析袋法,海藻酸鈣一明膠交聯(lián)包埋法和明膠包埋法，其中海藻酸鈣包埋法穩(wěn)定性最好。用該方法轉化測得酶活可達1028.9U/mL，重復性佳:第一批固定化細胞酶活可達游離菌體的98.62%,第四批為第一批的38.68%海藻酸鈣包埋法朱婧在《微生物轉發(fā)L-賴氨酸為尸胺》的碩士論文中優(yōu)化了產(chǎn)酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，經(jīng)過20h的反應,細胞的酶活基本比較穩(wěn)定,20h時還能保持起始酶活的91%,投入底物賴氨酸160g,應得尸胺111.1g,實際得到尸胺105.11g,尸胺收率為94.61%。收率94.61微生物轉化法10采用游離細胞進行微生物轉化法生產(chǎn)戊二胺，雖然能夠富集賴氨酸脫羧酶，無重復使用性較差，并且由于菌種不能積累賴氨酸，需要外加賴氨酸作為酶的反應底物，故仍無法解決原料成本過高的問題。112.4戊二胺的代謝機理研究L—賴氨酸脫羧反應機理12L一賴氨酸脫羧酶(L一lysinedecarboxylase,簡稱LDC),是可逆的將賴氨酸脫C02生成尸胺(1,5一戊二胺)的酶，此酶是誘導性胞內(nèi)酶,需磷酸毗哆醛為輔酶促進脫羧反應。LDC存在于E.coli、尸桿菌(Bacteriumcadaveris)、Hafniaalvei等大多數(shù)微生物中，其也存在于高等植物中，如黃瓜等。其中細菌來源的賴氨酸脫羧酶有2種:cadA和

ldcC，ldcC是功能基因，在任何時候表達量都很弱。此外，在攜帶ldcC多拷貝量的菌株中，賴氨酸脫羧酶酶活會增加。賴氨酸脫羧酶（LDC）131,5—戊二胺在E.coil中的代謝圖譜14目前，在工程菌的研究改造方面多集中于C.glutamicum,

C.glutamicum

的最佳生長pH條件為中性，而ldc在中性條件下更有利于提高其表達量；因此，一方面有構建攜帶ldc基因或賴氨酸—戊二胺反向轉運調(diào)節(jié)基因cadB的穿梭質(zhì)粒，在C.glutamicum中復制表達蛋白;另一方面或?qū)dc基因插入到C.glutamicum的基因組中進行表達。15高濃度的尸胺不僅具有反饋抑制作用，還可導致細胞膜孔蛋白的關閉，影響細菌的正常生長，戊二胺代謝系統(tǒng)不僅包括其生物合成系統(tǒng)，還包括其轉運系統(tǒng)、降解等代謝系統(tǒng)，我們需要深入研究微生物中1，5－戊二胺代謝途徑、關鍵酶、代謝流動分配和控制因素等。改造思路：①主要通過過量表達賴氨酸脫羧酶基因，通過構建攜有l(wèi)dc基因的多拷貝質(zhì)粒；②用強啟動子增強賴氨酸脫羧酶基因的轉錄水平；增加賴氨酸代謝支路的流量；③增加1,5—戊二胺的排泄或篩選解除產(chǎn)物反饋抑制突變株以解除1,5—戊二胺對賴氨酸脫羧酶的反饋抑制；④敲除壓力反饋調(diào)節(jié)基因rpoS，降低戊二胺對菌體生長代謝的抑制作用。16技術手段：

①進行有效基因定向改造，利用易錯PCR、DNA改組、雜合酶、交錯延伸等酶的體外定向進化的方法對賴氨酸脫羧酶進行基因改造；②應用生物信息學和代謝組學等知識構建完善的代謝模型和計算模型，對產(chǎn)物代謝流進行分析；③采取單因素、響應面法和正交設計法等方法，優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件，從而達到提高酶活、進一步提高1，5－戊二胺產(chǎn)量的目的；④采用恒溫等離子誘變技術（ARTP）對現(xiàn)有高產(chǎn)賴氨酸工程菌進行等離子誘變，篩選正突變菌株。172.5簡述德國巴斯夫公司有關戊二胺的提取工藝技術1，去除發(fā)酵液中的細胞；2，堿化發(fā)酵液——通過加入堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物將發(fā)酵液調(diào)整到PH=11，或者更高，依據(jù)乙?；鵇AP的量；3，熱處理發(fā)酵液——將堿化的發(fā)酵液通過加熱到回流溫度進行熱處理；4，采用偶極質(zhì)子性有機溶劑璉烷醇或環(huán)烷醇作為萃取劑（在升高的溫度下進行）；5，通過蒸餾提純或在相中沉淀從取出的有機相中分離DAP18易錯PCR是在采用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調(diào)整反應條件，如提高Mg離子濃度，加入錳離子，改變體系中四種dNTPs濃度或運用低保真度DNA聚合酶，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機突變體。其關鍵在于對合適突變頻率的選擇，突變頻率太高會導致絕大多數(shù)突變?yōu)橛泻ν蛔?，無法篩選到有益的突變，頻率太低則會導致文庫中全是野生型群體。理想的堿基置換頻率和易錯的最佳條件主要依賴于突變的DNA片段的長度。連續(xù)易錯PC策略（sequentialermr-PronePCR）：將一次擴增得到的有益突變基因作為下一次擴增的模板，連續(xù)反復的隨機誘變，讓有益的正突變不斷的積累。DNAshuffling：目前最方便，有效的一種分子水平的體外定向進化技術，通過對單基因或相關基因家族的靶序列進行多輪隨機誘變、重組和高通量篩選，可以有效富集正突變，去除負突變，提高突變文庫的豐度。2.6詞條：易錯PCR及DNA重組19第三章丁二胺分子式：C4H12N2，分子量為88.15，白色結晶，熔點27—28℃，沸點為158—159℃，相對密度為0.8777，易溶于水，能吸收二氧化碳，有強烈的氨臭味。用途：有機合成中間體，用于制藥和生化研究；制備表面活性劑，以及農(nóng)用化學品；是合成新型材料尼龍46的原料。制備方法：由吡咯和鹽酸羥胺反應得丁二肟(wo),經(jīng)還原得丁二胺；也有通過丁二氰脫氫反應來制備丁二胺。3.11,4—丁二胺的性質(zhì)203.2大腸桿菌中1,4—丁二胺的代謝圖21E.colipossessestwoformsofODC:oneisaconstitutiveoneencodedbythespeCgene,andtheotherisaninducible(可誘導)oneatlowpH,whichisencodedbythespeFgene.Inanearlierstudy,recombinantE.coliDR112strainoverexpressingthespeCgeneproduced25mg/Lofputrescine(KashiwagiandIgarashi,1988).Morerecently,Eppelmannetal.(2006)reportedproductionofputrescineupto5.1g/Lbyfedbatchculture（補料分批培養(yǎng)）ofE.coliLJ110overexpressingthespeFgene.Eventhoughthisconcentrationisrelativelyhigh,itisnothighenoughtobeconsideredtobecompetitivewiththeexistingchemicalprocess.Also,theuseofratherexpensiveisopropyl-b-D-thiogalactopyranoside(IPTG)asaninducerintheabovestudyisnotencouragedforrealindustrialapplication.223.3改造思路3.4改造方法①構建含有speC基因的低拷貝p15speC質(zhì)粒；②敲除染色體基因；③用trc啟動子替換原基因啟動子23其中實心正方形曲線圖為XQ52菌株并攜帶p15speC?？招那€為XQ43菌株并攜帶p15speC質(zhì)粒。atoC基因跟短鏈脂肪酸的代謝有關；rpoS壓力調(diào)控基因,是大腸桿茵RNA聚合酶的一個亞基。在壓力情況下，如高溫、酸、滲透沖擊、營養(yǎng)缺陷和生長進入穩(wěn)定期等能夠被誘導，并在一定程度上能夠取代σ70與核心酶結合形成全酶，從而激活多數(shù)σs依賴的基因的轉錄243.5學習與總結質(zhì)粒構建易錯PCR酶工程

學習什么？啟動子替換rpoS代謝流25[1]蔣麗麗,劉均忠,沈俞,等.用固定化L一賴氨酸脫梭酶細胞制備1,5一戊二胺[s].精細化工,2007,11:1079一1084.[2]牛濤，黎明，張建中等.一步法生產(chǎn)1,5—戊二胺谷氨酸棒桿菌基因工程菌的構建[J].中國生物工程雜志，2010,93-99.[3]朱婧.微生物轉化L－賴氨酸為尸胺的研究[D].天津:天津科技大學.2009．[4]黃云雁黎明劉萌，等.賴氨酸-尸胺反向轉運蛋白cadB基因谷氨酸棒桿菌表達載體的構建及轉化[J].生物技術通報,2012,8[5]M·弗爾科特，O·策爾德爾，B·恩斯特，等.發(fā)酵生產(chǎn)1,5—二氨基戊烷的方法[P].200980110562.9,2009,1,23.[6]劉玉芳.尼龍54的改性[