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文檔簡介
第五章常見病原微生物的檢驗(yàn)第一節(jié)禽流感病毒第二節(jié)口蹄疫病毒第三節(jié)炭疽桿菌第四節(jié)布魯氏桿菌第五節(jié)結(jié)核分支桿菌第一節(jié)禽流感病毒
(Avianinfluenzavirus,AIV)一、生物學(xué)特性二、抗原性三、病毒的致病性四、診斷1878年P(guān)erroncito首次報(bào)道意大利雞群暴發(fā)禽流感.禽流感呈廣泛性傳播和全球性分布。高致病性禽流感(HPAI)近幾年連續(xù)爆發(fā),對世界范圍內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)及人類健康造成極大危害。禽流感具有爆發(fā)突然、蔓延迅速、波及面廣等特點(diǎn),人類、豬、家禽、野禽、水禽等均是受害對象。一、生物學(xué)特性
正粘病毒科/甲型流感病毒屬
☆病毒粒子一般為球形,直徑為80~120nm;★外有囊膜,囊膜表面有許多放射狀排列的纖突(Spikes);★纖突分兩類,一類是棒狀,由血凝素(HA)分子的三聚體構(gòu)成;另一類是蘑菇狀,由神經(jīng)氨酸酶(NA)分子的四聚體構(gòu)成。兩種結(jié)構(gòu)在囊膜上的比例約為HA:NA=75:20。核酸型為單股負(fù)股RNA,分8節(jié);8個(gè)獨(dú)立的RNA片段,分別編碼PB1,PB2,PA,HA,NP,NA,M1,M2,NS1,NS2等10種蛋白。透射電鏡下呈圓形,其表面有纖突(×60000)H5N1正在攻擊健康的細(xì)胞:藍(lán)色部分是禽流感病毒,下面的紅色部分則是健康人體細(xì)胞培養(yǎng)特性易在雞胚以及雞和猴的腎組織培養(yǎng)中生長;有些毒株也能在家兔、公牛和人的細(xì)胞中生長。在組織培養(yǎng)中能引起血球吸附,并常產(chǎn)生病變。大多數(shù)毒株能在雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生蝕斑。有些毒株在雞、鴿或人的細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)之后,對雞的毒力減弱。禽流感病毒對外界因素的抵抗力較弱。56℃30min、60℃10min、65-70℃數(shù)分鐘即可滅活病毒。在直射陽光下40至48小時(shí)即可失去活性。對低溫抵抗力較強(qiáng),4℃可存活1個(gè)多月,在有甘油保護(hù)的情況下可保持活力1年以上。抵抗力一)血清型根據(jù)流感病毒的核蛋白(NP)和膜蛋白(MS)抗原性的不同,將其分為A、B、C三個(gè)血清型三型之間的差異可通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等進(jìn)行測定。二、抗原性二)HA和NA是病毒表面的主要糖蛋白;具有種(亞型)的特異性和多變性,根據(jù)病毒HA和NA抗原性的差異,可將其分為不同的亞型。HA和NA在病毒感染過程中起著重要作用。
-HA決定病毒的致病性,能誘發(fā)感染宿主產(chǎn)生具有保護(hù)作用的中和抗體,
-NA誘發(fā)的抗體無中和作用,但可減少病毒增殖和改變病程。二、抗原性迄今已知有16種HA和10種NA據(jù)報(bào)道現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的流感病毒亞型至少有80多種;其中絕大多數(shù)屬非致病性或低致病性;高致病性亞型主要是含H5和H7的毒株基因極易發(fā)生變異HA的基因的突變率最高其次為NA基因AIV基因組極易發(fā)生變異1、基因突變導(dǎo)致流感病毒發(fā)生抗原漂移(antigenicdrift)。因?yàn)榱鞲胁《镜腞NA復(fù)制酶缺乏校正閱讀能力,導(dǎo)致不同毒力毒株出現(xiàn)。
如1983-1984(美國)H5N2,6個(gè)月后成為高致病性,禽類病死率達(dá)90%;1999-2001(意大利)H7N1,9個(gè)月后成為高致病性。2、基因重組是流感病毒發(fā)生抗原轉(zhuǎn)變(antigenicshift)的主要原因。目前,多數(shù)人認(rèn)為抗原轉(zhuǎn)變是以前流行于人和動(dòng)物流感病毒基因片段重組的結(jié)果。(鴨-豬-人-禽)(新亞型出現(xiàn))禽流感病毒變異三、致病性引起各種類型的禽流感(Avianinfluenza,AI)高致病性禽流感(Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)又稱:真性雞瘟、歐洲雞瘟OIEA類傳染病,嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)受禽流感病毒感染后的癥狀:
輕度的呼吸道癥狀、消化道癥狀,死亡率較低較重的全身性、出血性、敗血性癥狀,死亡率較高四、AIV的檢驗(yàn)一)病毒的分離與鑒定采取病雞的呼吸道或竇內(nèi)滲出物或器官組織,制成懸液,離心沉淀或過濾以去除組織碎屑;無菌懸液0.1~0.2ml尿囊腔接種10~11日齡雞胚,在35℃中培養(yǎng)48h。取雞胚的尿囊液,作HA試驗(yàn)和HI試驗(yàn),以鑒定病毒。一)病毒的分離與鑒定二)血清學(xué)試驗(yàn)可用來證實(shí)抗體的存在--在感染后7d便可被檢測出來。常用的血清學(xué)檢查方法有:①HI試驗(yàn)——檢測抗HA抗體。②雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)——檢測抗NP抗體。③病毒中和試驗(yàn)④神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)⑤ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))
其他診斷方法:ELISA,PCR等四、AIV的檢驗(yàn)AvianinfluenzainbirdsAvianinfluenzaisaninfectioncausedbyavian(bird)influenza(flu)viruses.Theseinfluenzavirusesoccurnaturallyamongbirds.Wildbirdsworldwidecarrythevirusesintheirintestines,butusuallydonotgetsickfromthem.However,avianinfluenzaisverycontagiousamongbirdsandcanmakesomedomesticatedbirds,includingchickens,ducks,andturkeys,verysickandkillthem.TypeAofAIVTherearemanydifferentsubtypesoftypeAinfluenzaviruses.ThesesubtypesdifferbecauseofchangesincertainproteinsonthesurfaceoftheinfluenzaAvirus(hemagglutinin[HA]andneuraminidase[NA]proteins).Thereare16knownHAsubtypesand9knownNAsubtypesofinfluenzaAviruses.ManydifferentcombinationsofHAandNAproteinsarepossible.Eachcombinationrepresentsadifferentsubtype.AllknownsubtypesofinfluenzaAvirusescanbefoundinbirds.AvianInfluenzaA(H5N1)InfluenzaA(H5N1)virus–alsocalled“H5N1virus”–isaninfluenzaAvirussubtypethatoccursmainlyinbirds,ishighlycontagiousamongbirds,andcanbedeadlytothem.H5N1virusdoesnotusuallyinfectpeople,butinfectionswiththeseviruseshaveoccurredinhumans.MostofthesecaseshaveresultedfrompeoplehavingdirectorclosecontactwithH5N1-infectedpoultryorH5N1-contaminatedsurfaces.第二節(jié)口蹄疫病毒檢驗(yàn)
Foot-and-mouthdiseasevirus,F(xiàn)MDV一、生物學(xué)特性二、抵抗力三、抗原性四、培養(yǎng)特性五、致病性六、微生物學(xué)診斷口蹄疫病毒(Foodandmouthdiseasevirus,F(xiàn)MDV)是牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物口蹄疫的病原。
FMD:OIEA類傳染病之一,是全球性最重要的動(dòng)物健康問題之一。馬除外最初發(fā)現(xiàn):1898年,德國科學(xué)家Loeffler與Frosch,口蹄疫病畜病料通過濾器除菌后,仍能使健康動(dòng)物發(fā)病。屬于微RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus),該屬內(nèi)只有口蹄疫病毒1個(gè)種。二十面體對稱,直徑20~25nm,無囊膜,病毒基因組為單股正鏈RNA,在RNA芯髓外對稱衣殼上有32個(gè)殼粒。病毒子在宿主細(xì)胞漿內(nèi)可形成晶格狀排列。一、生物學(xué)特性本病毒是動(dòng)物病毒中發(fā)現(xiàn)最早的一種。對酸敏感,病毒在pH為6.5的緩沖液中、4℃條件下14h滅活90%,在pH5.5時(shí)1min滅活90%,在pH5.0時(shí)每秒鐘滅活90%,pH3.0時(shí)瞬間滅活;病毒在pH7.0~7.5時(shí)十分穩(wěn)定??谔阋卟《緦A也很敏感。對消毒劑的抵抗力較強(qiáng)。病毒在低溫下能長期保存。病毒的滅活溫度為85℃1min,70℃10min,60℃15min,但裸露的RNA對熱較穩(wěn)定。二、抵抗力
根據(jù)病毒的血清學(xué)特征,目前已知口蹄疫病毒有七個(gè)主型:A、O、C、南非Ⅰ、南非Ⅱ、南非Ⅲ和亞洲Ⅰ型(SAT1、SAT2、SAT3、Asia1
)。各型之間沒有交互免疫作用。本病毒有較大的變異性。有時(shí)流行初期與末期毒型不一致,幾乎每年都有新的亞型出現(xiàn)。本病毒已發(fā)現(xiàn)85個(gè)以上的亞型。
三、抗原性1.組織培養(yǎng)利用犢牛、幼豬的腎臟或豚鼠、牛胚胎上皮組織制成細(xì)胞單層來培養(yǎng)病毒,病毒繁殖后,使細(xì)胞發(fā)生病變。2.雞胚培養(yǎng)本病毒不易在雞胚上生長,必須反復(fù)交替通過牛與雞胚或在添有牛舌上皮的雞胚組織培養(yǎng)繼代后,才可能適應(yīng)于雞胚或雞胚組織培養(yǎng)。在感染了口蹄疫病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液中,有大小不同的4種粒子:最大的粒子為完整病毒;第二種為不含RNA的空衣殼;第三種為衣殼蛋白亞單位;第四種是病毒感染相關(guān)抗原。四、培養(yǎng)特性在自然條件下,主要發(fā)生于偶蹄獸,其中以奶牛和黃牛最易感,其次是水牛,牦牛、豬,再次為羊和駱駝等。野生偶蹄獸也能發(fā)生。從流行病學(xué)的觀點(diǎn)來看,綿羊是本病的“儲(chǔ)存器”,豬是“擴(kuò)大器”,牛是“指示器”。
1.傳播途徑呼吸道、消化道(被污染的飼料、飲水)創(chuàng)傷、皮膚、粘膜2.流行特點(diǎn):有一定的季節(jié)性(以冬、春季節(jié)發(fā)病較多)傳播迅速,一般沿交通線進(jìn)行傳播
五、致病性(一)豚鼠接種試驗(yàn)選擇500g以上的健康豚鼠4~6只,剪去后肢足掌部被毛,用濕棉花球洗凈,再用70%酒精棉消毒。將足掌部皮膚或口腔粘膜劃破,把感染性病料涂擦于劃破處。第二天如局部有水皰,即可確診。六、微生物學(xué)診斷(二)乳鼠接種試驗(yàn)
選2~7日齡乳鼠5只,4只做檢樣,1只做對照,每只頸背部皮下接種0.1ml,觀察1周,如有死鼠,及時(shí)取出,制備1:3檢樣,傳代。如無死鼠取活鼠凍死傳代,傳2-3代不死亡為陰性。FMDV接種乳鼠:呼吸急促,四肢和全身麻痹(2)乳鼠接種實(shí)驗(yàn)雙份血清ELISAIFA補(bǔ)體試驗(yàn)中和試驗(yàn)血清學(xué)檢查:病毒分離檢查:細(xì)胞培養(yǎng)PCR法口蹄疫病毒FMDV致細(xì)胞病變正常IB-RS-2單層細(xì)胞口蹄疫病毒FMDV致細(xì)胞病變FDMV感染的IB-RS-2細(xì)胞,細(xì)胞變圓收縮,細(xì)胞間隙增大FDMV感染的IB-RS-2細(xì)胞,細(xì)胞變圓口蹄疫病毒FootandMouthDiseaseVirus(FMDV)FMDVisamemberofthefamilyPicornaviridae,genusAphthovirus.Sevenimmunologicallydistinctserotypeshavebeenidentified:A,O,C,SAT1,SAT2,SAT3,andAsia1.Infectionwithoneserotypedoesnotconferimmunityagainstanother.Virionsappearsmoothandroundinoutline,arenon-enveloped,27nmindiameter,andhaveicosahedralsymmetry.ThegenomeisasinglelinearmoleculeofssRNAandisabout7.2-8.4kbinsize.GenomicRNAisinfectious.FootandMouthDisease(FMD)FMDisoneofthemostcontagiousanimaldiseases,withimportanteconomiclosses.SpeciesofthefamilyBovidae,aswellassheep,goats,swine,allwildruminantsandSuidaearenaturalhostsofFMDV.SpeciesoffamilyCamelidaehavelowsusceptibility.TypicalcasesofFMDarecharacterisedbyavesicularconditionofthefeet,buccalmucosaand,infemales,themammaryglands.Clinicalsignscanvaryfrommildtosevereandfatalitiesmayoccur,especiallyinyounganimals.FMDisclassifiedasanOIEListAdisease.第三節(jié)炭疽桿菌檢驗(yàn)
Bacillusanthracis
一、炭疽桿菌與炭疽病二、生物學(xué)特性三、檢驗(yàn)炭疽桿菌(Bacillusanthracis):人類最早認(rèn)識(shí)和注意的重要病原菌之一,是炭疽病的病原體。炭疽?。ˋnthrax)是一種人獸共患的急性、熱性、敗血性烈性傳染病,呈世界性分布。一年四季均可發(fā)生,以夏、秋季節(jié)較高。其易感動(dòng)物之多,僅次于狂犬病。家畜中以牛和綿羊最易感,常呈超急性、急性經(jīng)過,表現(xiàn)為突然倒地,呼吸困難,全身痙攣,高熱,可視黏膜發(fā)紺,天然孔出血,血凝不良,尸僵不全;山羊、馬、驢、騾、水牛、駱駝次之;豬有較強(qiáng)抵抗力,常呈慢性經(jīng)過,表現(xiàn)為咽唊炎型、腸型和肺型。一、炭疽桿菌與炭疽病Anthrax:bison炭疽:血液呈煤焦油狀人類常因食用帶有該菌的食物、飲水或與患炭疽死亡的動(dòng)物及其畜產(chǎn)品接觸而通過消化道、呼吸道或皮膚粘膜而感染,表現(xiàn)為皮膚、肺、縱隔及腸道的急性感染,有時(shí)伴有炭疽桿菌敗血癥。腸型炭疽和肺型炭疽常表現(xiàn)為急性敗血癥經(jīng)過,病死率很高。1923~1940年前蘇聯(lián)爆發(fā)6次腸型炭疽,其中最嚴(yán)重的一次是由病畜肉制成的臘腸引起的,27例病人無一幸存。一、炭疽桿菌與炭疽病本菌可通過患病動(dòng)物血液、分泌物、排泄物,或死亡病畜的尸體、組織、臟器、體液、骨骼、皮毛等污染土壤、空氣、江河、池塘甚至食物和飲水,尤其是病畜的血液,可以成為感染人類、污染環(huán)境的重要來源。炭疽桿菌繁殖體的抵抗力不強(qiáng),但其所形成的芽孢對外界環(huán)境的抵抗力極為強(qiáng)大,可長期存活。自然環(huán)境一旦被芽孢污染,則成為長久的疫源地而不易清除,長期危害人類和動(dòng)物。因此,采取有效措施防止本菌的污染和傳播,在人獸共患病防治和食品衛(wèi)生學(xué)方面具有重要意義。一、炭疽桿菌與炭疽病Cutaneousanthraxvesicledevelopment.Day4:Blackeschar,rednessremains.
Cutaneousanthraxvesicledevelopment.Day4:Noticetheedemaandtypicallesions.
WhatisAnthrax?Anthraxisanacuteinfectiousdiseasecausedbythespore-formingbacteriumBacillusanthracis.Anthraxmostcommonlyoccursinwildanddomesticlowervertebrates(cattle,sheep,goats,camels,antelopes,andotherherbivores),butitcanalsooccurinhumanswhentheyareexposedtoinfectedanimalsortissuesfrominfectedanimals.Whereisanthraxusuallyfound?Anthraxcanbefoundglobally.Itismorecommonindevelopingcountriesorcountrieswithoutveterinarypublichealthprograms.Certainregionsoftheworld(SouthandCentralAmerica,SouthernandEasternEurope,Asia,Africa,theCaribbean,andtheMiddleEast)reportmoreanthraxinanimalsthanothers.BacillusanthracisBacillusanthracisisanencapsulatedgram-positive,nonmotile,aerobic,spore-formingbacterialrodwithasporesizeofapproximately1μmx2μm.ThethreevirulencefactorsofB.anthracisareedematoxin,lethaltoxin,andanantiphagocyticcapsule.Thetoxinsareresponsiblefortheprimaryclinicalmanifestationsofhemorrhage,edema,andnecrosis.二、生物學(xué)特性(一)形態(tài)染色特性革蘭氏陽性粗大桿菌,大小為1.0~1.2μm3~5μm。無鞭毛,不能運(yùn)動(dòng)。在人和動(dòng)物體內(nèi)常呈單個(gè)散在或呈短鏈狀,菌體兩端平截,周圍形成粘液樣肥厚莢膜,似竹節(jié)狀。在血液、血清瓊脂平板上或加有碳酸氫鈉的瓊脂平板上,于10%~20%CO2環(huán)境中培養(yǎng),也可形成莢膜。莢膜比菌體更耐腐敗,因此在腐敗組織中往往不見菌體而只見“菌影”(莢膜的輪廓)。在人工培養(yǎng)物內(nèi)和自然界中,一般不形成莢膜,常呈長鏈狀。能形成卵圓形芽孢,芽孢位于菌體中央。形成芽孢的條件:氧氣充足、溫度適宜(25℃~30℃)。Gram’sstainofBacillusanthracisB.anthracis
:Gram-positive,encapsulated,spore-forming,zoonotic,rodprokaryote.
Anthrax.Toluidineblue(甲苯胺藍(lán))stain.Bacillusanthracisinabovinespleen.Anthraxbacilliintissueseeninshortchainssurroundedbyacommoncapsule.Colouredscanning,electronmicrograph(SEM)ofanthraxbacteria(Bacillusanthracis),thecauseofthediseaseanthraxinhumansandlivestock.Colouredscanningelectronmicrograph(SEM)ofBacillusanthracisspores.
二、生物學(xué)特性(二)培養(yǎng)特性本菌對營養(yǎng)要求不嚴(yán)格,在一般培養(yǎng)基上即可生長。生長溫度范圍14℃~44℃,最適溫度30℃~37℃。pH范圍6.0~8.5,最適pH7.2~7.6。普通瓊脂:強(qiáng)毒株18~24h形成扁平、粗糙、表面干燥、灰白色、不透明、邊緣不整齊的火焰狀菌落,在低倍顯微鏡下,可見菌落邊緣呈卷發(fā)狀,用接種針探觸,有粘滯感,挑之,可拉起絲。弱毒株或無毒株形成光滑菌落,菌落稍小而隆起,邊緣較整齊。二、生物學(xué)特性(二)培養(yǎng)特性普通肉湯:管底有絮狀沉淀物,整個(gè)培養(yǎng)液澄清,如輕輕搖動(dòng)試管,可見沉淀物卷繞成團(tuán),往上升起。不形成菌膜或菌環(huán)。血瓊脂平板:菌落周圍無明顯的溶血環(huán),但培養(yǎng)較久后可出現(xiàn)輕度溶血,菌落周圍不透明。菌落有粘性,用接種針釣取可拉成絲,稱為“拉絲”現(xiàn)象。明膠穿刺:只沿穿刺線生長,培養(yǎng)2~3d后明膠呈漏斗狀液化,上部向外擴(kuò)展呈白色的倒立松樹狀。ColonyofBacillusanthracisbacteria炭疽桿菌在血平板上的菌落(三)生化特性本菌能分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、菊糖、蕈糖和果糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;不分解乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露醇、乳糖、甘露醇、山梨醇和衛(wèi)茅醇;有些菌株可遲緩發(fā)酵甘油和水楊苷。不能利用枸櫞酸鹽;不分解尿素;能水解淀粉和乳蛋白;通常可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;不產(chǎn)生靛基質(zhì)和硫化氫,V-P試驗(yàn)不定;苯丙氨酸脫氨酶和磷酸酯酶陰性,接觸酶陽性;牛乳經(jīng)2~4d凝固,然后慢慢胨化。二、生物學(xué)特性AnthraxisanacuteinfectiousdiseasecausedbythebacteriumBacillusanthracis.Anthraxisprimarilyadiseaseofdomesticatedandwildanimals,particularlyherbivoressuchascattle,sheep,horses,mulesandgoats.B.anthraciswassocalledaftertheGreekwordforblackcoal('anthracis'),duetotheblacknecroticulcerscharacteristicofcutaneousanthraxinfection.Thebacteriumproducessporeswhichcansurvivedormantinthesoilformanyyearsandalthoughhumananthraxisfairlyrare,infectionoccursincidentallythroughcontactwithdiseasedanimalsorbyinhalinganthraxsporesfromcontaminatedanimalproductssuchasflesh,bones,hides,hairandexcrement.(三)血清學(xué)特性目前已知有4種抗原成分:保護(hù)性抗原、莢膜抗原、菌體抗原和芽孢抗原。1、保護(hù)性抗原:是炭疽桿菌生活過程中產(chǎn)生的一種細(xì)胞外蛋白質(zhì),為炭疽桿菌毒素的組成部分,有免疫原性,其相應(yīng)的抗體能使動(dòng)物抵抗本菌的感染作用。2、莢膜抗原:由D-谷氨酰多肽組成,是一種半抗原,與毒力有關(guān),僅見于有毒菌株;該抗原產(chǎn)生的抗體對動(dòng)物無保護(hù)作用,但具有較特異的抗原性,由此建立起用于鑒定菌種的莢膜腫脹試驗(yàn)和測定患者血清莢膜抗體的免疫熒光法等,均能獲得較好的效果。二、生物學(xué)特性(三)血清學(xué)特性1、保護(hù)性抗原:2、莢膜抗原:3、菌體抗原:有2種。一種為多糖半抗原,存在于細(xì)菌細(xì)胞壁和菌體內(nèi),耐熱,比較穩(wěn)定,與毒力無關(guān);常用的炭疽沉淀反應(yīng)(Ascoli反應(yīng))就是通過檢測此抗原而判定炭疽污染的;有種的特異性,但特異性不高,能與其它需氧芽孢桿菌等發(fā)生交叉反應(yīng)。另一種是菌體蛋白質(zhì)抗原,具有對細(xì)菌自身的保護(hù)作用。4、芽孢抗原:位于芽孢的外膜,具有免疫原性和血清學(xué)診斷價(jià)值。二、生物學(xué)特性三、檢驗(yàn)(一)檢驗(yàn)程序見《動(dòng)物性食品檢驗(yàn)學(xué)》第六章。(二)細(xì)菌學(xué)檢查1.顯微鏡檢查:2.分離培養(yǎng)3.鑒別試驗(yàn)(三)其它檢驗(yàn)方法三、檢驗(yàn)(二)細(xì)菌學(xué)檢查1.顯微鏡檢查:取待檢材料制成涂片,用莢膜染色法及革蘭氏染色法染色后鏡檢。革蘭氏染色可見G+粗大桿菌。莢膜染色法菌體呈深紫色,莢膜淡紫色;堿性美蘭染色可將菌體染成藍(lán)色,莢膜為淡粉紅色。2.分離培養(yǎng):一般分離培養(yǎng)采用血瓊脂平板。污染嚴(yán)重的標(biāo)本,可在處理后接種于炭疽桿菌選擇性瓊脂平板,如戊烷脒血瓊脂平板。經(jīng)37℃10h~24h培養(yǎng)后,進(jìn)行菌落檢查和鑒別試驗(yàn)。在戊烷脒血瓊脂平板上,多數(shù)其它芽孢桿菌受到抑制,而炭疽桿菌仍可生長,但也受到輕度抑制。菌落生長較慢較小,不溶血,呈卷發(fā)狀。三、檢驗(yàn)(二)細(xì)菌學(xué)檢查3.鑒別試驗(yàn)(1)明膠穿刺:沿穿刺線形成白色的倒立松樹狀生長,可證實(shí)為炭疽桿菌。(2)串珠試驗(yàn):在適當(dāng)濃度的青霉素(0.05~0.5IU/mL)作用下,炭疽桿菌細(xì)胞壁粘肽的合成被抑制,使菌體膨大,形成大而均勻的圓球狀,類似串珠。這種現(xiàn)象為炭疽桿菌所特有,可與其它需氧芽孢菌鑒別,且與常規(guī)檢查符合率高達(dá)80%~90%。常用方法有肉湯法和瓊脂薄片法。(3)串珠熒光抗體染色法:本法結(jié)合了串珠試驗(yàn)和熒光抗體染色法的特點(diǎn),具有雙重特異性,有助于與其它需氧菌的區(qū)別。三、檢驗(yàn)(三)其它檢驗(yàn)方法
1.莢膜熒光抗體染色法
2.莢膜腫脹試驗(yàn)
3.Ascoli’s反應(yīng)(環(huán)狀沉淀試驗(yàn))1902年Ascoli首次提出,一直被廣泛應(yīng)用。適用于疑似炭疽死亡動(dòng)物的病料、干的皮張、陳舊及污染嚴(yán)重的炭疽病料等。特異性和敏感性較差,因此其應(yīng)用有一定局限性。4.乳膠凝集試驗(yàn)5.青霉素抑制試驗(yàn)每1mL培養(yǎng)基中含青霉素10IU時(shí),可抑制炭疽桿菌的生長,而其它需氧芽孢桿菌生長不受影響。6.噬菌體裂解試驗(yàn)
第四節(jié)布魯菌檢驗(yàn)
Examinationof
Brucella一、布魯菌與布魯菌病二、布魯菌的生物學(xué)特性三、檢驗(yàn)布魯菌(Brucella)是人獸共患的布魯氏菌病病原體,牛、羊、豬等動(dòng)物最易感染。我國流行的主要是羊、牛(馬耳他)、豬三種布魯氏菌,其中以羊布魯氏菌病最為多見。該細(xì)菌主要感染懷孕動(dòng)物,侵入生殖器官和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),并感染胚胎和胎兒,多導(dǎo)致胎兒死亡并流產(chǎn);公畜主要表現(xiàn)為睪丸炎。人患病主要是由畜傳染,人與人之間傳染機(jī)會(huì)極少,感染途徑主要是通過皮膚、消化道、呼吸道、眼結(jié)膜和生殖器官。人感染后潛伏期2~3周,由于本菌具有莢膜,能抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬,并能在該細(xì)胞內(nèi)增殖,反復(fù)出現(xiàn)菌血癥,病人出現(xiàn)發(fā)熱、無力等癥狀,且呈波浪式發(fā)熱,故在臨床上稱為波浪熱。一、布魯菌與布魯菌病人類接觸帶菌動(dòng)物或食用病畜及其乳制品,均可被感染。布魯菌病最危險(xiǎn)之點(diǎn)是患畜幾乎不表現(xiàn)癥狀,但能通過分泌物和排泄物(乳、精子、陰道分泌物、糞、尿)不斷向外排菌,待別是隨流產(chǎn)胎兒、胎衣和羊水排出大量病原菌,成為最危險(xiǎn)的傳染源。本菌在自然界中抵抗力較強(qiáng),在病畜臟器和分泌物中,一般能存活4個(gè)月左右,在食品中約能生存2個(gè)月。在水、土、糞、尿中存活3個(gè)月,在皮毛上存活1~4個(gè)月,在凍肉中存活2~7周,在乳中存活10天至1年。對低溫的抵抗力也強(qiáng),對熱和消毒劑抵抗力弱。對鏈霉素、氯霉素和四環(huán)素等均敏感。一、布魯菌與布魯菌病Brucella
isnamedafterSirDavidBrucewho,in1886,firstisolatedtheorganismfromthespleenofasoldieratpost-mortem(尸檢)withwhatwasthencalledMaltafever.ThegenusBrucella
currently
containssixspecies:B.melitensis,B.abortus,B.canis,B.ovis,B.suisandB.neotomae,whichvaryintheirabilitytoinfecthostanimals.Brucellosis,Hygromas(水囊瘤)onthekneejoints.ThisconditionmaybeasequeltoBrucellaabortusinfection.一、布魯菌與布魯菌病布魯菌病引起的流產(chǎn)一、布魯菌與布魯菌?。ㄒ唬┬螒B(tài)染色特性布魯菌初分離時(shí)為微小球桿菌,繼代后,牛和豬布魯菌可逐漸變?yōu)闂U狀,羊布魯菌仍為小球桿狀。平均大小為0.6~1.5μm×0.5~0.7μm。不形成芽孢,無鞭毛,無動(dòng)力。常單個(gè)存在。光滑型菌有莢膜。革蘭氏染色陰性??杀凰袎A性染料著色,不呈兩極濃染??率先旧ǎㄉ滁S與孔雀綠對染)染色,本菌為鮮紅色,其它雜菌被染成綠色。二、生物學(xué)特性布魯菌(Gram’sstain)二、生物學(xué)特性ScanningElectronMicrographofBrucellaabortus:causesbrucellosisfever(alsoknownasundulantorMaltafever).
SEMofBrucellamelitensis
-Gram-negative,aerobic,coccobacillusprokaryote;Magnification:x3,600.
Magnification:x3,900.(二)培養(yǎng)特性專性需氧,但許多菌株初次分離時(shí)需5%~10%的CO2環(huán)境。適宜溫度為35~38℃,適宜pH為6.6~7.4。布魯氏菌的培養(yǎng)特點(diǎn)是生長緩慢,尤其是新分離株初次分離時(shí)在48h前罕見菌落形成,往往需要5~10d甚至20~30d。傳代適應(yīng)后48h可見生長。對營養(yǎng)要求嚴(yán)格,需某些氨基酸、血清、血液或組織浸液。血清葡萄糖肉湯和血清葡萄糖瓊脂可支持所有種和大多數(shù)菌株生長。二、生物學(xué)特性在血清肝湯瓊脂上2~3d后形成濕潤、閃光、無色、圓形、表面隆起、邊緣整齊的小菌落。在血液肝湯瓊脂上菌落灰白,不溶血。在高層血清瓊脂培養(yǎng)3~6d后,牛型及綿羊型于瓊脂表面0.5cm處呈帶狀生長。而在馬鈴薯斜面上本菌生長良好,2~3d后長出微棕黃色菌苔,色素溶于基質(zhì)。在肉肝湯中一般需2~3d才可見生長。肉湯輕微渾濁,無菌膜。1周后產(chǎn)生灰白色粘稠沉淀物。老齡培養(yǎng)物中有時(shí)可見菌環(huán)。二、生物學(xué)特性BrucellamelitensisonSBA,48hrs(三)生化特性多數(shù)菌株可分解葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等,但分解能力低,產(chǎn)酸少,很難檢測。本菌不液化明膠;不產(chǎn)生靛基質(zhì);不凝固牛乳;能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;接觸酶陽性;MR試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)陰性;H2S試驗(yàn)不定。
二、生物學(xué)特性WeakureareactionofB.melitensis
at24honChristensens’sagar(四)血清學(xué)特性本菌抗原結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,就目前所知,布魯氏菌有表面抗原(A、M、R)、亞表面抗原和深部抗原3類。1.A、M抗原光滑型菌株的表面抗原主要是A(流產(chǎn)型)和M(馬耳他型)抗原,為細(xì)胞壁脂多糖的大分子復(fù)合物,既是這些細(xì)菌的凝集原,也是種和型鑒定的重要依據(jù)。流產(chǎn)布魯氏菌A﹕M為20﹕1,馬耳他布魯氏菌為1﹕20,豬布魯氏菌為4﹕1。2.R抗原非光滑型菌株除A、M抗原外,均還具有R抗原,為細(xì)胞壁上低蛋白含量的脂多糖復(fù)合物。絕大多數(shù)非光滑型菌株的R抗原是相同的,其抗血清可與羊布魯氏菌和犬布魯氏菌發(fā)生凝集,而不與光滑型布魯氏菌凝集。
二、生物學(xué)特性1)B.abortusprimarilyinfectscattlebutistransmittedtobuffaloes,camels,deer,dogs,horses,sheepandman.2)B.melitensiscausesahighlycontagiousdiseaseinsheepandgoatsalthoughcattlecanbeinfected.Itisthemostimportantspeciesinhumaninfection.3)B.suiscoversawiderhostrangethanmostotherBrucella
species.Thisspecieshas5biovars.Allbiovarscanbetransmittedtomanwiththepossibleexceptionofbiovar2.sixspeciesofBrucellaB.abortus
B.melitensis
B.suis4)B.caniscausesepididymo-orchitisinthemaledogandabortionandmetritisinthebitch.Ithasnotbeenreportedinotheranimalspeciesexceptman.5)B.ovisisresponsibleforepididymitisinramsandoccasionallyabortioninewes,butdoesnotinfectotheranimalsorman.6)B.neotomaeisonlyknowntoinfectthedesertwoodrat(沙林鼠)undernaturalconditions,andnoothercaseshavebeenreported.sixspeciesofBrucella三、檢驗(yàn)一)檢驗(yàn)程序
見《動(dòng)物性食品檢驗(yàn)學(xué)》第六章。二)細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定
首先要注意安全,防止人員感染和環(huán)境污染,其次要特別注意滿足布魯氏菌的營養(yǎng)要求。1.細(xì)菌的分離培養(yǎng):SDA(血清葡萄糖瓊脂),對污染樣品則接種在選擇培養(yǎng)基(加有抗生素的SDA)上。也可將檢樣接種于含2%(W/V)檸檬酸鈉和抗生素的SDB中,經(jīng)37℃培養(yǎng)2~3d(必要時(shí)補(bǔ)充5~10%的CO2)后再于SDA上分離培養(yǎng)約6d,直到出現(xiàn)可見菌落。
三、檢驗(yàn)二)細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定
1.細(xì)菌的分離培養(yǎng):2.布魯菌的鑒定分型:在必要時(shí)進(jìn)行布魯菌的鑒定分型。常規(guī)方法有:
CO2需求的檢查,
H2S產(chǎn)生量的測定,染料抑菌試驗(yàn),
A、M、R血清凝集試驗(yàn),
Tb噬菌體裂解試驗(yàn)。三、檢驗(yàn)三)血清學(xué)檢驗(yàn)用血清學(xué)試驗(yàn)診斷人、畜布魯菌病仍是當(dāng)前主要手段。常用的方法有10多種,其中用于人布病診斷的主要有試管凝集試驗(yàn)、二巰基乙醇試管凝集試驗(yàn)、抗球蛋白試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng),用于動(dòng)物診斷的主要方法是試管凝集試驗(yàn)、平板凝集試驗(yàn)、虎紅平板凝集試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等。(1)平板凝集試驗(yàn)(Plateagglutinationtest,PAT)(2)虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)(3)試管凝集試驗(yàn)(SAT):(4)抗人免疫球蛋白試驗(yàn)(Coomb’s反應(yīng))(5)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(Complimentfixationtest,CFT)第五節(jié)結(jié)核分支桿菌檢驗(yàn)
Mycobacteriumtuberculosis一、結(jié)核分支桿菌與結(jié)核病結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)俗稱結(jié)核桿菌,可引起人和牛(主要是奶牛)、豬、禽類的結(jié)核病。該菌是一類細(xì)長略彎曲的微生物,有時(shí)有分枝或出現(xiàn)絲狀體。目前在分類學(xué)上已將分枝桿菌屬歸納于放線菌中。主要有人型、牛型、禽型、
鼠型和冷血?jiǎng)游镄图胺侵扌?。已知人型、牛型和非洲型對人有致病性。禽型可能也對人致病。一、結(jié)核分支桿菌與結(jié)核病牛,特別是奶牛對結(jié)核桿菌最易感。牛常見的結(jié)核病是肺、乳房、淋巴結(jié)結(jié)核,有時(shí)可見腸、生殖器、漿膜結(jié)核及全身性結(jié)核。豬主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)核,最?;疾〉牟课皇穷M下、咽、頸及腸系膜淋巴結(jié)。禽類主要對禽型結(jié)核桿菌敏感,主要侵害肝、脾等。人的結(jié)核以肺結(jié)核最為常見,此外有淋巴結(jié)核、腸結(jié)核、骨結(jié)核等。據(jù)WHO報(bào)道,每年約有800萬新病例發(fā)生,至少有300萬人死于該病。一、結(jié)核分支桿菌與結(jié)核病人感染結(jié)核病,除通過呼吸道途徑外,還可通過動(dòng)物性食品尤其是污染的牛乳經(jīng)消化道而感染,病畜肉對人也有一定威脅。因此,牛乳或肉食品中的結(jié)核桿菌污染以及奶牛等畜禽的結(jié)核病在食品衛(wèi)生方面具有重要意義,是預(yù)防人類結(jié)核病的重要環(huán)節(jié)。一、結(jié)核分支桿菌與結(jié)核病In1882,afewyearsafterhediscoveredthebacillusresponsibleforanthrax,GermanphysicianRobertKoch(1843-1910)publishedhisstudiesrevealingtheorganismbehindTB,Mycobacteriumtuberculosis.Suddenly,contaminatedrawmilk,andit'sroleininfantmortality,becamealotclearer.二、生物學(xué)特性(一)形態(tài)與染色特性
結(jié)核分枝桿菌為細(xì)長略帶彎曲、兩端鈍圓的桿菌,長1~4μm,寬0.2~0.5μm。牛分枝桿菌則比較粗短。無芽孢,無動(dòng)力。在陳舊培養(yǎng)物或干酪化的淋巴結(jié)中可看到分枝狀。分枝桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞壁脂質(zhì)含量較高,約占干重的60%,特別是有大量分枝菌酸(mycolicacid)包圍在肽聚糖層的外面,可影響染料的穿入,若經(jīng)加溫或延長染色時(shí)間而著色后能抵抗強(qiáng)脫色劑鹽酸乙醇的脫色,故又稱抗酸桿菌(acid-fastbacilli)。二、生物學(xué)特性(一)形態(tài)與染色特性
分枝桿菌一般用齊尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法,以5%石炭酸復(fù)紅加溫染色后可以染上,但用3%鹽酸乙醇不易脫色。若再加用美藍(lán)復(fù)染,則分枝桿菌呈紅色,而其他細(xì)菌和背景中的物質(zhì)為藍(lán)色。近年發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞壁外尚有一層莢膜。一般因制片時(shí)遭受破壞而不易看到。若在制備電鏡標(biāo)本固定前用明膠處理,可防止莢膜脫水收縮,在電鏡下可看到菌體外有一層較厚的透明區(qū),即莢膜。莢膜對結(jié)核分枝桿菌有一定的保護(hù)作用。
(二)培養(yǎng)特性專性需氧。最適溫度為37℃,低于30℃不生長。對營養(yǎng)要求較高,必須在含有血清或卵黃、某些無機(jī)鹽和碳源的特殊培養(yǎng)基上才能生長。即使在最適條件下生長仍很緩慢,需10~20d才能在固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)可見菌落。常用的有羅氏(Lowenstein-Jensen)固體培養(yǎng)基。菌落為淺黃色,小而干燥,不透明,表面粗糙、皺縮,形似菜花心。在液體培養(yǎng)基中一般1~2周即可生長,可形成菌膜,加入吐溫-80(Tween-80)等表面活性劑,則可提高細(xì)菌生長率,并使其均勻生長。二、生物學(xué)特性(三)生化特性各型結(jié)
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