遺傳毒物與細胞死亡

第七章遺傳毒物與細胞死亡12023/2/5第一節(jié)細胞凋亡與非凋亡性死亡第二節(jié)細胞凋亡概論第三節(jié)遺傳毒物誘導細胞凋亡的信號及其轉(zhuǎn)導通路第四節(jié)細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路的負調(diào)控機制第五節(jié)細胞的非凋亡性死亡第六節(jié)細胞凋亡的生物學特征及其檢測22023/2/5第一節(jié)細胞凋亡與非凋亡性死亡3細胞死亡是生物界普遍存在的現(xiàn)象，不同于機體死亡。正常組織中，每天都有千千萬萬個細胞死亡。細胞死亡的方式通常有2種：細胞壞死（necrosis）細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）2023/2/52023/2/541、細胞壞死（necrosis）概念：細胞壞死是由于有害刺激或細胞內(nèi)環(huán)境的嚴重紊亂導致細胞急劇死亡。主要形態(tài)學特征：細胞發(fā)生腫脹，最后導致細胞膜破裂和溶解，細胞內(nèi)前炎癥因子等內(nèi)容物釋放，引起嚴重的炎癥反應。細胞壞死現(xiàn)象與人類多種疾病相關。如病毒感染引起的急性重型肝細胞壞死，青光眼導致神經(jīng)細胞壞死，造成視力逐漸減弱，最終導致失明。52、細胞凋亡（apoptosis）細胞凋亡(apoptosis)也稱細胞程序性死亡(programmedcelldeath，PCD)則是由于細胞內(nèi)外因子誘發(fā)的細胞內(nèi)一個特殊的蛋白酶級聯(lián)反應而發(fā)生的有序死亡。誘發(fā)因素：體外因素，細胞處于不利生長環(huán)境，如溫度、pH、射線、藥物和病毒感染等；體內(nèi)因素，如腫瘤、自身免疫病和退行性病變等；生理因素：胚胎發(fā)育和變態(tài)過程也可產(chǎn)生細胞凋亡。形態(tài)特征：細胞皺縮、染色質(zhì)濃縮和出現(xiàn)凋亡小體，細胞膜完整、無前炎癥因子等細胞內(nèi)容物流出，無炎癥反應。2023/2/5ApoptosisversusNecrosis2023/2/567特征細胞凋亡細胞壞死定義

在形態(tài)學上表現(xiàn)為細胞皺縮，核碎裂、胞漿生芽和形成凋亡小體為病理性襲擊的結(jié)果，質(zhì)膜的完整性突然消失、膜電化學梯度消失和細胞內(nèi)容物釋出誘發(fā)刺激生理性或病理性病理性形態(tài)表現(xiàn)成泡有（細胞器呈泡狀）有（無細胞器呈泡狀）質(zhì)膜完整性保持破損細胞大小縮小——細胞皺縮和形成凋亡小體增大——細胞腫脹并溶解炎癥反應無有細胞內(nèi)容釋出不是生化表現(xiàn)大分子（蛋白質(zhì)）合成有些情況下必需非必需基因表達

有些情況下必需非隨機裂解為50、300kb，隨后再裂非必需

DNA裂解

解為180bp為倍數(shù)的碎片（大小由涉及的核小體數(shù)決定）隨機裂解

調(diào)控高度受控不受調(diào)控半胱天冬酶級聯(lián)反應必需非必需

細胞凋亡和細胞壞死的比較2023/2/52023/2/583、細胞凋亡的生物學意義細胞凋亡的生理意義：細胞凋亡對于保證個體正常發(fā)育、維持正常生理功能，并使機體適應內(nèi)外環(huán)境的變化具有重要的生理意義。細胞凋亡是基因調(diào)控的主動過程，典型的細胞凋亡過程涉及一系列半胱天冬蛋白酶（caspase）的水解、活化和信號傳遞過程。在發(fā)育過程中清除多余的細胞清除已完成功能的細胞

清除發(fā)育不正常的細胞清除正常生理活動過程中無用的細胞清除病理活動中有潛在危險的細胞2023/2/592023/2/5104、細胞凋亡的病理意義細胞凋亡調(diào)節(jié)失控或錯誤將會引起生物體的發(fā)育異常、功能紊亂和嚴重疾病。與細胞凋亡相關的疾病如濾泡性淋巴瘤、乳腺癌和白血病等惡性腫瘤，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎炎等自身免疫性疾病，腺病毒和皰疹病毒感染的疾病等，均與細胞凋亡缺陷（“該死不死”）有關；而阿爾茨海默病、帕金森氏病和小腦退化癥等神經(jīng)退行性疾病、骨髓發(fā)育不全性疾病、缺血性損傷和酒精中毒性肝炎等則與細胞凋亡過度（“不該死的死了”）有關。第二節(jié)細胞凋亡概論凋亡過程的執(zhí)行器(executor)為細胞中的蛋白酶，不論何種因素誘發(fā)的細胞凋亡，雖其具體的信號通路有別，但最終無例外都是激發(fā)以蛋白酶組成的級聯(lián)反應這個中心環(huán)節(jié)。2023/2/511接受凋亡信號凋亡的級聯(lián)反應凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化12半胱天冬酶Caspase(Cysteinylaspartate-specificprotease)：在特異的天冬氨酸之后切割靶蛋白的一類進化上保守的半胱氨酸蛋白酶。一、半胱天冬酶（Caspase）是凋亡的執(zhí)行者半胱天冬酶家族有十余個成員，是凋亡過程中最重要的影響因素之一，但不同成員在凋亡中起的作用不全相同。2023/2/5131、Caspase通常以酶原（Procaspase）形式存在，相對分子質(zhì)量為29-49kD。2、酶原N末端具有一個前功能域（Prodomain）、一個大亞單位（約20kD）和一個C末端小亞單位（約10kD）。3、在大、小亞單位保守的QACXG基序（motif）中有半胱氨酸活性部位（X=R、Q或G），其中C是必需的。前功能域與大亞單位由一天冬氨酸裂解部位分開，大、小亞單位由接頭隔開，接頭位于大、小亞單位的含有一或兩個天冬氨酸裂解部位的功能域之間。4、活性形式為雜四聚體（p17-20）2（p10-12）2二、Caspase家族特征2023/2/5根據(jù)在細胞凋亡中起的作用，Caspases分為兩大類：啟始Caspase(Initiator)和效應Caspase(Effector)1）啟始Caspases包括-2，-8，-9，-10等，對細胞凋亡的刺激信號作出反應，啟動細胞的凋亡過程；2）效應Caspases包括-3，-6，-7等，是在細胞凋亡過程中的具體執(zhí)行者，完成對特定蛋白底物的水解。半胱天冬酶的功能取決于半胱天冬酶的底物特異性、前功能域的長度和序列。三、Caspases的分類2023/2/515哺乳類細胞內(nèi)的Caspases的一級結(jié)構(gòu)2023/2/516按催化特異性分：組別催化感應序列成員活性中心前區(qū)域特異催化位點I

WEHDCaspase-1Caspase-4Caspase-5QACRGQACRGQACRGP12P12P12WEHD↓(WL)EHD↓(WL)EHD↓II

DEXDCaspase-2Caspase-3Caspase-7QACRGQACRGQACRGP17P2P2DEHD↓DEVD↓DEVD↓III

(I/V/L)EXDCaspase-8Caspase-9Caspase-10Caspase-6QACRGQACGGQACQGQACRGP27P19P27P2IETD↓LEHD↓LE(N/L/E)D↓VEHD2023/2/517

Caspase活化機制：

Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，雖然分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，并進而形成兩兩組成的有活性的四聚體。

四、Caspase激活的方式2023/2/5182023/2/519半胱天冬酶級聯(lián)反應1、啟始Caspase激活（同源激活）的兩種典型方式：（1）Caspase-8的激活(Caspases-2,-10)? 死亡受體（Fas或TNFR）與死亡配體（FasL或TNF）結(jié)合后，死亡受體三聚體化。? 通過死亡結(jié)構(gòu)域DD（Deathdomain）的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，死亡受體與接頭蛋白的DD結(jié)合Fas結(jié)合蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain）結(jié)合，形成死亡誘導信號復合物DISC（Death-inducingsignallingcomplex）。? 通過FADD的死亡效應結(jié)構(gòu)域(DED(Deatheffectordomain)，Procaspase-8被募集在DISC上。? 聚集后的Procaspase-8，通過自身或相互之間的切割產(chǎn)生成熟的Caspase-8。2023/2/520Procaspase-8的激活過程2023/2/521（2）Caspase-9的激活細胞色素c（Cytochromec）從線粒體釋放。通過凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1(Apoptoticproteaseactivatingfactor-1)的WD40結(jié)構(gòu)域，細胞色素c和Apaf-1結(jié)合。通過Apaf-1的半胱天冬酶募集功能域CARD（Caspaseactivationandrecruitmentdomain）結(jié)構(gòu)域，Apaf-1形成七聚體。通過各自的CARD結(jié)構(gòu)域，Procaspase-9被募集到細胞色素c/dATP/Apaf-1組成的凋亡復合體（Apoptosome）而水解激活。2、效應Caspase的激活（異源激活）效應Caspases不象啟始Caspases，不能被募集到或結(jié)合到DISC或凋亡復合體上，它們必須依賴啟始Caspases才能活化。2023/2/522Caspase-9的激活過程2023/2/52324

底物類別預計功能底物舉例促一和抗凋亡蛋白

信號放大抑制因子激活作用

前一半胱天冬酶，BCL-2，BCL-XL，BID，P28Bap31凋亡機器成員

誘發(fā)凋亡表型半胱天冬酶激活脫氧核糖核酸酶抑制因子(ICAD)、肌動蛋白、膠溶蛋白(gelsolin)、P21激活的激酶-2(PAK2)，絲裂原激活的蛋白激酶-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的激酶-1(MEKKl)、蛋白激酶Cδ(PKCδ)結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)合分子細胞完整性解體

細胞包裝

核纖層蛋白、核有絲分裂器蛋白(nuclearmitoticapparatusprotein)、支架附著因子-A(scaffoldattachmentfactor-A)、胞襯蛋白(fodrin)、Gas2[生成停頓特異基因-2(growtharrestspecificgene-2)編碼蛋白]、角蛋白、肌動蛋白、rabaptin-5，p-連環(huán)蛋白，黏著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)穩(wěn)態(tài)蛋白破壞大分子合成和細胞修復機制DNA-依存性蛋白激酶酶促亞單位(DNAdependentproteinkinase

catalyticsubunitDNA-PKcs)、多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly(ADP-ri-bose)polymerase，PARP、U1-70-kDa蛋白、復制因子C(replicationfactorC，RFC-140)、不均一核核糖核蛋白(HnRNP)、D4-GDP解離抑制因子(GDPdissociationinhibitor，GDI)、轉(zhuǎn)錄因子終止存活信號

其他

不明？凋亡誘導Huntingtin蛋白、早老蛋白(presenilin)、萎縮索-1（atrophin-1），ataxin-3，胞漿磷脂酶A2五、Caspases的底物2023/2/52023/2/525半胱天冬酶是凋亡執(zhí)行器的中心組成成分2023/2/526第三節(jié)遺傳毒物誘導細胞凋亡的信號及其轉(zhuǎn)導通路一、P53蛋白介導的細胞凋亡二、經(jīng)第二信使神經(jīng)酰胺介導的細胞凋亡三、經(jīng)應激信號觸發(fā)的細胞凋亡四、經(jīng)死亡受體觸發(fā)凋亡的信號通路五、鈣過荷誘發(fā)的細胞凋亡六、線粒體觸發(fā)細胞凋亡及其對死亡信號整合作用七、MYC與細胞凋亡促進細胞凋亡抑制細胞凋亡bax,bcl-xsbcl-2,bcl-xl野生型p53突變型p53FAS/Apo-1IAP（survivin）caspaseC-myc細胞凋亡是一個多基因調(diào)控的過程1、細胞凋亡過程表達的基因，多數(shù)抑癌基因；2、促細胞凋亡基因，多數(shù)抑癌基因；3、抑制細胞凋亡基因，多數(shù)癌基因。

一、細胞凋亡相關基因2023/2/5271、Bcl-2家族（Bcelllymphoma/leukemia-2）B細胞淋巴瘤/白血病-2)Bc1-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延長細胞的生存，能抑制細胞凋亡,而不是促進細胞的增殖。

Bcl-2家族已發(fā)現(xiàn)15個成員，所有Bcl-2家族成員均含有1個或多個保守功能區(qū)（BH結(jié)構(gòu)域）。蛋白含有4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域，依次命名為BHl、BH2、BH3和BH4?？煞譃?個亞族：2023/2/5282023/2/529Bcl-2亞家族：Bcl-2Bcl-xlBcl-w、Mcl-1、A1

Bcl-2亞家族成員對細胞凋亡起抑制作用。

Bax亞家族：Bax、Bak、Bok，它們的作用與Bcl-2亞家族的作用相反，可促進細胞凋亡。

BH3亞家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；僅有BH3結(jié)構(gòu)域。它們的作用也與Bcl-2亞家族的作用相反，可促進細胞凋亡。

作用機制：影響凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1的功能影響線粒體的結(jié)構(gòu)與功能2023/2/530Bcl-2蛋白家族成員概況家族成員氨基酸數(shù)目與Bcl-2同源性分子量C-疏水端調(diào)節(jié)凋亡Bcl-2，H239m23626有抑制Bcl-XLH233m2414426有抑制Bcl-XsH178m17018有促進Baxh1922121有促進BakH216/m2112823,4無促進BadM204*22,1無促進AIM17240*20無抑制Mcl-1H35035△37有抑制Ced-9C2782332有抑制BHRF-1v1912222有抑制LMW5-HLv1782620無抑制EIB19Kv176☆19無抑制2023/2/531Bcl-2蛋白家族成員的相互作用與細胞凋亡的關系2023/2/532家族成員可能存在的聚合體形式抑制凋亡bcl-2bcl-2/bcl-2bax/bcl-2bcl-XLbcl-XL/bcl-XLbcl-2/bcl-XLMcl-1Mcl-1//bcl-XLMcl-1/bcl-2baxBax/baxbax/bax-XL促進凋亡bcl-XsBcl-Xs/bcl-2bcl-Xs/bcl-XLbadBad/bcl-2bad/bcl-XLbakBak/bcl-XL2023/2/5332023/2/5342、電壓依賴性陰離子通道

（VDAC)和腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶(ANT)

是線粒體外膜上最為豐富的兩種蛋白。最近有一些研究工作表明，WDAC和ANT可與Bc1-2家族蛋白相互作用，在細胞凋亡過程中介導對線粒體的損傷。VDAC本身是一種通道蛋白，它與Bax的結(jié)合可使共通道性能發(fā)生某種變化，這樣一些凋亡蛋白如cytC就可通過。因為這兩種蛋白在跨越線粒體膜的核苷酸和小分子轉(zhuǎn)運中起作用，所以它們與Bax的結(jié)合可能與細胞凋亡過程中線粒體ATP/ADP轉(zhuǎn)化和磷酸肌酸外運的抑制有關。2023/2/5352023/2/5363、P53與細胞凋亡

P53是腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物主要存在于細胞核內(nèi)。P53基因是人類腫瘤有關基因中突變頻率最高的基因。在依賴P53蛋白的細胞凋亡中，P53基因是通過調(diào)節(jié)Bc1-2和Bax基因的表達來影響細胞凋亡的。P53蛋白能特異地抑制Bc1-2的表達，相反對Bax的表達則有明顯的促進作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的轉(zhuǎn)錄活化因子。在這些細胞中，P53蛋白的積累和活動引起了細胞凋亡。2023/2/5374、IAP（inhibitorofapoptosis，細胞凋亡抑制因子）

IAP超家族的成員較多，如c-IAP1,c-IAP2,XIAP,NIAP和Survivin，新的成員在不斷的被發(fā)現(xiàn)。IAP家族成員有一個共同的特征，含有一個或多個由70個氨基酸的重復序列（BIR），類似于鋅指狀的結(jié)構(gòu)。c-IAP1、c-IAP2和XIAP含有環(huán)指狀結(jié)構(gòu)。BIR功能域和之間的連接區(qū)域介導對caspase的抑制作用，而環(huán)指狀結(jié)構(gòu)則具有泛素化蛋白連接酶的作用，介導caspase-３和-７的泛素化降解作用。2023/2/5382023/2/5395、Smac/Dablo

在細胞凋亡過程中它可以從線粒體釋放進入細胞質(zhì)。成熟的Smac蛋白產(chǎn)生一個新的N基端,這個N基端的前面4個氨基酸可以與lAP的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合。Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結(jié)合。Smac與BIR2的結(jié)合可以中和XlAP對胱解酶9的抑制，促進凋亡。2023/2/5402023/2/5416、白介素-1?轉(zhuǎn)換酶（interlukin1-?-convertingenzyme，ICE），與線蟲細胞凋亡相關基因Ced-3有較高的同源性，具有直接誘導細胞凋亡的作用。7、Fas為死亡受體，F(xiàn)as-L是T淋巴細胞產(chǎn)物，F(xiàn)as和Fas-L結(jié)合誘導細胞凋亡。2023/2/5422023/2/5438、癌基因c-myc是調(diào)控細胞周期的主要基因。研究表明，c-myc在哺乳動物的細胞凋亡中發(fā)揮作用，它的過度表達既可使細胞周期變短、分裂增加，也可使細胞凋亡，這主要取決于能否獲得關鍵的生長因子。Cleveland認為，抑癌因素存在時，c-myc促進凋亡，而有致癌因素時，c-myc促進增殖。Bax為Bcl-2基因家族成員，可誘導細胞凋亡。

PTEN（phosphataseandtensinhomologdeletedfromchromosome10）是隨P53以后呈現(xiàn)最高突變率的抑癌基因表達產(chǎn)物，它主要催化PI-3，4，5-P3的肌醇3位上去磷酸形成PI-4，5-P2，拮抗PI-3Kinase－PKB/Akt信號通路的抗凋亡作用。因為PKB具有磷酸化抑制Caspase9、Bad的活性和抑制細胞色素C的釋放與Fas介導的凋亡信號轉(zhuǎn)導，以及通過FKHR間接抑制某些凋亡因子基因表達等作用，因此具有很強的抗凋亡作用。9、張力蛋白同源磷酸酯酶（PTEN）2023/2/544PI-4,5-PI2PI-3,4,5-P3PDKPKBPKBPTENpPI3-KpT308S470-PCytCBad-s112-pCaspase-9-s196-pFKHR-s256-pFasdenpendentapoptosisApoptosis張力蛋白同源磷酸酯酶（PTEN）的促細胞凋亡機制2023/2/545

病毒在感染宿主細胞后進行病毒分泌(virocrine),分泌的病毒因子中有些同源于細胞生長因子、生長因子受體或信號轉(zhuǎn)導分子，促進宿主細胞增殖和轉(zhuǎn)化，有些是阻止宿主細胞的凋亡防御，保護病毒的生存和免被消滅和清除。

（1）CrmA（cytokineresponsemodifierA，細胞因子反應修飾因子A）。這是牛痘病毒分泌的一種蛋白質(zhì)因子，分子量38KD，它具有抑制Caspase3和顆粒酶B（GranzymeB）活性而起到抗凋亡作用。 10、病毒因子2023/2/546（2）P35:這是由桿狀病毒分泌的一種病毒因子，分子量35KD，其分子結(jié)構(gòu)與BcL-2部分同源，故具有抑制凋亡的作用。（3）EIB55KD和EIB19KD:均是腺病毒分泌的病毒因子，二者可分別結(jié)合P53和FLASH而抑制細胞凋亡。FLASH是最近報道的Pro-caspase-8結(jié)合FADD的竟爭性抑制分子，故有抑制Fas介導的凋亡作用）。2023/2/547二、P53蛋白介導的細胞凋亡1．P53基因

P53并非為所有細胞的凋亡過程所必需，但對DNA損傷而誘發(fā)的細胞凋亡卻是必不可少的。（1）P53的兩大功能：

使細胞在G1期停滯。當DNA由于各種原因損傷后，P53首先誘導細胞進入G1期，抑制細胞增殖，直至損傷的DNA修復。

一旦DNA不能被修復，P53就會活化那些誘導細胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄，使細胞發(fā)生凋亡。例如在P53缺乏的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達增高伴隨Bax表達降低。2023/2/548P53GADD45結(jié)合PCNA（增殖細胞核抗原）結(jié)合RPA（復制蛋白A）TNFFas從儲存處釋放出FasFasLDR5BaxBcl-2P21阻止DNA修復和復制細胞凋亡阻止細胞周期在G1期2023/2/549（2）野生型P53和突變型P53對細胞凋亡的作用：野生型P53對細胞凋亡有促進作用，突變型P53對細胞凋亡有抑制作用。目前認為野生型P53抑制Bcl-2基因的表達，促進Bax基因的表達。而突變型P53仍保留對Bcl-2的負調(diào)控，而它自身又成為細胞凋亡的抑制者。因而，P53在調(diào)節(jié)Bcl-2依賴的細胞死亡/生存途徑中發(fā)揮重要作用。2023/2/550p53的功能 野生型和突變型P53對細胞凋亡的作用2023/2/551P53與細胞凋亡

2023/2/552p53andcellularstress–inducedapoptosis各種應激刺激如細胞毒藥物，-射線,熱休克，組織缺氧，DNA損傷劑可穩(wěn)定抑腫瘤蛋白P53，P53促進細胞周期捕獲和修復DNA或促使細胞凋亡以清除損傷細胞。但是，P53怎樣選擇G1期捕獲或者凋亡還不太清楚。P53的脯氨酸富集區(qū)(殘基64-92)

和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(殘基43-63)

被認為是介導凋亡所必須，因為去除這兩個區(qū)域會導致凋亡活性的丟失。2023/2/553另一方面，磷酸化和甲基化對調(diào)節(jié)P53的生物學活性起著重要作用。雖然具體的調(diào)節(jié)機制尚不清楚，但很可能在調(diào)節(jié)P53和其負調(diào)節(jié)子Mdm2的結(jié)合方面發(fā)揮作用。另一個負調(diào)節(jié)機制涉及JNK和P53的結(jié)合，從而介導泛素化（ubiquitination）與P53蛋白水解切除。Rb蛋白能阻止P53的凋亡作用。Rb和Mdm2這兩個P53抑制子在凋亡過程中均被切割，提示是程序性細胞死亡的正自我調(diào)節(jié)以及與關鍵細胞周期調(diào)節(jié)子的密切聯(lián)系。2023/2/554雖然P53的作用機制尚不完全清楚，但有一點很清楚，P53的轉(zhuǎn)錄激活功能是其生物學作用的重要組成部分。許多P53的靶基因及其功能已被確證。依賴于P53的細胞周期捕獲需要P21Waf1,GADD45,和cyclinG的轉(zhuǎn)錄激活。

促凋亡的P53靶蛋白包括Bax,PIGgenes,CD95,DR5(areceptorforthedeathligandTRAIL),IGF-BP3,Rpr(inDrosophila),Cdc42(aRas-likeGTPase),Noxa(aBcl-2familyprotein),和P53AIP1。2023/2/555NuclearandCytoplasmicRolesofp53inApoptosis2023/2/556P53誘導凋亡的機制已被廣泛地研究,涉及mitochondrial

Apaf-1/caspase-9途徑,死亡受體信號,和下游caspases的激活。例如,表達突變P53的細胞不能誘導CD95,對藥物誘導的凋亡敏感性降低。P53能幫助CD95從Golgi轉(zhuǎn)運到細胞膜，導致死亡受體的集合。但是，在某些情況下，CD95不是P53誘導凋亡所必須，P53依賴的CD95上調(diào)并不是每次都能誘導凋亡。2023/2/557另一條P53凋亡信號通路是通過活性氧離子（ROS），影響線粒體膜功能，但并不涉及cytochromeC的釋放。特別是P53誘導的基因PIG3與NADPH-quinone氧化還原酶具有同源性，產(chǎn)生ROS。當獨自過表達時，PIG3不能激發(fā)凋亡，提示其他的信號在同時起作用。最近的研究顯示P53自身能在E1A/ras-transformed的纖維原細胞而不是正常纖維原細胞的提取物中誘導caspase激活,并且不依賴Bax或cytochromeC的轉(zhuǎn)錄或存在。2023/2/558P53也能與c-myc作用，影響c-myc誘導的細胞凋亡。另一P53促進凋亡的機制是通過激活Ras-相似的GTPaseCdc42，激活JNK-1誘導的Bcl-2磷酸化?？傊?，P53介導或涉及P53的凋亡包括一系列不同分子和通路的平行或連續(xù)激活，最終導致完全的死亡反應。2023/2/5592、P53基因家族的其他成員（1）P73基因是P53基因家族發(fā)現(xiàn)的第一個新成員。P73是P53基因家族的成員。P73基因在神經(jīng)母細胞瘤、結(jié)腸癌、惡性黑色素瘤、肝細胞癌、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生缺失的頻率極高。（2）P51基因是P53基因家族發(fā)現(xiàn)的又一新成員。P51在正常組織的表達遠低于P53的水平，同時表現(xiàn)出組織特異性。2023/2/5602023/2/561三、第二信使神經(jīng)酰胺介導的細胞凋亡許多激動劑和應激信號（凋亡誘導因子）可誘發(fā)鞘磷脂(SM)的水解及(或)其他鞘脂代謝改變而發(fā)生神經(jīng)酰胺的積聚。細胞外應激因子激活酸性神經(jīng)鞘磷酯酶(A-smaSe)，催化細胞膜上的神經(jīng)鞘磷酯產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺將信號傳遞到細胞內(nèi)相應的靶分子，啟動凋亡。一些細胞因子和環(huán)境應激因子(包括TNFα、CD95／Fas／APO-1、電離輻射、紫外線、熱休克和氧應激)能激活神經(jīng)鞘磷酯酶，迅速地誘發(fā)神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生。鞘磷脂SMase神經(jīng)酰胺磷酸膽堿+鞘磷脂－神經(jīng)酰胺通路介導多種受體和環(huán)境應激在細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導。鞘磷脂酶（SMase）2023/2/562Smase中性Smase(細胞膜上)酸性Smase(溶酶體)ERK通路細胞凋亡促進細胞增殖炎癥反應SAPK/JNK2023/2/5632023/2/564

神經(jīng)酰胺可激活多條信號轉(zhuǎn)導通路，包括SAPK-JNK信號轉(zhuǎn)導通路并改變一些關鍵蛋白，如RB、MYC蛋白等的功能或表達。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB也可因神經(jīng)酰胺的積累而激活。這些通路的激活是通過神經(jīng)酰胺對神經(jīng)酰胺激活的蛋白磷酸酶(CAPP)、神經(jīng)酰胺激活的蛋白激酶(CAPK)、和PKC?的激活而實現(xiàn)。

2023/2/565（1）神經(jīng)酰胺可激活CAPP家族中的絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A家族，這些磷酸酶參與神經(jīng)酰胺的某些細胞反應的信號轉(zhuǎn)導。（2）CAPK是神經(jīng)酰胺另一個直接的靶分子，是RAS的激酶抑制因子。它的一個底物為RAF-1，后者的磷酸化活性型可使MEK磷酸化，從而誘導MAPK的激活。（3）神經(jīng)酰胺的靶分子可能還包括PKC?、PKCa、RAF和GDP-GTP交換因子VAV等。（4）神經(jīng)酰胺也可直接激活半胱天冬酶一3。神經(jīng)酰胺在TNFa（死亡配體）誘發(fā)細胞凋亡的作用見下圖：2023/2/566神經(jīng)酰胺在TNFa誘發(fā)細胞凋亡的作用2023/2/567四、經(jīng)應激信號觸發(fā)細胞凋亡細胞應激是細胞對環(huán)境因素導致大分子損傷的一種防御反應，目的是對抗傷害、修復損傷、增加對損傷的耐受性，以最終保護細胞和/或通過細胞死亡過程最終除去損傷后不能修復的細胞?；钚匝鮑V電離輻射缺氧滲透壓變化細胞因子炎癥因子冷熱藥物機械作用毒物應激原2023/2/568常見細胞應激的類型（一）熱應激（二）氧化應激

（三）低氧應激（四）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（五）基因毒應激2023/2/569細胞應激包括一系列高度有序的事件啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路進而調(diào)節(jié)靶蛋白的活性，特別是促進轉(zhuǎn)錄因子如AP-1、NF-κB、P53、低氧誘導因子表達（或提高其轉(zhuǎn)錄活性）；多種特異性和非特異性的對細胞具有保護作用的應激蛋白質(zhì)合成：保護細胞免受損傷或修復已有的損傷；若細胞損傷嚴重而修復無望，則誘導細胞調(diào)亡——以細胞的自殺行為保護整體的利益。2023/2/570包括JNK/SAPK、p38、ERK途徑。激活的級聯(lián)反應類似：MAPKKK→MAPKK→MAPK效應：激活轉(zhuǎn)錄因子→保護性蛋白質(zhì)生成→增強細胞對應激原的抵抗力、或介導細胞調(diào)亡的信號轉(zhuǎn)導激活因素:①JNK/SAPK：紫外線、DNA損傷劑、活性氧、高滲狀態(tài)、促炎細胞因子；②P38：高滲狀態(tài)、LPS、細胞因子等；③ERK：多種應激原(一)絲裂原活化的蛋白激酶

(mitogen-activitedproteinkinase,MAPK）2023/2/5712023/2/5722023/2/573磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)：產(chǎn)生:①二酰甘油(DAG)

→PKC，拮抗細胞調(diào)亡；②三磷酸肌醇(IP3)→[Ca2+]i增高（如：炎癥細胞被激活的重要標志）磷脂酶A2(PLA2)：炎癥反應中發(fā)揮重要作用激活因素：TNF、凝血酶、緩激肽(二)激活多種磷脂酶2023/2/5742023/2/575鞘磷脂酶(SMase)：①作用：降解鞘磷脂→生成神經(jīng)酰胺（CM,重要的第二信使）——鞘磷脂-神經(jīng)酰胺通路；②分類：中性SMase：分布于細胞膜上，與ERK通路及促進細胞增殖、炎癥反應的發(fā)生有關；酸性SMase：分布于溶酶體，與SAPK通路和細胞調(diào)亡密切相關；2023/2/5761、誘導因素：紫外線、電離輻射、DNA損傷劑2、激活酶類：DNA活化的蛋白激酶(DNA-activatedproteinkinase,DNA-PK)、毛細血管擴張共濟失調(diào)突變（ATM）激酶3、作用：活化多種轉(zhuǎn)錄因子：P53、c-Jun、c-Fos、c-myc等；使熱休克蛋白90(HSP90)磷酸化。(三)DNA損傷激活的蛋白激酶2023/2/577五、死亡受體觸發(fā)凋亡的信號通路死亡受體介導的細胞凋亡起始于死亡受體與配體的結(jié)合。死亡受體主要是腫瘤壞死因子（TNF）家族成員。其誘導細胞凋亡和誘發(fā)炎癥反應，TNF-R1和Fas(Apo-1,CD95)是死亡受體家族的代表成員，他們的胞質(zhì)部分均含有死亡結(jié)構(gòu)域（DD），負責招募凋亡信號通路中的信號分子。2023/2/5782023/2/579死亡受體家族成員參與死亡受體信號轉(zhuǎn)導的接頭蛋白：死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（deathdomainprotein）TRADD：TNF（腫瘤壞死因子）受體相關死亡結(jié)構(gòu)域蛋白TNF+TNFRI（死亡結(jié)構(gòu)域）+TRADD—細胞凋亡FADD：Fas相關死亡結(jié)構(gòu)域蛋白

FasL+Fas（死亡結(jié)構(gòu)域）+FADD—細胞凋亡RIP：受體相互作用蛋白CRADD：含有死亡結(jié)構(gòu)域的caspase和RIP接頭蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白2023/2/580

以FasL-Fas系統(tǒng)為例Fas（factorassociatedsuicide）：自殺相關因子是廣泛表達于正常細胞和腫瘤細胞膜表面的Ⅰ型受體，其胞漿段內(nèi)含有死亡結(jié)構(gòu)域（deathdomain，DD）及阻抑結(jié)構(gòu)域（suppresivedomain，SD）。Fas的阻抑結(jié)構(gòu)域被Fas結(jié)合磷酸酶-1（FAP-1）結(jié)合后可抑制Fas的誘導凋亡作用。2.FasL（fasLigand）：Fas的配體主要表達于T效應淋巴細胞和腫瘤細胞中，是呈現(xiàn)于膜表面的Ⅱ型受體。Fas和FasL都是以純?nèi)垠w形成存在。2023/2/5812023/2/5822023/2/583細胞內(nèi)Ca2+的升高可通過生成活性氧和活性氮離子等下游環(huán)節(jié)而破壞細胞的能量內(nèi)穩(wěn)狀態(tài)而導致細胞死亡。六、鈣過荷誘發(fā)的細胞凋亡線粒體Ca2+積聚將損害氧化磷酸化作用，并通過電子傳遞鏈促進活性氧離子如超氧化物(02-)、過氧化氫(H202)的生成。高線粒體Ca2+也改變線粒體膜的通透性，抑制ATP的生成和促進壞死。2023/2/584Ca2+激活的磷酸酶，鈣神經(jīng)蛋白(calcineurin)可誘導細胞凋亡，可導致BAD去磷酸化，引起它轉(zhuǎn)移至線粒體從而促進Bad與BCL-X形成二聚體。在海馬神經(jīng)元中，L-谷氨酸通過NMDA受體誘發(fā)Ca2+內(nèi)流并激活鈣神經(jīng)蛋白，從而觸發(fā)BAD的線粒體定位和細胞凋亡。此外，線粒體選擇性細胞色素c(Cytc)通透將激活半胱天冬酶，進而促進細胞凋亡。Ca2+還可直接激活一些細胞的酶從啟動細胞毒級聯(lián)反應。2023/2/585

正常時線粒體外膜的通透性一般只允許<5KD的小分子和離子進出，當受某些因素作用破壞了線粒體外膜的這種屏障性通透，引起膜間腔內(nèi)儲存的凋亡因子釋放入胞漿內(nèi)，立即啟動凋亡反應。膜間腔內(nèi)的凋亡因子有：CytC,凋亡誘導因子（AIF）,第二個Caspase的線粒體激活因子（Smac）,Pro-caspase-2,-3,-7,-9和Hsp-10,Hsp-60等。

七、線粒體觸發(fā)的細胞凋亡及其對死亡信號的整合2023/2/586線粒體外膜通透性增高胞質(zhì)中出現(xiàn)CytC與細胞漿中成分作用激活caspases誘導細胞凋亡的發(fā)生如染色質(zhì)濃縮和核碎裂2023/2/587影響線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變的因素1、BcL-2族的促凋亡亞族成員（1）Bad：在生長因子存在下，可通過磷脂酰肌醇-3-激酶（PI-3-K）和PKA促使Bad的Ser112，136磷酸化而抑制其促凋亡活性。在去除生長因子時，則Bad被去磷酸化而與Bcl-2或Bcl-XL二聚化，破壞線粒體外膜通透性釋放出凋亡分子而導致細胞凋亡。（2）Bid：本來存在于胞漿內(nèi)，當被Caspase8催化分裂成N端11kD和C端15kD二個片段，后者即轉(zhuǎn)位線粒體破壞其外膜通透性而導致凋亡放大作用。（3）Bim：本是結(jié)合在胞漿微管復合體，當受到凋亡刺激時轉(zhuǎn)位到線粒體，中和Bcl-2（或Bcl-XL）而導致凋亡。2023/2/588細胞內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]i）升高可激活胞漿內(nèi)的鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin），后者促使Bad去磷酸化激活導致細胞凋亡。2、[Ca2+]i升高：PKC-δ與其它的PKC成員（PKC-γ，PKC-β）的功能不同。它一方面可直接作用改變線粒體膜的通透性導致凋亡，另一方面PKC-δ是Caspase3的靶底物，Caspase3可催化PKC-δ部分蛋白分解而增強激活，后者磷酸化并分解核膜的層連蛋白（Lamin）導致核膜破裂。故最近又將PKC-δ稱為凋亡層連蛋白激酶（apoptoticlaminkinase）。3、蛋白激酶C-δ（PKC-δ）：

在線粒體老化時，其呼吸鏈電子傳遞受損，產(chǎn)生活性氧（ROS）增多，破壞線粒體跨膜壓（ΔΨm），增大線粒體膜通透性導致細胞凋亡。4、線粒體老化2023/2/5892023/2/5902023/2/591八、MYC與細胞凋亡

MYC是具有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，它同它的分子伴侶MAX結(jié)合后，可誘導處于低濃度生長因子環(huán)境中的細胞發(fā)生凋亡。細胞在生長環(huán)境中促進生長的因子不足這種應激條件下的細胞凋亡與MYC基因的表達有關。九、細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導特點：多樣性、耦聯(lián)性、同一性、多途性2、凋亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)（1）胞內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng)（2）cAMP/PKA信號系統(tǒng)（3）Fas蛋白/Fas配體信號系統(tǒng)（4）神經(jīng)酰胺信號系統(tǒng)（5）二酰甘油/PKC信號系統(tǒng)（6）酪氨酸蛋白激酶(PTK)信號系統(tǒng)APOPTOSIS腺苷酸環(huán)化酶←鈣調(diào)素←Ca2+↓↓cAMP↑谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶↓↓

PKA↑轉(zhuǎn)錄因子FasFasL神經(jīng)酰胺↓

SPP↑↓AP-1↑↓S期(抗凋)caspase↑↓H1組蛋白CKCK-RMAPK↑MAPKK↑Raf-1↑Ras↑PTK↑↓分化×PKC↑二酰甘油Tc-R糖皮質(zhì)激素①②③④⑤⑥2023/2/59394第四節(jié)細胞的非凋亡性死亡2023/2/5

線粒體除可觸發(fā)細胞凋亡外，還可誘發(fā)細胞的非凋亡性死亡。一般說來有3種機制與之有關：1、電子傳遞和能量代謝受損

γ射線和神經(jīng)酰胺誘發(fā)細胞凋亡時還在電子傳遞鏈的細胞色素b-c1與細胞色素c步驟引起破壞；FASL作用下的細胞也可發(fā)生細胞色素c的功能損害。并由此而發(fā)生的ATP產(chǎn)生下降。2023/2/5952、活性氧離子(ROS)和細胞氧化還原(redox)許多刺激引起凋亡過程中有超氧化物和脂質(zhì)過氧化物的增加，但它發(fā)生在半胱天冬酶激活之后。細胞色素。的釋出也可導致線粒體ROS生成增加和ATP生成減少。3、線粒體外膜破損

線粒體滲透性轉(zhuǎn)換小孔開放將導致線粒體基質(zhì)和線粒體內(nèi)外膜間隙中，發(fā)生離子平衡而使內(nèi)膜兩側(cè)H+梯度消失，還將導致因基質(zhì)高滲而引起的線粒體容積失調(diào)，最終引起外膜破損。96第五節(jié)細胞凋亡的生物學特征及其檢測2023/2/5一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡

（1）未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

（2）染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。2023/2/5972、

熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。

常用的DNA特異性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2-5mg/ml。

DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5-1mg/ml。2023/2/598

3、

透射電子顯微鏡觀察

結(jié)果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。2023/2/5992023/2/5100二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35-36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。2023/2/51012023/2/51022023/2/5103三、線粒體膜勢能的檢測

線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位DYmt的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。

線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine123、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6（3）]、