實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)與分離

實驗1大腸桿菌的培養(yǎng)與分離大腸桿菌介紹.(看教材:P19)一、實驗目的二、細菌的培養(yǎng)和分離2．細菌培養(yǎng)基種類3．接種工具和接種方法：1．細菌的營養(yǎng)物質(zhì)：水、碳源、氮源、無機鹽、生長因子。LB固體培養(yǎng)基：用于細菌的分離4．細菌分離方法：（1）劃線分離法（2）涂布分離法LB液體培養(yǎng)基：用于細菌擴大培養(yǎng)(看教材P19)三、滅菌操作（1）實驗用具滅菌：（2）培養(yǎng)基滅菌：高壓蒸汽滅菌（121℃、15min）A．能加熱的培養(yǎng)基滅菌（1kg/cm2壓力、15min）例外：有葡萄糖的培養(yǎng)基（500g/cm2壓力、30min）B．不能加熱的培養(yǎng)基：G6玻璃砂漏斗過濾（細胞不能通過)四、設備及用品(看教材P21)五、材料(看教材P21)(看教材P20)六、步驟③①②④（1）器具及培養(yǎng)基滅菌（2）自三角瓶向培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移固體培養(yǎng)基(倒平板）（3）將菌體放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h)（4）菌液劃線分離(37℃恒溫培養(yǎng)12～24h),

出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落)（5）保存單菌落——劃線法接種于斜面(4℃冰箱保存)。(看教材P22～23)問題討論可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2．為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。1．培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？3．平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。4．在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。5．為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？6．在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。7．在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。教材思考與練習1．如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?2．在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染？3．進行恒溫培養(yǎng)時為什么要將培養(yǎng)皿倒置？4．實驗完成后，接觸過的器皿應如何處理？5．如果分離的是轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌、如何保證不被普通的大腸桿菌所污染？大腸桿菌1．大腸桿菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌2．大腸桿菌屬腸道內(nèi)共生菌；益處：①合成VB和VK；②產(chǎn)生大腸桿菌素，抑制腸道致病菌和腐生菌滋生。

③產(chǎn)生放療和化療的必用輔助藥：rhGM-CSF

害處：①有些菌株對人體有害，可侵襲腸粘膜并產(chǎn)生毒素②引起腸外感染，如腎炎、膀胱炎等。革蘭氏染色法革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師、細菌學家ChristainGram創(chuàng)立。細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；革蘭氏陽性菌對青霉素敏感，大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌、弧菌、螺旋體都呈現(xiàn)負反應。革蘭氏陰性菌對鏈霉素敏感。

微生物的營養(yǎng)為微生物提供除C、N以外的各種元素K2PO4、MgSO4無機鹽酶和核酸的組成成分維生素、氨基酸、堿基等，酵母膏、蛋白胨、組織提取液生長因子合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮的代謝產(chǎn)物。常用：銨鹽、硝酸鹽，其他：氮氣、氨、尿素、牛肉膏、蛋白胨。氮源構(gòu)成細胞物質(zhì)、合成代謝產(chǎn)物，能源物質(zhì)。主要是葡萄糖，其次有CO2、NaHCO3、脂肪酸、花生餅、石油。碳源功能來源營養(yǎng)物質(zhì)LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g

酵母提取液0.25g

氯化鈉0.5g（維持一定滲透壓）水50mLLB固體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g

酵母提取液0.25g

氯化鈉0.5g（維持一定滲透壓）

瓊脂1g

水50mL接種工具接種方法平板劃線操作用涂布分離法分離細菌步驟：a、加水b、裝鍋c、加熱排氣d、加熱e、保溫保壓f、出鍋適量，過少？過多？不要裝的過滿按對稱方式旋緊四周固定螺栓100KPa，121℃，15min壓力表降至0、溫度降至100℃以下，打開排氣閥，旋開螺旋。打開排氣閥排氣手提式滅菌鍋的使用濾器編號

濾片平均濾孔

一般用途180~120

濾除粗顆粒沉淀，收集或分布粗分子氣體240~80濾除較粗顆粒沉淀,收集或分布較粗分子氣體315~40