遺傳毒物與細(xì)胞死亡

第七章遺傳毒物與細(xì)胞死亡12023/2/5第一節(jié)細(xì)胞凋亡與非凋亡性死亡第二節(jié)細(xì)胞凋亡概論第三節(jié)遺傳毒物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號及其轉(zhuǎn)導(dǎo)通路第四節(jié)細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)控機(jī)制第五節(jié)細(xì)胞的非凋亡性死亡第六節(jié)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征及其檢測22023/2/5第一節(jié)細(xì)胞凋亡與非凋亡性死亡3細(xì)胞死亡是生物界普遍存在的現(xiàn)象，不同于機(jī)體死亡。正常組織中，每天都有千千萬萬個(gè)細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡的方式通常有2種：細(xì)胞壞死（necrosis）細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）2023/2/52023/2/541、細(xì)胞壞死（necrosis）概念：細(xì)胞壞死是由于有害刺激或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的嚴(yán)重紊亂導(dǎo)致細(xì)胞急劇死亡。主要形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞發(fā)生腫脹，最后導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和溶解，細(xì)胞內(nèi)前炎癥因子等內(nèi)容物釋放，引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞壞死現(xiàn)象與人類多種疾病相關(guān)。如病毒感染引起的急性重型肝細(xì)胞壞死，青光眼導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死，造成視力逐漸減弱，最終導(dǎo)致失明。52、細(xì)胞凋亡（apoptosis）細(xì)胞凋亡(apoptosis)也稱細(xì)胞程序性死亡(programmedcelldeath，PCD)則是由于細(xì)胞內(nèi)外因子誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)一個(gè)特殊的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)生的有序死亡。誘發(fā)因素：體外因素，細(xì)胞處于不利生長環(huán)境，如溫度、pH、射線、藥物和病毒感染等；體內(nèi)因素，如腫瘤、自身免疫病和退行性病變等；生理因素：胚胎發(fā)育和變態(tài)過程也可產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。形態(tài)特征：細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮和出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞膜完整、無前炎癥因子等細(xì)胞內(nèi)容物流出，無炎癥反應(yīng)。2023/2/5ApoptosisversusNecrosis2023/2/567特征細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死定義

在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，核碎裂、胞漿生芽和形成凋亡小體為病理性襲擊的結(jié)果，質(zhì)膜的完整性突然消失、膜電化學(xué)梯度消失和細(xì)胞內(nèi)容物釋出誘發(fā)刺激生理性或病理性病理性形態(tài)表現(xiàn)成泡有（細(xì)胞器呈泡狀）有（無細(xì)胞器呈泡狀）質(zhì)膜完整性保持破損細(xì)胞大小縮小——細(xì)胞皺縮和形成凋亡小體增大——細(xì)胞腫脹并溶解炎癥反應(yīng)無有細(xì)胞內(nèi)容釋出不是生化表現(xiàn)大分子（蛋白質(zhì)）合成有些情況下必需非必需基因表達(dá)

有些情況下必需非隨機(jī)裂解為50、300kb，隨后再裂非必需

DNA裂解

解為180bp為倍數(shù)的碎片（大小由涉及的核小體數(shù)決定）隨機(jī)裂解

調(diào)控高度受控不受調(diào)控半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)必需非必需

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的比較2023/2/52023/2/583、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義細(xì)胞凋亡的生理意義：細(xì)胞凋亡對于保證個(gè)體正常發(fā)育、維持正常生理功能，并使機(jī)體適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化具有重要的生理意義。細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的主動過程，典型的細(xì)胞凋亡過程涉及一系列半胱天冬蛋白酶（caspase）的水解、活化和信號傳遞過程。在發(fā)育過程中清除多余的細(xì)胞清除已完成功能的細(xì)胞

清除發(fā)育不正常的細(xì)胞清除正常生理活動過程中無用的細(xì)胞清除病理活動中有潛在危險(xiǎn)的細(xì)胞2023/2/592023/2/5104、細(xì)胞凋亡的病理意義細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)失控或錯(cuò)誤將會引起生物體的發(fā)育異常、功能紊亂和嚴(yán)重疾病。與細(xì)胞凋亡相關(guān)的疾病如濾泡性淋巴瘤、乳腺癌和白血病等惡性腫瘤，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎炎等自身免疫性疾病，腺病毒和皰疹病毒感染的疾病等，均與細(xì)胞凋亡缺陷（“該死不死”）有關(guān)；而阿爾茨海默病、帕金森氏病和小腦退化癥等神經(jīng)退行性疾病、骨髓發(fā)育不全性疾病、缺血性損傷和酒精中毒性肝炎等則與細(xì)胞凋亡過度（“不該死的死了”）有關(guān)。第二節(jié)細(xì)胞凋亡概論凋亡過程的執(zhí)行器(executor)為細(xì)胞中的蛋白酶，不論何種因素誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，雖其具體的信號通路有別，但最終無例外都是激發(fā)以蛋白酶組成的級聯(lián)反應(yīng)這個(gè)中心環(huán)節(jié)。2023/2/511接受凋亡信號凋亡的級聯(lián)反應(yīng)凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化12半胱天冬酶Caspase(Cysteinylaspartate-specificprotease)：在特異的天冬氨酸之后切割靶蛋白的一類進(jìn)化上保守的半胱氨酸蛋白酶。一、半胱天冬酶（Caspase）是凋亡的執(zhí)行者半胱天冬酶家族有十余個(gè)成員，是凋亡過程中最重要的影響因素之一，但不同成員在凋亡中起的作用不全相同。2023/2/5131、Caspase通常以酶原（Procaspase）形式存在，相對分子質(zhì)量為29-49kD。2、酶原N末端具有一個(gè)前功能域（Prodomain）、一個(gè)大亞單位（約20kD）和一個(gè)C末端小亞單位（約10kD）。3、在大、小亞單位保守的QACXG基序（motif）中有半胱氨酸活性部位（X=R、Q或G），其中C是必需的。前功能域與大亞單位由一天冬氨酸裂解部位分開，大、小亞單位由接頭隔開，接頭位于大、小亞單位的含有一或兩個(gè)天冬氨酸裂解部位的功能域之間。4、活性形式為雜四聚體（p17-20）2（p10-12）2二、Caspase家族特征2023/2/5根據(jù)在細(xì)胞凋亡中起的作用，Caspases分為兩大類：啟始Caspase(Initiator)和效應(yīng)Caspase(Effector)1）啟始Caspases包括-2，-8，-9，-10等，對細(xì)胞凋亡的刺激信號作出反應(yīng)，啟動細(xì)胞的凋亡過程；2）效應(yīng)Caspases包括-3，-6，-7等，是在細(xì)胞凋亡過程中的具體執(zhí)行者，完成對特定蛋白底物的水解。半胱天冬酶的功能取決于半胱天冬酶的底物特異性、前功能域的長度和序列。三、Caspases的分類2023/2/515哺乳類細(xì)胞內(nèi)的Caspases的一級結(jié)構(gòu)2023/2/516按催化特異性分：組別催化感應(yīng)序列成員活性中心前區(qū)域特異催化位點(diǎn)I

WEHDCaspase-1Caspase-4Caspase-5QACRGQACRGQACRGP12P12P12WEHD↓(WL)EHD↓(WL)EHD↓II

DEXDCaspase-2Caspase-3Caspase-7QACRGQACRGQACRGP17P2P2DEHD↓DEVD↓DEVD↓III

(I/V/L)EXDCaspase-8Caspase-9Caspase-10Caspase-6QACRGQACGGQACQGQACRGP27P19P27P2IETD↓LEHD↓LE(N/L/E)D↓VEHD2023/2/517

Caspase活化機(jī)制：

Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，雖然分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，并進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體。

四、Caspase激活的方式2023/2/5182023/2/519半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)1、啟始Caspase激活（同源激活）的兩種典型方式：（1）Caspase-8的激活(Caspases-2,-10)? 死亡受體（Fas或TNFR）與死亡配體（FasL或TNF）結(jié)合后，死亡受體三聚體化。? 通過死亡結(jié)構(gòu)域DD（Deathdomain）的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，死亡受體與接頭蛋白的DD結(jié)合Fas結(jié)合蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain）結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物DISC（Death-inducingsignallingcomplex）。? 通過FADD的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED(Deatheffectordomain)，Procaspase-8被募集在DISC上。? 聚集后的Procaspase-8，通過自身或相互之間的切割產(chǎn)生成熟的Caspase-8。2023/2/520Procaspase-8的激活過程2023/2/521（2）Caspase-9的激活細(xì)胞色素c（Cytochromec）從線粒體釋放。通過凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1(Apoptoticproteaseactivatingfactor-1)的WD40結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞色素c和Apaf-1結(jié)合。通過Apaf-1的半胱天冬酶募集功能域CARD（Caspaseactivationandrecruitmentdomain）結(jié)構(gòu)域，Apaf-1形成七聚體。通過各自的CARD結(jié)構(gòu)域，Procaspase-9被募集到細(xì)胞色素c/dATP/Apaf-1組成的凋亡復(fù)合體（Apoptosome）而水解激活。2、效應(yīng)Caspase的激活（異源激活）效應(yīng)Caspases不象啟始Caspases，不能被募集到或結(jié)合到DISC或凋亡復(fù)合體上，它們必須依賴啟始Caspases才能活化。2023/2/522Caspase-9的激活過程2023/2/52324

底物類別預(yù)計(jì)功能底物舉例促一和抗凋亡蛋白

信號放大抑制因子激活作用

前一半胱天冬酶，BCL-2，BCL-XL，BID，P28Bap31凋亡機(jī)器成員

誘發(fā)凋亡表型半胱天冬酶激活脫氧核糖核酸酶抑制因子(ICAD)、肌動蛋白、膠溶蛋白(gelsolin)、P21激活的激酶-2(PAK2)，絲裂原激活的蛋白激酶-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的激酶-1(MEKKl)、蛋白激酶Cδ(PKCδ)結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)合分子細(xì)胞完整性解體

細(xì)胞包裝

核纖層蛋白、核有絲分裂器蛋白(nuclearmitoticapparatusprotein)、支架附著因子-A(scaffoldattachmentfactor-A)、胞襯蛋白(fodrin)、Gas2[生成停頓特異基因-2(growtharrestspecificgene-2)編碼蛋白]、角蛋白、肌動蛋白、rabaptin-5，p-連環(huán)蛋白，黏著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)穩(wěn)態(tài)蛋白破壞大分子合成和細(xì)胞修復(fù)機(jī)制DNA-依存性蛋白激酶酶促亞單位(DNAdependentproteinkinase

catalyticsubunitDNA-PKcs)、多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly(ADP-ri-bose)polymerase，PARP、U1-70-kDa蛋白、復(fù)制因子C(replicationfactorC，RFC-140)、不均一核核糖核蛋白(HnRNP)、D4-GDP解離抑制因子(GDPdissociationinhibitor，GDI)、轉(zhuǎn)錄因子終止存活信號

其他

不明？凋亡誘導(dǎo)Huntingtin蛋白、早老蛋白(presenilin)、萎縮索-1（atrophin-1），ataxin-3，胞漿磷脂酶A2五、Caspases的底物2023/2/52023/2/525半胱天冬酶是凋亡執(zhí)行器的中心組成成分2023/2/526第三節(jié)遺傳毒物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號及其轉(zhuǎn)導(dǎo)通路一、P53蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡二、經(jīng)第二信使神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡三、經(jīng)應(yīng)激信號觸發(fā)的細(xì)胞凋亡四、經(jīng)死亡受體觸發(fā)凋亡的信號通路五、鈣過荷誘發(fā)的細(xì)胞凋亡六、線粒體觸發(fā)細(xì)胞凋亡及其對死亡信號整合作用七、MYC與細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞凋亡bax,bcl-xsbcl-2,bcl-xl野生型p53突變型p53FAS/Apo-1IAP（survivin）caspaseC-myc細(xì)胞凋亡是一個(gè)多基因調(diào)控的過程1、細(xì)胞凋亡過程表達(dá)的基因，多數(shù)抑癌基因；2、促細(xì)胞凋亡基因，多數(shù)抑癌基因；3、抑制細(xì)胞凋亡基因，多數(shù)癌基因。

一、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因2023/2/5271、Bcl-2家族（Bcelllymphoma/leukemia-2）B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2)Bc1-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延長細(xì)胞的生存，能抑制細(xì)胞凋亡,而不是促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

Bcl-2家族已發(fā)現(xiàn)15個(gè)成員，所有Bcl-2家族成員均含有1個(gè)或多個(gè)保守功能區(qū)（BH結(jié)構(gòu)域）。蛋白含有4個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域，依次命名為BHl、BH2、BH3和BH4。可分為3個(gè)亞族：2023/2/5282023/2/529Bcl-2亞家族：Bcl-2Bcl-xlBcl-w、Mcl-1、A1

Bcl-2亞家族成員對細(xì)胞凋亡起抑制作用。

Bax亞家族：Bax、Bak、Bok，它們的作用與Bcl-2亞家族的作用相反，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

BH3亞家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；僅有BH3結(jié)構(gòu)域。它們的作用也與Bcl-2亞家族的作用相反，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

作用機(jī)制：影響凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1的功能影響線粒體的結(jié)構(gòu)與功能2023/2/530Bcl-2蛋白家族成員概況家族成員氨基酸數(shù)目與Bcl-2同源性分子量C-疏水端調(diào)節(jié)凋亡Bcl-2，H239m23626有抑制Bcl-XLH233m2414426有抑制Bcl-XsH178m17018有促進(jìn)Baxh1922121有促進(jìn)BakH216/m2112823,4無促進(jìn)BadM204*22,1無促進(jìn)AIM17240*20無抑制Mcl-1H35035△37有抑制Ced-9C2782332有抑制BHRF-1v1912222有抑制LMW5-HLv1782620無抑制EIB19Kv176☆19無抑制2023/2/531Bcl-2蛋白家族成員的相互作用與細(xì)胞凋亡的關(guān)系2023/2/532家族成員可能存在的聚合體形式抑制凋亡bcl-2bcl-2/bcl-2bax/bcl-2bcl-XLbcl-XL/bcl-XLbcl-2/bcl-XLMcl-1Mcl-1//bcl-XLMcl-1/bcl-2baxBax/baxbax/bax-XL促進(jìn)凋亡bcl-XsBcl-Xs/bcl-2bcl-Xs/bcl-XLbadBad/bcl-2bad/bcl-XLbakBak/bcl-XL2023/2/5332023/2/5342、電壓依賴性陰離子通道

（VDAC)和腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶(ANT)

是線粒體外膜上最為豐富的兩種蛋白。最近有一些研究工作表明，WDAC和ANT可與Bc1-2家族蛋白相互作用，在細(xì)胞凋亡過程中介導(dǎo)對線粒體的損傷。VDAC本身是一種通道蛋白，它與Bax的結(jié)合可使共通道性能發(fā)生某種變化，這樣一些凋亡蛋白如cytC就可通過。因?yàn)檫@兩種蛋白在跨越線粒體膜的核苷酸和小分子轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用，所以它們與Bax的結(jié)合可能與細(xì)胞凋亡過程中線粒體ATP/ADP轉(zhuǎn)化和磷酸肌酸外運(yùn)的抑制有關(guān)。2023/2/5352023/2/5363、P53與細(xì)胞凋亡

P53是腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。P53基因是人類腫瘤有關(guān)基因中突變頻率最高的基因。在依賴P53蛋白的細(xì)胞凋亡中，P53基因是通過調(diào)節(jié)Bc1-2和Bax基因的表達(dá)來影響細(xì)胞凋亡的。P53蛋白能特異地抑制Bc1-2的表達(dá)，相反對Bax的表達(dá)則有明顯的促進(jìn)作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的轉(zhuǎn)錄活化因子。在這些細(xì)胞中，P53蛋白的積累和活動引起了細(xì)胞凋亡。2023/2/5374、IAP（inhibitorofapoptosis，細(xì)胞凋亡抑制因子）

IAP超家族的成員較多，如c-IAP1,c-IAP2,XIAP,NIAP和Survivin，新的成員在不斷的被發(fā)現(xiàn)。IAP家族成員有一個(gè)共同的特征，含有一個(gè)或多個(gè)由70個(gè)氨基酸的重復(fù)序列（BIR），類似于鋅指狀的結(jié)構(gòu)。c-IAP1、c-IAP2和XIAP含有環(huán)指狀結(jié)構(gòu)。BIR功能域和之間的連接區(qū)域介導(dǎo)對caspase的抑制作用，而環(huán)指狀結(jié)構(gòu)則具有泛素化蛋白連接酶的作用，介導(dǎo)caspase-３和-７的泛素化降解作用。2023/2/5382023/2/5395、Smac/Dablo

在細(xì)胞凋亡過程中它可以從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。成熟的Smac蛋白產(chǎn)生一個(gè)新的N基端,這個(gè)N基端的前面4個(gè)氨基酸可以與lAP的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合。Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結(jié)合。Smac與BIR2的結(jié)合可以中和XlAP對胱解酶9的抑制，促進(jìn)凋亡。2023/2/5402023/2/5416、白介素-1?轉(zhuǎn)換酶（interlukin1-?-convertingenzyme，ICE），與線蟲細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Ced-3有較高的同源性，具有直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。7、Fas為死亡受體，F(xiàn)as-L是T淋巴細(xì)胞產(chǎn)物，F(xiàn)as和Fas-L結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2023/2/5422023/2/5438、癌基因c-myc是調(diào)控細(xì)胞周期的主要基因。研究表明，c-myc在哺乳動物的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，它的過度表達(dá)既可使細(xì)胞周期變短、分裂增加，也可使細(xì)胞凋亡，這主要取決于能否獲得關(guān)鍵的生長因子。Cleveland認(rèn)為，抑癌因素存在時(shí)，c-myc促進(jìn)凋亡，而有致癌因素時(shí)，c-myc促進(jìn)增殖。Bax為Bcl-2基因家族成員，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

PTEN（phosphataseandtensinhomologdeletedfromchromosome10）是隨P53以后呈現(xiàn)最高突變率的抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物，它主要催化PI-3，4，5-P3的肌醇3位上去磷酸形成PI-4，5-P2，拮抗PI-3Kinase－PKB/Akt信號通路的抗凋亡作用。因?yàn)镻KB具有磷酸化抑制Caspase9、Bad的活性和抑制細(xì)胞色素C的釋放與Fas介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及通過FKHR間接抑制某些凋亡因子基因表達(dá)等作用，因此具有很強(qiáng)的抗凋亡作用。9、張力蛋白同源磷酸酯酶（PTEN）2023/2/544PI-4,5-PI2PI-3,4,5-P3PDKPKBPKBPTENpPI3-KpT308S470-PCytCBad-s112-pCaspase-9-s196-pFKHR-s256-pFasdenpendentapoptosisApoptosis張力蛋白同源磷酸酯酶（PTEN）的促細(xì)胞凋亡機(jī)制2023/2/545

病毒在感染宿主細(xì)胞后進(jìn)行病毒分泌(virocrine),分泌的病毒因子中有些同源于細(xì)胞生長因子、生長因子受體或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，促進(jìn)宿主細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化，有些是阻止宿主細(xì)胞的凋亡防御，保護(hù)病毒的生存和免被消滅和清除。

（1）CrmA（cytokineresponsemodifierA，細(xì)胞因子反應(yīng)修飾因子A）。這是牛痘病毒分泌的一種蛋白質(zhì)因子，分子量38KD，它具有抑制Caspase3和顆粒酶B（GranzymeB）活性而起到抗凋亡作用。 10、病毒因子2023/2/546（2）P35:這是由桿狀病毒分泌的一種病毒因子，分子量35KD，其分子結(jié)構(gòu)與BcL-2部分同源，故具有抑制凋亡的作用。（3）EIB55KD和EIB19KD:均是腺病毒分泌的病毒因子，二者可分別結(jié)合P53和FLASH而抑制細(xì)胞凋亡。FLASH是最近報(bào)道的Pro-caspase-8結(jié)合FADD的竟?fàn)幮砸种品肿?，故有抑制Fas介導(dǎo)的凋亡作用）。2023/2/547二、P53蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡1．P53基因

P53并非為所有細(xì)胞的凋亡過程所必需，但對DNA損傷而誘發(fā)的細(xì)胞凋亡卻是必不可少的。（1）P53的兩大功能：

使細(xì)胞在G1期停滯。當(dāng)DNA由于各種原因損傷后，P53首先誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G1期，抑制細(xì)胞增殖，直至損傷的DNA修復(fù)。

一旦DNA不能被修復(fù)，P53就會活化那些誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。例如在P53缺乏的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達(dá)增高伴隨Bax表達(dá)降低。2023/2/548P53GADD45結(jié)合PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）結(jié)合RPA（復(fù)制蛋白A）TNFFas從儲存處釋放出FasFasLDR5BaxBcl-2P21阻止DNA修復(fù)和復(fù)制細(xì)胞凋亡阻止細(xì)胞周期在G1期2023/2/549（2）野生型P53和突變型P53對細(xì)胞凋亡的作用：野生型P53對細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，突變型P53對細(xì)胞凋亡有抑制作用。目前認(rèn)為野生型P53抑制Bcl-2基因的表達(dá)，促進(jìn)Bax基因的表達(dá)。而突變型P53仍保留對Bcl-2的負(fù)調(diào)控，而它自身又成為細(xì)胞凋亡的抑制者。因而，P53在調(diào)節(jié)Bcl-2依賴的細(xì)胞死亡/生存途徑中發(fā)揮重要作用。2023/2/550p53的功能 野生型和突變型P53對細(xì)胞凋亡的作用2023/2/551P53與細(xì)胞凋亡

2023/2/552p53andcellularstress–inducedapoptosis各種應(yīng)激刺激如細(xì)胞毒藥物，-射線,熱休克，組織缺氧，DNA損傷劑可穩(wěn)定抑腫瘤蛋白P53，P53促進(jìn)細(xì)胞周期捕獲和修復(fù)DNA或促使細(xì)胞凋亡以清除損傷細(xì)胞。但是，P53怎樣選擇G1期捕獲或者凋亡還不太清楚。P53的脯氨酸富集區(qū)(殘基64-92)

和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(殘基43-63)

被認(rèn)為是介導(dǎo)凋亡所必須，因?yàn)槿コ@兩個(gè)區(qū)域會導(dǎo)致凋亡活性的丟失。2023/2/553另一方面，磷酸化和甲基化對調(diào)節(jié)P53的生物學(xué)活性起著重要作用。雖然具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，但很可能在調(diào)節(jié)P53和其負(fù)調(diào)節(jié)子Mdm2的結(jié)合方面發(fā)揮作用。另一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制涉及JNK和P53的結(jié)合，從而介導(dǎo)泛素化（ubiquitination）與P53蛋白水解切除。Rb蛋白能阻止P53的凋亡作用。Rb和Mdm2這兩個(gè)P53抑制子在凋亡過程中均被切割，提示是程序性細(xì)胞死亡的正自我調(diào)節(jié)以及與關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子的密切聯(lián)系。2023/2/554雖然P53的作用機(jī)制尚不完全清楚，但有一點(diǎn)很清楚，P53的轉(zhuǎn)錄激活功能是其生物學(xué)作用的重要組成部分。許多P53的靶基因及其功能已被確證。依賴于P53的細(xì)胞周期捕獲需要P21Waf1,GADD45,和cyclinG的轉(zhuǎn)錄激活。

促凋亡的P53靶蛋白包括Bax,PIGgenes,CD95,DR5(areceptorforthedeathligandTRAIL),IGF-BP3,Rpr(inDrosophila),Cdc42(aRas-likeGTPase),Noxa(aBcl-2familyprotein),和P53AIP1。2023/2/555NuclearandCytoplasmicRolesofp53inApoptosis2023/2/556P53誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制已被廣泛地研究,涉及mitochondrial

Apaf-1/caspase-9途徑,死亡受體信號,和下游caspases的激活。例如,表達(dá)突變P53的細(xì)胞不能誘導(dǎo)CD95,對藥物誘導(dǎo)的凋亡敏感性降低。P53能幫助CD95從Golgi轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，導(dǎo)致死亡受體的集合。但是，在某些情況下，CD95不是P53誘導(dǎo)凋亡所必須，P53依賴的CD95上調(diào)并不是每次都能誘導(dǎo)凋亡。2023/2/557另一條P53凋亡信號通路是通過活性氧離子（ROS），影響線粒體膜功能，但并不涉及cytochromeC的釋放。特別是P53誘導(dǎo)的基因PIG3與NADPH-quinone氧化還原酶具有同源性，產(chǎn)生ROS。當(dāng)獨(dú)自過表達(dá)時(shí)，PIG3不能激發(fā)凋亡，提示其他的信號在同時(shí)起作用。最近的研究顯示P53自身能在E1A/ras-transformed的纖維原細(xì)胞而不是正常纖維原細(xì)胞的提取物中誘導(dǎo)caspase激活,并且不依賴Bax或cytochromeC的轉(zhuǎn)錄或存在。2023/2/558P53也能與c-myc作用，影響c-myc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。另一P53促進(jìn)凋亡的機(jī)制是通過激活Ras-相似的GTPaseCdc42，激活JNK-1誘導(dǎo)的Bcl-2磷酸化。總之，P53介導(dǎo)或涉及P53的凋亡包括一系列不同分子和通路的平行或連續(xù)激活，最終導(dǎo)致完全的死亡反應(yīng)。2023/2/5592、P53基因家族的其他成員（1）P73基因是P53基因家族發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)新成員。P73是P53基因家族的成員。P73基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、惡性黑色素瘤、肝細(xì)胞癌、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生缺失的頻率極高。（2）P51基因是P53基因家族發(fā)現(xiàn)的又一新成員。P51在正常組織的表達(dá)遠(yuǎn)低于P53的水平，同時(shí)表現(xiàn)出組織特異性。2023/2/5602023/2/561三、第二信使神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡許多激動劑和應(yīng)激信號（凋亡誘導(dǎo)因子）可誘發(fā)鞘磷脂(SM)的水解及(或)其他鞘脂代謝改變而發(fā)生神經(jīng)酰胺的積聚。細(xì)胞外應(yīng)激因子激活酸性神經(jīng)鞘磷酯酶(A-smaSe)，催化細(xì)胞膜上的神經(jīng)鞘磷酯產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺將信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶分子，啟動凋亡。一些細(xì)胞因子和環(huán)境應(yīng)激因子(包括TNFα、CD95／Fas／APO-1、電離輻射、紫外線、熱休克和氧應(yīng)激)能激活神經(jīng)鞘磷酯酶，迅速地誘發(fā)神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生。鞘磷脂SMase神經(jīng)酰胺磷酸膽堿+鞘磷脂－神經(jīng)酰胺通路介導(dǎo)多種受體和環(huán)境應(yīng)激在細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。鞘磷脂酶（SMase）2023/2/562Smase中性Smase(細(xì)胞膜上)酸性Smase(溶酶體)ERK通路細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞增殖炎癥反應(yīng)SAPK/JNK2023/2/5632023/2/564

神經(jīng)酰胺可激活多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括SAPK-JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并改變一些關(guān)鍵蛋白，如RB、MYC蛋白等的功能或表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB也可因神經(jīng)酰胺的積累而激活。這些通路的激活是通過神經(jīng)酰胺對神經(jīng)酰胺激活的蛋白磷酸酶(CAPP)、神經(jīng)酰胺激活的蛋白激酶(CAPK)、和PKC?的激活而實(shí)現(xiàn)。

2023/2/565（1）神經(jīng)酰胺可激活CAPP家族中的絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A家族，這些磷酸酶參與神經(jīng)酰胺的某些細(xì)胞反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。（2）CAPK是神經(jīng)酰胺另一個(gè)直接的靶分子，是RAS的激酶抑制因子。它的一個(gè)底物為RAF-1，后者的磷酸化活性型可使MEK磷酸化，從而誘導(dǎo)MAPK的激活。（3）神經(jīng)酰胺的靶分子可能還包括PKC?、PKCa、RAF和GDP-GTP交換因子VAV等。（4）神經(jīng)酰胺也可直接激活半胱天冬酶一3。神經(jīng)酰胺在TNFa（死亡配體）誘發(fā)細(xì)胞凋亡的作用見下圖：2023/2/566神經(jīng)酰胺在TNFa誘發(fā)細(xì)胞凋亡的作用2023/2/567四、經(jīng)應(yīng)激信號觸發(fā)細(xì)胞凋亡細(xì)胞應(yīng)激是細(xì)胞對環(huán)境因素導(dǎo)致大分子損傷的一種防御反應(yīng)，目的是對抗傷害、修復(fù)損傷、增加對損傷的耐受性，以最終保護(hù)細(xì)胞和/或通過細(xì)胞死亡過程最終除去損傷后不能修復(fù)的細(xì)胞?；钚匝鮑V電離輻射缺氧滲透壓變化細(xì)胞因子炎癥因子冷熱藥物機(jī)械作用毒物應(yīng)激原2023/2/568常見細(xì)胞應(yīng)激的類型（一）熱應(yīng)激（二）氧化應(yīng)激

（三）低氧應(yīng)激（四）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（五）基因毒應(yīng)激2023/2/569細(xì)胞應(yīng)激包括一系列高度有序的事件啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)靶蛋白的活性，特別是促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子如AP-1、NF-κB、P53、低氧誘導(dǎo)因子表達(dá)（或提高其轉(zhuǎn)錄活性）；多種特異性和非特異性的對細(xì)胞具有保護(hù)作用的應(yīng)激蛋白質(zhì)合成：保護(hù)細(xì)胞免受損傷或修復(fù)已有的損傷；若細(xì)胞損傷嚴(yán)重而修復(fù)無望，則誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡——以細(xì)胞的自殺行為保護(hù)整體的利益。2023/2/570包括JNK/SAPK、p38、ERK途徑。激活的級聯(lián)反應(yīng)類似：MAPKKK→MAPKK→MAPK效應(yīng)：激活轉(zhuǎn)錄因子→保護(hù)性蛋白質(zhì)生成→增強(qiáng)細(xì)胞對應(yīng)激原的抵抗力、或介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活因素:①JNK/SAPK：紫外線、DNA損傷劑、活性氧、高滲狀態(tài)、促炎細(xì)胞因子；②P38：高滲狀態(tài)、LPS、細(xì)胞因子等；③ERK：多種應(yīng)激原(一)絲裂原活化的蛋白激酶

(mitogen-activitedproteinkinase,MAPK）2023/2/5712023/2/5722023/2/573磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)：產(chǎn)生:①二酰甘油(DAG)

→PKC，拮抗細(xì)胞調(diào)亡；②三磷酸肌醇(IP3)→[Ca2+]i增高（如：炎癥細(xì)胞被激活的重要標(biāo)志）磷脂酶A2(PLA2)：炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用激活因素：TNF、凝血酶、緩激肽(二)激活多種磷脂酶2023/2/5742023/2/575鞘磷脂酶(SMase)：①作用：降解鞘磷脂→生成神經(jīng)酰胺（CM,重要的第二信使）——鞘磷脂-神經(jīng)酰胺通路；②分類：中性SMase：分布于細(xì)胞膜上，與ERK通路及促進(jìn)細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)；酸性SMase：分布于溶酶體，與SAPK通路和細(xì)胞調(diào)亡密切相關(guān)；2023/2/5761、誘導(dǎo)因素：紫外線、電離輻射、DNA損傷劑2、激活酶類：DNA活化的蛋白激酶(DNA-activatedproteinkinase,DNA-PK)、毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)突變（ATM）激酶3、作用：活化多種轉(zhuǎn)錄因子：P53、c-Jun、c-Fos、c-myc等；使熱休克蛋白90(HSP90)磷酸化。(三)DNA損傷激活的蛋白激酶2023/2/577五、死亡受體觸發(fā)凋亡的信號通路死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起始于死亡受體與配體的結(jié)合。死亡受體主要是腫瘤壞死因子（TNF）家族成員。其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和誘發(fā)炎癥反應(yīng)，TNF-R1和Fas(Apo-1,CD95)是死亡受體家族的代表成員，他們的胞質(zhì)部分均含有死亡結(jié)構(gòu)域（DD），負(fù)責(zé)招募凋亡信號通路中的信號分子。2023/2/5782023/2/579死亡受體家族成員參與死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭蛋白：死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（deathdomainprotein）TRADD：TNF（腫瘤壞死因子）受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白TNF+TNFRI（死亡結(jié)構(gòu)域）+TRADD—細(xì)胞凋亡FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白

FasL+Fas（死亡結(jié)構(gòu)域）+FADD—細(xì)胞凋亡RIP：受體相互作用蛋白CRADD：含有死亡結(jié)構(gòu)域的caspase和RIP接頭蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白2023/2/580

以FasL-Fas系統(tǒng)為例Fas（factorassociatedsuicide）：自殺相關(guān)因子是廣泛表達(dá)于正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜表面的Ⅰ型受體，其胞漿段內(nèi)含有死亡結(jié)構(gòu)域（deathdomain，DD）及阻抑結(jié)構(gòu)域（suppresivedomain，SD）。Fas的阻抑結(jié)構(gòu)域被Fas結(jié)合磷酸酶-1（FAP-1）結(jié)合后可抑制Fas的誘導(dǎo)凋亡作用。2.FasL（fasLigand）：Fas的配體主要表達(dá)于T效應(yīng)淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，是呈現(xiàn)于膜表面的Ⅱ型受體。Fas和FasL都是以純?nèi)垠w形成存在。2023/2/5812023/2/5822023/2/583細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高可通過生成活性氧和活性氮離子等下游環(huán)節(jié)而破壞細(xì)胞的能量內(nèi)穩(wěn)狀態(tài)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。六、鈣過荷誘發(fā)的細(xì)胞凋亡線粒體Ca2+積聚將損害氧化磷酸化作用，并通過電子傳遞鏈促進(jìn)活性氧離子如超氧化物(02-)、過氧化氫(H202)的生成。高線粒體Ca2+也改變線粒體膜的通透性，抑制ATP的生成和促進(jìn)壞死。2023/2/584Ca2+激活的磷酸酶，鈣神經(jīng)蛋白(calcineurin)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可導(dǎo)致BAD去磷酸化，引起它轉(zhuǎn)移至線粒體從而促進(jìn)Bad與BCL-X形成二聚體。在海馬神經(jīng)元中，L-谷氨酸通過NMDA受體誘發(fā)Ca2+內(nèi)流并激活鈣神經(jīng)蛋白，從而觸發(fā)BAD的線粒體定位和細(xì)胞凋亡。此外，線粒體選擇性細(xì)胞色素c(Cytc)通透將激活半胱天冬酶，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Ca2+還可直接激活一些細(xì)胞的酶從啟動細(xì)胞毒級聯(lián)反應(yīng)。2023/2/585

正常時(shí)線粒體外膜的通透性一般只允許<5KD的小分子和離子進(jìn)出，當(dāng)受某些因素作用破壞了線粒體外膜的這種屏障性通透，引起膜間腔內(nèi)儲存的凋亡因子釋放入胞漿內(nèi)，立即啟動凋亡反應(yīng)。膜間腔內(nèi)的凋亡因子有：CytC,凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）,第二個(gè)Caspase的線粒體激活因子（Smac）,Pro-caspase-2,-3,-7,-9和Hsp-10,Hsp-60等。

七、線粒體觸發(fā)的細(xì)胞凋亡及其對死亡信號的整合2023/2/586線粒體外膜通透性增高胞質(zhì)中出現(xiàn)CytC與細(xì)胞漿中成分作用激活caspases誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生如染色質(zhì)濃縮和核碎裂2023/2/587影響線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變的因素1、BcL-2族的促凋亡亞族成員（1）Bad：在生長因子存在下，可通過磷脂酰肌醇-3-激酶（PI-3-K）和PKA促使Bad的Ser112，136磷酸化而抑制其促凋亡活性。在去除生長因子時(shí)，則Bad被去磷酸化而與Bcl-2或Bcl-XL二聚化，破壞線粒體外膜通透性釋放出凋亡分子而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。（2）Bid：本來存在于胞漿內(nèi)，當(dāng)被Caspase8催化分裂成N端11kD和C端15kD二個(gè)片段，后者即轉(zhuǎn)位線粒體破壞其外膜通透性而導(dǎo)致凋亡放大作用。（3）Bim：本是結(jié)合在胞漿微管復(fù)合體，當(dāng)受到凋亡刺激時(shí)轉(zhuǎn)位到線粒體，中和Bcl-2（或Bcl-XL）而導(dǎo)致凋亡。2023/2/588細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]i）升高可激活胞漿內(nèi)的鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin），后者促使Bad去磷酸化激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2、[Ca2+]i升高：PKC-δ與其它的PKC成員（PKC-γ，PKC-β）的功能不同。它一方面可直接作用改變線粒體膜的通透性導(dǎo)致凋亡，另一方面PKC-δ是Caspase3的靶底物，Caspase3可催化PKC-δ部分蛋白分解而增強(qiáng)激活，后者磷酸化并分解核膜的層連蛋白（Lamin）導(dǎo)致核膜破裂。故最近又將PKC-δ稱為凋亡層連蛋白激酶（apoptoticlaminkinase）。3、蛋白激酶C-δ（PKC-δ）：

在線粒體老化時(shí)，其呼吸鏈電子傳遞受損，產(chǎn)生活性氧（ROS）增多，破壞線粒體跨膜壓（ΔΨm），增大線粒體膜通透性導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。4、線粒體老化2023/2/5892023/2/5902023/2/591八、MYC與細(xì)胞凋亡

MYC是具有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，它同它的分子伴侶MAX結(jié)合后，可誘導(dǎo)處于低濃度生長因子環(huán)境中的細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞在生長環(huán)境中促進(jìn)生長的因子不足這種應(yīng)激條件下的細(xì)胞凋亡與MYC基因的表達(dá)有關(guān)。九、細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特點(diǎn)：多樣性、耦聯(lián)性、同一性、多途性2、凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（1）胞內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng)（2）cAMP/PKA信號系統(tǒng)（3）Fas蛋白/Fas配體信號系統(tǒng)（4）神經(jīng)酰胺信號系統(tǒng)（5）二酰甘油/PKC信號系統(tǒng)（6）酪氨酸蛋白激酶(PTK)信號系統(tǒng)APOPTOSIS腺苷酸環(huán)化酶←鈣調(diào)素←Ca2+↓↓cAMP↑谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶↓↓

PKA↑轉(zhuǎn)錄因子FasFasL神經(jīng)酰胺↓

SPP↑↓AP-1↑↓S期(抗凋)caspase↑↓H1組蛋白CKCK-RMAPK↑MAPKK↑Raf-1↑Ras↑PTK↑↓分化×PKC↑二酰甘油Tc-R糖皮質(zhì)激素①②③④⑤⑥2023/2/59394第四節(jié)細(xì)胞的非凋亡性死亡2023/2/5

線粒體除可觸發(fā)細(xì)胞凋亡外，還可誘發(fā)細(xì)胞的非凋亡性死亡。一般說來有3種機(jī)制與之有關(guān)：1、電子傳遞和能量代謝受損

γ射線和神經(jīng)酰胺誘發(fā)細(xì)胞凋亡時(shí)還在電子傳遞鏈的細(xì)胞色素b-c1與細(xì)胞色素c步驟引起破壞；FASL作用下的細(xì)胞也可發(fā)生細(xì)胞色素c的功能損害。并由此而發(fā)生的ATP產(chǎn)生下降。2023/2/5952、活性氧離子(ROS)和細(xì)胞氧化還原(redox)許多刺激引起凋亡過程中有超氧化物和脂質(zhì)過氧化物的增加，但它發(fā)生在半胱天冬酶激活之后。細(xì)胞色素。的釋出也可導(dǎo)致線粒體ROS生成增加和ATP生成減少。3、線粒體外膜破損

線粒體滲透性轉(zhuǎn)換小孔開放將導(dǎo)致線粒體基質(zhì)和線粒體內(nèi)外膜間隙中，發(fā)生離子平衡而使內(nèi)膜兩側(cè)H+梯度消失，還將導(dǎo)致因基質(zhì)高滲而引起的線粒體容積失調(diào)，最終引起外膜破損。96第五節(jié)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征及其檢測2023/2/5一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

（1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

（2）染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。2023/2/5972、

熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。

常用的DNA特異性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為2-5mg/ml。

DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5-1mg/ml。2023/2/598

3、

透射電子顯微鏡觀察

結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。2023/2/5992023/2/5100二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35-36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。2023/2/51012023/2/51022023/2/5103三、線粒體膜勢能的檢測

線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位DYmt的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。

線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine123、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6（3）]、