酵母細胞的固定化

課題3

酵母細胞的固定化429572439gao一、基礎知識1、酶制劑的概念和種類（一）酶制劑含有酶的制品①定義：多酶片、加酶洗衣粉中的蛋白酶和脂肪酶②種類：A、液體酶制劑治療某些胃病的胃蛋白酶液B、固體酶制劑429572439gao2、酶的生產(chǎn)①提取法定義：采用一定的技術(shù)直接從動植物或微生物的組織、細胞中將酶提取出來優(yōu)點：簡單易行，在動植物或微生物資源豐富的地區(qū)具有應用價值實例：在屠宰廠，可以從家畜胰臟中提取出胰酶；在水果加工廠，可以從菠蘿皮中提取出菠蘿蛋白酶缺點：要有充足的原材料，廣泛應用受到限制429572439gao②發(fā)酵法定義：通過微生物發(fā)酵獲得所需要的酶如果是胞外酶，可以從發(fā)酵液中直接提??；如果是細胞內(nèi)酶，則可將細胞弄碎再經(jīng)過提取純化而得到易培養(yǎng)、繁殖速度快、便于大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)點：提取方式：429572439gao③化學合成法缺點：成本高、已知分子結(jié)構(gòu)的酶提取出來的酶還要經(jīng)過分離、純化，再加入適量的穩(wěn)定劑和填充劑，制成相應的酶制劑后才能用于催化化學反應3、酶的提取和分離純化429572439gao①酶的提取鹽溶液提取法、堿溶液提取法、有機溶劑提取法適宜的溫度和pH和保護劑方法：條件：②酶的分離提純沉淀技術(shù)（密度梯度離心法）層析技術(shù)方法：429572439gao4、酶制劑特點(看課本P49面）①天然酶通常對強酸、強堿、高溫和有機溶劑等條件非常敏感，容易失活②溶液中酶很難回收，不能再次利用，提高了生產(chǎn)成本③反應后，酶會混在產(chǎn)物中，影響產(chǎn)品質(zhì)量，難以在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用（1）優(yōu)點（2）實際問題催化效率高、低耗能、低污染，大規(guī)模地應用于食品、化工等各個領(lǐng)域如何解決這些問題？429572439gao（二）固定化酶固定化酶是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經(jīng)物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑（三）固定化細胞將細胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細胞固定化技術(shù)被限制或定位于特定空間位置的細胞稱為固定化細胞固定化技術(shù)：固定化細胞：429572439gao類型優(yōu)點不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等對環(huán)境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應后酶會混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量固定化酶酶既能與反應物接觸，又能與產(chǎn)物分離，同時，固定在載體上的酶還可以被反復利用一種酶只能催化一種化學反應，而在生產(chǎn)實踐中，很多產(chǎn)物的形成都通過一系列的酶促反應才能得到的固定化細胞成本低、操作容易、對酶活性的影響更小、可以催化一系列的反應、容易回收固定后的酶或細胞與反應物不容易接近，可能導致反應效果下降由于大分子物質(zhì)難以自由通過細胞膜，因此固定化細胞的應用也受到限制（四）直接使用酶、固定化酶和固定化細胞催化的優(yōu)缺點429572439gao（五）酶和細胞固定化方法思考：固定化酶或固定化細胞可以采取哪些方法？各有什么利弊？1、物理吸附法2、包埋法3、化學結(jié)合法429572439gao方法原理適用對象包埋法將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進劑(包括交聯(lián)劑)的作用進行聚合，酶被包埋在聚合物中以達到固定化酶或細胞429572439gao方法原理適用對象化學結(jié)合法酶蛋白的側(cè)鏈基團和載休表面上的功能基團之間形成共價鍵而固定的方法酶物理吸附法通過氫鍵、疏水作用和π電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上。從而制成固定化酶酶429572439gao429572439gao429572439gao（六）酶和細胞固定方法的選擇①酶適合采用化學結(jié)合和物理吸附法固定②細胞適合采用包埋法固定1、方法2、原因①細胞個大，酶分子很?、趥€體大的細胞難以被吸附或結(jié)合而個小的酶容易從包埋的材料中漏出429572439gao（七）固定化酶的應用實例1、高果糖漿①生產(chǎn)原料葡萄糖，葡萄糖是由淀粉轉(zhuǎn)化而來是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)作用，將其中一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，由葡萄糖和果糖而組成的一種混合糖糖漿②生產(chǎn)機理429572439gao③生產(chǎn)流程含淀粉的漿液α-淀粉酶糊精糖化酶葡萄糖葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖的異構(gòu)化42%～45%轉(zhuǎn)化成果糖果葡糖漿果糖和葡萄糖分離葡萄糖再次異構(gòu)化反復多次果糖含量70%～90%高果糖漿429572439gao④生產(chǎn)優(yōu)點反應柱能連續(xù)使用半年，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了果糖的產(chǎn)量和質(zhì)量429572439gao二、實驗操作（一）方法1、包埋法固定化細胞2、海藻酸鈉作載體包埋酵母細胞（二）制備固定化酵母細胞429572439gao1、酵母細胞的活化①過程稱取1g干酵母，放入50ml的小燒杯中，加入蒸餾水10ml。用玻璃棒攪拌，使酵母細胞混合均勻，成糊狀，放置1h左右，使其活化②注意事項A、選用的干酵母要具有較強的活性，而且物種單一B、在缺水狀態(tài)下，微生物處于休眠狀態(tài)?；罨褪亲屘幱?)的微生物重新恢復正常的生活狀態(tài)休眠狀態(tài)429572439gao429572439gao2、配置物質(zhì)的量濃度為0.05mol/L的CaCl2溶液①過程稱取無水CaCl20.83g，放入200ml的燒杯中，加入150ml的蒸餾水，使其充分溶解，待用②注意事項溶解物質(zhì)要徹底，勿用自來水溶解，以防自來水中各種離子影響實驗結(jié)果429572439gao3、配制海藻酸鈉溶液稱取0.7g海藻酸鈉，放入50ml小燒杯中，加入10ml水，用酒精燈加熱，邊加熱邊攪拌，將海藻酸鈉調(diào)成糊狀，直至完全溶化，用蒸餾水定容至10ml①過程②注意事項加熱時要用()，或者()，反復幾次，直到海藻酸鈉溶化為止小火間斷加熱429572439gao海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細胞的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細胞的數(shù)目少429572439gao429572439gao4、海藻酸鈉溶液和酵母細胞混合將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入以活化的酵母細胞，進行充分攪拌，再轉(zhuǎn)移至注射器中①過程②注意事項A、溶化好的海藻酸鈉溶液必須冷卻至室溫，否則會因溫度過高殺死酵母菌429572439gao429572439gaoB、攪拌要徹底充分，使兩者混合均勻，以免影響實驗結(jié)果的觀察（5）固定化酵母細胞以恒定的速度緩慢的將注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，將形成的凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右①過程429572439gao429572439gao②注意事項A、可利用海藻酸鈉制成不含酵母菌的凝膠珠，用作對照B、海藻酸鈉膠體在CaCl2這種電解質(zhì)的作用下，發(fā)生聚沉，形成凝膠珠，需穩(wěn)定30min左右（三）用固定化酵母細胞發(fā)酵①將固定化酵母細胞（凝膠珠）用蒸餾水沖洗2－3次，洗去凝膠珠表面多余的電解質(zhì)溶液1、過程429572439gao剛形成的凝膠珠應在CaCl2溶液中浸泡一段時間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。檢驗凝膠珠的質(zhì)量是否合格，可以使用下列方法。一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實驗桌上用手擠壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。二是在實驗桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的429572439gao②將150ml質(zhì)量分數(shù)為10％的葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移至200ml的錐形瓶中，再加入固定好的酵母細胞，置于25°C下發(fā)酵24h2、注意事項①控制好發(fā)酵溫度，一般是室溫25°C②發(fā)酵時間可視具體情況而定，一般時間稍長一些，效果明顯③可用不含酵母的凝膠珠做相同的處理，對照實驗結(jié)果429572439gao4295724