第五章病原微生物檢驗(yàn)

第五章常見(jiàn)病原微生物的檢驗(yàn)第一節(jié)禽流感病毒第二節(jié)口蹄疫病毒第三節(jié)炭疽桿菌第四節(jié)布魯氏桿菌第五節(jié)結(jié)核分支桿菌第一節(jié)禽流感病毒

(Avianinfluenzavirus，AIV)一、生物學(xué)特性二、抗原性三、病毒的致病性四、診斷1878年P(guān)erroncito首次報(bào)道意大利雞群暴發(fā)禽流感.禽流感呈廣泛性傳播和全球性分布。高致病性禽流感（HPAI）近幾年連續(xù)爆發(fā)，對(duì)世界范圍內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)及人類(lèi)健康造成極大危害。禽流感具有爆發(fā)突然、蔓延迅速、波及面廣等特點(diǎn)，人類(lèi)、豬、家禽、野禽、水禽等均是受害對(duì)象。一、生物學(xué)特性

正粘病毒科/甲型流感病毒屬

☆病毒粒子一般為球形，直徑為80~120nm；★外有囊膜，囊膜表面有許多放射狀排列的纖突（Spikes）;★纖突分兩類(lèi)，一類(lèi)是棒狀，由血凝素（HA）分子的三聚體構(gòu)成；另一類(lèi)是蘑菇狀，由神經(jīng)氨酸酶（NA）分子的四聚體構(gòu)成。兩種結(jié)構(gòu)在囊膜上的比例約為HA:NA＝75:20。核酸型為單股負(fù)股RNA，分8節(jié)；8個(gè)獨(dú)立的RNA片段，分別編碼PB1，PB2，PA，HA，NP，NA，M1，M2，NS1，NS2等10種蛋白。透射電鏡下呈圓形，其表面有纖突（×60000）H5N1正在攻擊健康的細(xì)胞：藍(lán)色部分是禽流感病毒，下面的紅色部分則是健康人體細(xì)胞培養(yǎng)特性易在雞胚以及雞和猴的腎組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)；有些毒株也能在家兔、公牛和人的細(xì)胞中生長(zhǎng)。在組織培養(yǎng)中能引起血球吸附，并常產(chǎn)生病變。大多數(shù)毒株能在雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生蝕斑。有些毒株在雞、鴿或人的細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)之后，對(duì)雞的毒力減弱。禽流感病毒對(duì)外界因素的抵抗力較弱。56℃30min、60℃10min、65-70℃數(shù)分鐘即可滅活病毒。在直射陽(yáng)光下４０至４８小時(shí)即可失去活性。對(duì)低溫抵抗力較強(qiáng)，4℃可存活1個(gè)多月，在有甘油保護(hù)的情況下可保持活力１年以上。抵抗力一）血清型根據(jù)流感病毒的核蛋白（NP）和膜蛋白（MS）抗原性的不同，將其分為A、B、C三個(gè)血清型三型之間的差異可通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等進(jìn)行測(cè)定。二、抗原性二）HA和NA是病毒表面的主要糖蛋白；具有種(亞型)的特異性和多變性，根據(jù)病毒HA和NA抗原性的差異，可將其分為不同的亞型。HA和NA在病毒感染過(guò)程中起著重要作用。

－HA決定病毒的致病性，能誘發(fā)感染宿主產(chǎn)生具有保護(hù)作用的中和抗體，

－NA誘發(fā)的抗體無(wú)中和作用,但可減少病毒增殖和改變病程。二、抗原性迄今已知有16種HA和10種NA據(jù)報(bào)道現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的流感病毒亞型至少有80多種；其中絕大多數(shù)屬非致病性或低致病性；高致病性亞型主要是含H5和H7的毒株基因極易發(fā)生變異HA的基因的突變率最高其次為NA基因AIV基因組極易發(fā)生變異1、基因突變導(dǎo)致流感病毒發(fā)生抗原漂移（antigenicdrift）。因?yàn)榱鞲胁《镜腞NA復(fù)制酶缺乏校正閱讀能力，導(dǎo)致不同毒力毒株出現(xiàn)。

如1983-1984（美國(guó)）H5N2，6個(gè)月后成為高致病性，禽類(lèi)病死率達(dá)90%；1999-2001（意大利）H7N1，9個(gè)月后成為高致病性。2、基因重組是流感病毒發(fā)生抗原轉(zhuǎn)變（antigenicshift）的主要原因。目前，多數(shù)人認(rèn)為抗原轉(zhuǎn)變是以前流行于人和動(dòng)物流感病毒基因片段重組的結(jié)果。（鴨-豬-人-禽）（新亞型出現(xiàn)）禽流感病毒變異三、致病性引起各種類(lèi)型的禽流感（Avianinfluenza，AI）高致病性禽流感（Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI）又稱(chēng)：真性雞瘟、歐洲雞瘟OIEA類(lèi)傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)受禽流感病毒感染后的癥狀：

輕度的呼吸道癥狀、消化道癥狀，死亡率較低較重的全身性、出血性、敗血性癥狀，死亡率較高四、AIV的檢驗(yàn)一）病毒的分離與鑒定采取病雞的呼吸道或竇內(nèi)滲出物或器官組織,制成懸液，離心沉淀或過(guò)濾以去除組織碎屑；無(wú)菌懸液0.1~0.2ml尿囊腔接種10~11日齡雞胚,在35℃中培養(yǎng)48h。取雞胚的尿囊液,作HA試驗(yàn)和HI試驗(yàn)，以鑒定病毒。一）病毒的分離與鑒定二）血清學(xué)試驗(yàn)可用來(lái)證實(shí)抗體的存在－－在感染后7d便可被檢測(cè)出來(lái)。常用的血清學(xué)檢查方法有：①HI試驗(yàn)——檢測(cè)抗HA抗體。②雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)——檢測(cè)抗NP抗體。③病毒中和試驗(yàn)④神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)⑤ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))

其他診斷方法：ELISA，PCR等四、AIV的檢驗(yàn)AvianinfluenzainbirdsAvianinfluenzaisaninfectioncausedbyavian(bird)influenza(flu)viruses.Theseinfluenzavirusesoccurnaturallyamongbirds.Wildbirdsworldwidecarrythevirusesintheirintestines,butusuallydonotgetsickfromthem.However,avianinfluenzaisverycontagiousamongbirdsandcanmakesomedomesticatedbirds,includingchickens,ducks,andturkeys,verysickandkillthem.TypeAofAIVTherearemanydifferentsubtypesoftypeAinfluenzaviruses.ThesesubtypesdifferbecauseofchangesincertainproteinsonthesurfaceoftheinfluenzaAvirus(hemagglutinin[HA]andneuraminidase[NA]proteins).Thereare16knownHAsubtypesand9knownNAsubtypesofinfluenzaAviruses.ManydifferentcombinationsofHAandNAproteinsarepossible.Eachcombinationrepresentsadifferentsubtype.AllknownsubtypesofinfluenzaAvirusescanbefoundinbirds.AvianInfluenzaA(H5N1)InfluenzaA(H5N1)virus–alsocalled“H5N1virus”–isaninfluenzaAvirussubtypethatoccursmainlyinbirds,ishighlycontagiousamongbirds,andcanbedeadlytothem.H5N1virusdoesnotusuallyinfectpeople,butinfectionswiththeseviruseshaveoccurredinhumans.MostofthesecaseshaveresultedfrompeoplehavingdirectorclosecontactwithH5N1-infectedpoultryorH5N1-contaminatedsurfaces.第二節(jié)口蹄疫病毒檢驗(yàn)

Foot-and-mouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV一、生物學(xué)特性二、抵抗力三、抗原性四、培養(yǎng)特性五、致病性六、微生物學(xué)診斷口蹄疫病毒（Foodandmouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV）是牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物口蹄疫的病原。

FMD：OIEA類(lèi)傳染病之一，是全球性最重要的動(dòng)物健康問(wèn)題之一。馬除外最初發(fā)現(xiàn)：1898年，德國(guó)科學(xué)家Loeffler與Frosch，口蹄疫病畜病料通過(guò)濾器除菌后，仍能使健康動(dòng)物發(fā)病。屬于微RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），該屬內(nèi)只有口蹄疫病毒1個(gè)種。二十面體對(duì)稱(chēng)，直徑20～25nm，無(wú)囊膜，病毒基因組為單股正鏈RNA，在RNA芯髓外對(duì)稱(chēng)衣殼上有32個(gè)殼粒。病毒子在宿主細(xì)胞漿內(nèi)可形成晶格狀排列。一、生物學(xué)特性本病毒是動(dòng)物病毒中發(fā)現(xiàn)最早的一種。對(duì)酸敏感，病毒在pH為6.5的緩沖液中、4℃條件下14h滅活90％，在pH5.5時(shí)1min滅活90％，在pH5.0時(shí)每秒鐘滅活90％，pH3.0時(shí)瞬間滅活;病毒在pH7.0～7.5時(shí)十分穩(wěn)定?？谔阋卟《緦?duì)堿也很敏感。對(duì)消毒劑的抵抗力較強(qiáng)。病毒在低溫下能長(zhǎng)期保存。病毒的滅活溫度為85℃1min，70℃10min，60℃15min，但裸露的RNA對(duì)熱較穩(wěn)定。二、抵抗力

根據(jù)病毒的血清學(xué)特征，目前已知口蹄疫病毒有七個(gè)主型：A、O、C、南非Ⅰ、南非Ⅱ、南非Ⅲ和亞洲Ⅰ型（SAT1、SAT2、SAT3、Asia1

）。各型之間沒(méi)有交互免疫作用。本病毒有較大的變異性。有時(shí)流行初期與末期毒型不一致，幾乎每年都有新的亞型出現(xiàn)。本病毒已發(fā)現(xiàn)85個(gè)以上的亞型。

三、抗原性1．組織培養(yǎng)利用犢牛、幼豬的腎臟或豚鼠、牛胚胎上皮組織制成細(xì)胞單層來(lái)培養(yǎng)病毒，病毒繁殖后，使細(xì)胞發(fā)生病變。2．雞胚培養(yǎng)本病毒不易在雞胚上生長(zhǎng)，必須反復(fù)交替通過(guò)牛與雞胚或在添有牛舌上皮的雞胚組織培養(yǎng)繼代后，才可能適應(yīng)于雞胚或雞胚組織培養(yǎng)。在感染了口蹄疫病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液中，有大小不同的4種粒子：最大的粒子為完整病毒；第二種為不含RNA的空衣殼；第三種為衣殼蛋白亞單位；第四種是病毒感染相關(guān)抗原。四、培養(yǎng)特性在自然條件下，主要發(fā)生于偶蹄獸，其中以奶牛和黃牛最易感，其次是水牛，牦牛、豬，再次為羊和駱駝等。野生偶蹄獸也能發(fā)生。從流行病學(xué)的觀(guān)點(diǎn)來(lái)看，綿羊是本病的“儲(chǔ)存器”，豬是“擴(kuò)大器”，牛是“指示器”。

1.傳播途徑呼吸道、消化道(被污染的飼料、飲水）創(chuàng)傷、皮膚、粘膜2.流行特點(diǎn)：有一定的季節(jié)性（以冬、春季節(jié)發(fā)病較多）傳播迅速,一般沿交通線(xiàn)進(jìn)行傳播

五、致病性（一）豚鼠接種試驗(yàn)選擇500g以上的健康豚鼠4～6只，剪去后肢足掌部被毛，用濕棉花球洗凈，再用70％酒精棉消毒。將足掌部皮膚或口腔粘膜劃破，把感染性病料涂擦于劃破處。第二天如局部有水皰，即可確診。六、微生物學(xué)診斷(二)乳鼠接種試驗(yàn)

選2～7日齡乳鼠5只，4只做檢樣，1只做對(duì)照，每只頸背部皮下接種0.1ml，觀(guān)察1周，如有死鼠,及時(shí)取出，制備1:3檢樣，傳代。如無(wú)死鼠取活鼠凍死傳代，傳2-3代不死亡為陰性。FMDV接種乳鼠：呼吸急促，四肢和全身麻痹（2）乳鼠接種實(shí)驗(yàn)雙份血清ELISAIFA補(bǔ)體試驗(yàn)中和試驗(yàn)血清學(xué)檢查：病毒分離檢查：細(xì)胞培養(yǎng)PCR法口蹄疫病毒FMDV致細(xì)胞病變正常IB-RS-2單層細(xì)胞口蹄疫病毒FMDV致細(xì)胞病變FDMV感染的IB-RS-2細(xì)胞，細(xì)胞變圓收縮，細(xì)胞間隙增大FDMV感染的IB-RS-2細(xì)胞，細(xì)胞變圓口蹄疫病毒FootandMouthDiseaseVirus(FMDV)FMDVisamemberofthefamilyPicornaviridae,genusAphthovirus.Sevenimmunologicallydistinctserotypeshavebeenidentified:A,O,C,SAT1,SAT2,SAT3,andAsia1.Infectionwithoneserotypedoesnotconferimmunityagainstanother.Virionsappearsmoothandroundinoutline,arenon-enveloped,27nmindiameter,andhaveicosahedralsymmetry.ThegenomeisasinglelinearmoleculeofssRNAandisabout7.2-8.4kbinsize.GenomicRNAisinfectious.FootandMouthDisease(FMD)FMDisoneofthemostcontagiousanimaldiseases,withimportanteconomiclosses.SpeciesofthefamilyBovidae,aswellassheep,goats,swine,allwildruminantsandSuidaearenaturalhostsofFMDV.SpeciesoffamilyCamelidaehavelowsusceptibility.TypicalcasesofFMDarecharacterisedbyavesicularconditionofthefeet,buccalmucosaand,infemales,themammaryglands.Clinicalsignscanvaryfrommildtosevereandfatalitiesmayoccur,especiallyinyounganimals.FMDisclassifiedasanOIEListAdisease.第三節(jié)炭疽桿菌檢驗(yàn)

Bacillusanthracis

一、炭疽桿菌與炭疽病二、生物學(xué)特性三、檢驗(yàn)炭疽桿菌（Bacillusanthracis）：人類(lèi)最早認(rèn)識(shí)和注意的重要病原菌之一，是炭疽病的病原體。炭疽?。ˋnthrax）是一種人獸共患的急性、熱性、敗血性烈性傳染病，呈世界性分布。一年四季均可發(fā)生，以夏、秋季節(jié)較高。其易感動(dòng)物之多，僅次于狂犬病。家畜中以牛和綿羊最易感，常呈超急性、急性經(jīng)過(guò)，表現(xiàn)為突然倒地，呼吸困難，全身痙攣，高熱，可視黏膜發(fā)紺，天然孔出血，血凝不良，尸僵不全；山羊、馬、驢、騾、水牛、駱駝次之；豬有較強(qiáng)抵抗力，常呈慢性經(jīng)過(guò)，表現(xiàn)為咽唊炎型、腸型和肺型。一、炭疽桿菌與炭疽病Anthrax：bison炭疽：血液呈煤焦油狀人類(lèi)常因食用帶有該菌的食物、飲水或與患炭疽死亡的動(dòng)物及其畜產(chǎn)品接觸而通過(guò)消化道、呼吸道或皮膚粘膜而感染，表現(xiàn)為皮膚、肺、縱隔及腸道的急性感染，有時(shí)伴有炭疽桿菌敗血癥。腸型炭疽和肺型炭疽常表現(xiàn)為急性敗血癥經(jīng)過(guò)，病死率很高。1923~1940年前蘇聯(lián)爆發(fā)6次腸型炭疽，其中最嚴(yán)重的一次是由病畜肉制成的臘腸引起的，27例病人無(wú)一幸存。一、炭疽桿菌與炭疽病本菌可通過(guò)患病動(dòng)物血液、分泌物、排泄物，或死亡病畜的尸體、組織、臟器、體液、骨骼、皮毛等污染土壤、空氣、江河、池塘甚至食物和飲水，尤其是病畜的血液，可以成為感染人類(lèi)、污染環(huán)境的重要來(lái)源。炭疽桿菌繁殖體的抵抗力不強(qiáng)，但其所形成的芽孢對(duì)外界環(huán)境的抵抗力極為強(qiáng)大，可長(zhǎng)期存活。自然環(huán)境一旦被芽孢污染，則成為長(zhǎng)久的疫源地而不易清除，長(zhǎng)期危害人類(lèi)和動(dòng)物。因此，采取有效措施防止本菌的污染和傳播，在人獸共患病防治和食品衛(wèi)生學(xué)方面具有重要意義。一、炭疽桿菌與炭疽病Cutaneousanthraxvesicledevelopment.Day4:Blackeschar,rednessremains.

Cutaneousanthraxvesicledevelopment.Day4:Noticetheedemaandtypicallesions.

WhatisAnthrax?Anthraxisanacuteinfectiousdiseasecausedbythespore-formingbacteriumBacillusanthracis.Anthraxmostcommonlyoccursinwildanddomesticlowervertebrates(cattle,sheep,goats,camels,antelopes,andotherherbivores),butitcanalsooccurinhumanswhentheyareexposedtoinfectedanimalsortissuesfrominfectedanimals.Whereisanthraxusuallyfound?Anthraxcanbefoundglobally.Itismorecommonindevelopingcountriesorcountrieswithoutveterinarypublichealthprograms.Certainregionsoftheworld(SouthandCentralAmerica,SouthernandEasternEurope,Asia,Africa,theCaribbean,andtheMiddleEast)reportmoreanthraxinanimalsthanothers.BacillusanthracisBacillusanthracisisanencapsulatedgram-positive,nonmotile,aerobic,spore-formingbacterialrodwithasporesizeofapproximately1μmx2μm.ThethreevirulencefactorsofB.anthracisareedematoxin,lethaltoxin,andanantiphagocyticcapsule.Thetoxinsareresponsiblefortheprimaryclinicalmanifestationsofhemorrhage,edema,andnecrosis.二、生物學(xué)特性（一）形態(tài)染色特性革蘭氏陽(yáng)性粗大桿菌，大小為1.0~1.2μm3~5μm。無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。在人和動(dòng)物體內(nèi)常呈單個(gè)散在或呈短鏈狀，菌體兩端平截，周?chē)纬烧骋簶臃屎袂v膜，似竹節(jié)狀。在血液、血清瓊脂平板上或加有碳酸氫鈉的瓊脂平板上，于10%~20%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，也可形成莢膜。莢膜比菌體更耐腐敗，因此在腐敗組織中往往不見(jiàn)菌體而只見(jiàn)“菌影”（莢膜的輪廓）。在人工培養(yǎng)物內(nèi)和自然界中，一般不形成莢膜，常呈長(zhǎng)鏈狀。能形成卵圓形芽孢，芽孢位于菌體中央。形成芽孢的條件：氧氣充足、溫度適宜(25℃~30℃)。Gram’sstainofBacillusanthracisB.anthracis

：Gram-positive,encapsulated,spore-forming,zoonotic,rodprokaryote.

Anthrax.Toluidineblue（甲苯胺藍(lán)）stain.Bacillusanthracisinabovinespleen.Anthraxbacilliintissueseeninshortchainssurroundedbyacommoncapsule.Colouredscanning,electronmicrograph(SEM)ofanthraxbacteria(Bacillusanthracis),thecauseofthediseaseanthraxinhumansandlivestock.Colouredscanningelectronmicrograph(SEM)ofBacillusanthracisspores.

二、生物學(xué)特性（二）培養(yǎng)特性本菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不嚴(yán)格，在一般培養(yǎng)基上即可生長(zhǎng)。生長(zhǎng)溫度范圍14℃~44℃，最適溫度30℃~37℃。pH范圍6.0~8.5，最適pH7.2~7.6。普通瓊脂：強(qiáng)毒株18~24h形成扁平、粗糙、表面干燥、灰白色、不透明、邊緣不整齊的火焰狀菌落，在低倍顯微鏡下，可見(jiàn)菌落邊緣呈卷發(fā)狀，用接種針探觸，有粘滯感，挑之，可拉起絲。弱毒株或無(wú)毒株形成光滑菌落，菌落稍小而隆起，邊緣較整齊。二、生物學(xué)特性（二）培養(yǎng)特性普通肉湯：管底有絮狀沉淀物，整個(gè)培養(yǎng)液澄清，如輕輕搖動(dòng)試管，可見(jiàn)沉淀物卷繞成團(tuán)，往上升起。不形成菌膜或菌環(huán)。血瓊脂平板：菌落周?chē)鸁o(wú)明顯的溶血環(huán)，但培養(yǎng)較久后可出現(xiàn)輕度溶血，菌落周?chē)煌该鳌＞溆姓承?，用接種針釣取可拉成絲，稱(chēng)為“拉絲”現(xiàn)象。明膠穿刺：只沿穿刺線(xiàn)生長(zhǎng)，培養(yǎng)2~3d后明膠呈漏斗狀液化，上部向外擴(kuò)展呈白色的倒立松樹(shù)狀。ColonyofBacillusanthracisbacteria炭疽桿菌在血平板上的菌落（三）生化特性本菌能分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、菊糖、蕈糖和果糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不分解乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露醇、乳糖、甘露醇、山梨醇和衛(wèi)茅醇；有些菌株可遲緩發(fā)酵甘油和水楊苷。不能利用枸櫞酸鹽；不分解尿素；能水解淀粉和乳蛋白；通?？蛇€原硝酸鹽為亞硝酸鹽；不產(chǎn)生靛基質(zhì)和硫化氫，V-P試驗(yàn)不定；苯丙氨酸脫氨酶和磷酸酯酶陰性，接觸酶陽(yáng)性；牛乳經(jīng)2~4d凝固，然后慢慢胨化。二、生物學(xué)特性AnthraxisanacuteinfectiousdiseasecausedbythebacteriumBacillusanthracis.Anthraxisprimarilyadiseaseofdomesticatedandwildanimals,particularlyherbivoressuchascattle,sheep,horses,mulesandgoats.B.anthraciswassocalledaftertheGreekwordforblackcoal('anthracis'),duetotheblacknecroticulcerscharacteristicofcutaneousanthraxinfection.Thebacteriumproducessporeswhichcansurvivedormantinthesoilformanyyearsandalthoughhumananthraxisfairlyrare,infectionoccursincidentallythroughcontactwithdiseasedanimalsorbyinhalinganthraxsporesfromcontaminatedanimalproductssuchasflesh,bones,hides,hairandexcrement.（三）血清學(xué)特性目前已知有4種抗原成分：保護(hù)性抗原、莢膜抗原、菌體抗原和芽孢抗原。1、保護(hù)性抗原：是炭疽桿菌生活過(guò)程中產(chǎn)生的一種細(xì)胞外蛋白質(zhì)，為炭疽桿菌毒素的組成部分，有免疫原性，其相應(yīng)的抗體能使動(dòng)物抵抗本菌的感染作用。2、莢膜抗原：由D-谷氨酰多肽組成，是一種半抗原，與毒力有關(guān)，僅見(jiàn)于有毒菌株；該抗原產(chǎn)生的抗體對(duì)動(dòng)物無(wú)保護(hù)作用，但具有較特異的抗原性，由此建立起用于鑒定菌種的莢膜腫脹試驗(yàn)和測(cè)定患者血清莢膜抗體的免疫熒光法等，均能獲得較好的效果。二、生物學(xué)特性（三）血清學(xué)特性1、保護(hù)性抗原：2、莢膜抗原：3、菌體抗原：有2種。一種為多糖半抗原，存在于細(xì)菌細(xì)胞壁和菌體內(nèi)，耐熱，比較穩(wěn)定，與毒力無(wú)關(guān)；常用的炭疽沉淀反應(yīng)（Ascoli反應(yīng)）就是通過(guò)檢測(cè)此抗原而判定炭疽污染的；有種的特異性，但特異性不高，能與其它需氧芽孢桿菌等發(fā)生交叉反應(yīng)。另一種是菌體蛋白質(zhì)抗原，具有對(duì)細(xì)菌自身的保護(hù)作用。4、芽孢抗原：位于芽孢的外膜，具有免疫原性和血清學(xué)診斷價(jià)值。二、生物學(xué)特性三、檢驗(yàn)（一）檢驗(yàn)程序見(jiàn)《動(dòng)物性食品檢驗(yàn)學(xué)》第六章。（二）細(xì)菌學(xué)檢查1.顯微鏡檢查：2.分離培養(yǎng)3.鑒別試驗(yàn)（三）其它檢驗(yàn)方法三、檢驗(yàn)（二）細(xì)菌學(xué)檢查1.顯微鏡檢查：取待檢材料制成涂片，用莢膜染色法及革蘭氏染色法染色后鏡檢。革蘭氏染色可見(jiàn)G+粗大桿菌。莢膜染色法菌體呈深紫色，莢膜淡紫色；堿性美蘭染色可將菌體染成藍(lán)色，莢膜為淡粉紅色。2.分離培養(yǎng)：一般分離培養(yǎng)采用血瓊脂平板。污染嚴(yán)重的標(biāo)本，可在處理后接種于炭疽桿菌選擇性瓊脂平板，如戊烷脒血瓊脂平板。經(jīng)37℃10h~24h培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落檢查和鑒別試驗(yàn)。在戊烷脒血瓊脂平板上，多數(shù)其它芽孢桿菌受到抑制，而炭疽桿菌仍可生長(zhǎng)，但也受到輕度抑制。菌落生長(zhǎng)較慢較小，不溶血，呈卷發(fā)狀。三、檢驗(yàn)（二）細(xì)菌學(xué)檢查3.鑒別試驗(yàn)（1）明膠穿刺：沿穿刺線(xiàn)形成白色的倒立松樹(shù)狀生長(zhǎng)，可證實(shí)為炭疽桿菌。（2）串珠試驗(yàn)：在適當(dāng)濃度的青霉素（0.05~0.5IU/mL）作用下，炭疽桿菌細(xì)胞壁粘肽的合成被抑制，使菌體膨大，形成大而均勻的圓球狀，類(lèi)似串珠。這種現(xiàn)象為炭疽桿菌所特有，可與其它需氧芽孢菌鑒別，且與常規(guī)檢查符合率高達(dá)80%~90%。常用方法有肉湯法和瓊脂薄片法。（3）串珠熒光抗體染色法：本法結(jié)合了串珠試驗(yàn)和熒光抗體染色法的特點(diǎn)，具有雙重特異性，有助于與其它需氧菌的區(qū)別。三、檢驗(yàn)（三）其它檢驗(yàn)方法

1.莢膜熒光抗體染色法

2.莢膜腫脹試驗(yàn)

3.Ascoli’s反應(yīng)（環(huán)狀沉淀試驗(yàn)）1902年Ascoli首次提出，一直被廣泛應(yīng)用。適用于疑似炭疽死亡動(dòng)物的病料、干的皮張、陳舊及污染嚴(yán)重的炭疽病料等。特異性和敏感性較差，因此其應(yīng)用有一定局限性。4.乳膠凝集試驗(yàn)5.青霉素抑制試驗(yàn)每1mL培養(yǎng)基中含青霉素10IU時(shí)，可抑制炭疽桿菌的生長(zhǎng)，而其它需氧芽孢桿菌生長(zhǎng)不受影響。6.噬菌體裂解試驗(yàn)

第四節(jié)布魯菌檢驗(yàn)

Examinationof

Brucella一、布魯菌與布魯菌病二、布魯菌的生物學(xué)特性三、檢驗(yàn)布魯菌（Brucella）是人獸共患的布魯氏菌病病原體，牛、羊、豬等動(dòng)物最易感染。我國(guó)流行的主要是羊、牛（馬耳他）、豬三種布魯氏菌，其中以羊布魯氏菌病最為多見(jiàn)。該細(xì)菌主要感染懷孕動(dòng)物，侵入生殖器官和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，并感染胚胎和胎兒，多導(dǎo)致胎兒死亡并流產(chǎn)；公畜主要表現(xiàn)為睪丸炎。人患病主要是由畜傳染，人與人之間傳染機(jī)會(huì)極少，感染途徑主要是通過(guò)皮膚、消化道、呼吸道、眼結(jié)膜和生殖器官。人感染后潛伏期2~3周，由于本菌具有莢膜，能抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬，并能在該細(xì)胞內(nèi)增殖，反復(fù)出現(xiàn)菌血癥，病人出現(xiàn)發(fā)熱、無(wú)力等癥狀，且呈波浪式發(fā)熱，故在臨床上稱(chēng)為波浪熱。一、布魯菌與布魯菌病人類(lèi)接觸帶菌動(dòng)物或食用病畜及其乳制品，均可被感染。布魯菌病最危險(xiǎn)之點(diǎn)是患畜幾乎不表現(xiàn)癥狀，但能通過(guò)分泌物和排泄物(乳、精子、陰道分泌物、糞、尿)不斷向外排菌，待別是隨流產(chǎn)胎兒、胎衣和羊水排出大量病原菌，成為最危險(xiǎn)的傳染源。本菌在自然界中抵抗力較強(qiáng)，在病畜臟器和分泌物中，一般能存活4個(gè)月左右，在食品中約能生存2個(gè)月。在水、土、糞、尿中存活3個(gè)月，在皮毛上存活1~4個(gè)月，在凍肉中存活2~7周，在乳中存活10天至1年。對(duì)低溫的抵抗力也強(qiáng)，對(duì)熱和消毒劑抵抗力弱。對(duì)鏈霉素、氯霉素和四環(huán)素等均敏感。一、布魯菌與布魯菌病Brucella

isnamedafterSirDavidBrucewho,in1886,firstisolatedtheorganismfromthespleenofasoldieratpost-mortem（尸檢）withwhatwasthencalledMaltafever.ThegenusBrucella

currently

containssixspecies:B.melitensis,B.abortus,B.canis,B.ovis,B.suisandB.neotomae,whichvaryintheirabilitytoinfecthostanimals.Brucellosis,Hygromas（水囊瘤）onthekneejoints.ThisconditionmaybeasequeltoBrucellaabortusinfection.一、布魯菌與布魯菌病布魯菌病引起的流產(chǎn)一、布魯菌與布魯菌?。ㄒ唬┬螒B(tài)染色特性布魯菌初分離時(shí)為微小球桿菌，繼代后，牛和豬布魯菌可逐漸變?yōu)闂U狀，羊布魯菌仍為小球桿狀。平均大小為0.6~1.5μm×0.5~0.7μm。不形成芽孢，無(wú)鞭毛，無(wú)動(dòng)力。常單個(gè)存在。光滑型菌有莢膜。革蘭氏染色陰性?？杀凰袎A性染料著色，不呈兩極濃染。柯氏染色法（沙黃與孔雀綠對(duì)染）染色，本菌為鮮紅色，其它雜菌被染成綠色。二、生物學(xué)特性布魯菌（Gram’sstain）二、生物學(xué)特性ScanningElectronMicrographofBrucellaabortus：causesbrucellosisfever(alsoknownasundulantorMaltafever).

SEMofBrucellamelitensis

－Gram-negative,aerobic,coccobacillusprokaryote;Magnification:x3,600.

Magnification:x3,900.（二）培養(yǎng)特性專(zhuān)性需氧，但許多菌株初次分離時(shí)需5%~10%的CO2環(huán)境。適宜溫度為35~38℃，適宜pH為6.6~7.4。布魯氏菌的培養(yǎng)特點(diǎn)是生長(zhǎng)緩慢，尤其是新分離株初次分離時(shí)在48h前罕見(jiàn)菌落形成，往往需要5~10d甚至20~30d。傳代適應(yīng)后48h可見(jiàn)生長(zhǎng)。對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格，需某些氨基酸、血清、血液或組織浸液。血清葡萄糖肉湯和血清葡萄糖瓊脂可支持所有種和大多數(shù)菌株生長(zhǎng)。二、生物學(xué)特性在血清肝湯瓊脂上2~3d后形成濕潤(rùn)、閃光、無(wú)色、圓形、表面隆起、邊緣整齊的小菌落。在血液肝湯瓊脂上菌落灰白，不溶血。在高層血清瓊脂培養(yǎng)3~6d后，牛型及綿羊型于瓊脂表面0.5cm處呈帶狀生長(zhǎng)。而在馬鈴薯斜面上本菌生長(zhǎng)良好，2~3d后長(zhǎng)出微棕黃色菌苔，色素溶于基質(zhì)。在肉肝湯中一般需2~3d才可見(jiàn)生長(zhǎng)。肉湯輕微渾濁，無(wú)菌膜。1周后產(chǎn)生灰白色粘稠沉淀物。老齡培養(yǎng)物中有時(shí)可見(jiàn)菌環(huán)。二、生物學(xué)特性BrucellamelitensisonSBA,48hrs（三）生化特性多數(shù)菌株可分解葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等，但分解能力低，產(chǎn)酸少，很難檢測(cè)。本菌不液化明膠；不產(chǎn)生靛基質(zhì)；不凝固牛乳；能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；接觸酶陽(yáng)性；MR試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)陰性；H2S試驗(yàn)不定。

二、生物學(xué)特性WeakureareactionofB.melitensis

at24honChristensens’sagar（四）血清學(xué)特性本菌抗原結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，就目前所知，布魯氏菌有表面抗原（A、M、R）、亞表面抗原和深部抗原3類(lèi)。1.A、M抗原光滑型菌株的表面抗原主要是A（流產(chǎn)型）和M（馬耳他型）抗原，為細(xì)胞壁脂多糖的大分子復(fù)合物，既是這些細(xì)菌的凝集原，也是種和型鑒定的重要依據(jù)。流產(chǎn)布魯氏菌A﹕M為20﹕1，馬耳他布魯氏菌為1﹕20，豬布魯氏菌為4﹕1。2.R抗原非光滑型菌株除A、M抗原外，均還具有R抗原，為細(xì)胞壁上低蛋白含量的脂多糖復(fù)合物。絕大多數(shù)非光滑型菌株的R抗原是相同的，其抗血清可與羊布魯氏菌和犬布魯氏菌發(fā)生凝集，而不與光滑型布魯氏菌凝集。

二、生物學(xué)特性1）B.abortusprimarilyinfectscattlebutistransmittedtobuffaloes,camels,deer,dogs,horses,sheepandman.2）B.melitensiscausesahighlycontagiousdiseaseinsheepandgoatsalthoughcattlecanbeinfected.Itisthemostimportantspeciesinhumaninfection.3）B.suiscoversawiderhostrangethanmostotherBrucella

species.Thisspecieshas5biovars.Allbiovarscanbetransmittedtomanwiththepossibleexceptionofbiovar2.sixspeciesofBrucellaB.abortus

B.melitensis

B.suis4）B.caniscausesepididymo-orchitisinthemaledogandabortionandmetritisinthebitch.Ithasnotbeenreportedinotheranimalspeciesexceptman.5）B.ovisisresponsibleforepididymitisinramsandoccasionallyabortioninewes,butdoesnotinfectotheranimalsorman.6）B.neotomaeisonlyknowntoinfectthedesertwoodrat（沙林鼠）undernaturalconditions,andnoothercaseshavebeenreported.sixspeciesofBrucella三、檢驗(yàn)一）檢驗(yàn)程序

見(jiàn)《動(dòng)物性食品檢驗(yàn)學(xué)》第六章。二）細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定

首先要注意安全，防止人員感染和環(huán)境污染，其次要特別注意滿(mǎn)足布魯氏菌的營(yíng)養(yǎng)要求。1.細(xì)菌的分離培養(yǎng)：SDA（血清葡萄糖瓊脂），對(duì)污染樣品則接種在選擇培養(yǎng)基（加有抗生素的SDA）上。也可將檢樣接種于含2%（W/V）檸檬酸鈉和抗生素的SDB中，經(jīng)37℃培養(yǎng)2~3d（必要時(shí)補(bǔ)充5~10%的CO2）后再于SDA上分離培養(yǎng)約6d，直到出現(xiàn)可見(jiàn)菌落。

三、檢驗(yàn)二）細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定

1.細(xì)菌的分離培養(yǎng)：2.布魯菌的鑒定分型：在必要時(shí)進(jìn)行布魯菌的鑒定分型。常規(guī)方法有：

CO2需求的檢查，

H2S產(chǎn)生量的測(cè)定，染料抑菌試驗(yàn)，

A、M、R血清凝集試驗(yàn)，

Tb噬菌體裂解試驗(yàn)。三、檢驗(yàn)三）血清學(xué)檢驗(yàn)用血清學(xué)試驗(yàn)診斷人、畜布魯菌病仍是當(dāng)前主要手段。常用的方法有10多種，其中用于人布病診斷的主要有試管凝集試驗(yàn)、二巰基乙醇試管凝集試驗(yàn)、抗球蛋白試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)，用于動(dòng)物診斷的主要方法是試管凝集試驗(yàn)、平板凝集試驗(yàn)、虎紅平板凝集試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等。（1）平板凝集試驗(yàn)(Plateagglutinationtest,PAT)（2）虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)（3）試管凝集試驗(yàn)(SAT)：（4）抗人免疫球蛋白試驗(yàn)(Coomb’s反應(yīng))（5）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(Complimentfixationtest,CFT)第五節(jié)結(jié)核分支桿菌檢驗(yàn)

Mycobacteriumtuberculosis一、結(jié)核分支桿菌與結(jié)核病結(jié)核分支桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）俗稱(chēng)結(jié)核桿菌，可引起人和牛（主要是奶牛）、豬、禽類(lèi)的結(jié)核病。該菌是一類(lèi)細(xì)長(zhǎng)略彎曲的微生物，有時(shí)有分枝或出現(xiàn)絲狀體。目前在分類(lèi)學(xué)上已將分枝桿菌屬歸納于放線(xiàn)菌中。主要有人型、牛型、禽型、

鼠型和冷血?jiǎng)游镄图胺侵扌?。已知人型、牛型和非洲型?duì)人有致病性。禽型可能也對(duì)人致病。一、結(jié)核分支桿菌與結(jié)核病牛，特別是奶牛對(duì)結(jié)核桿菌最易感。牛常見(jiàn)的結(jié)核病是肺、乳房、淋巴結(jié)結(jié)核，有時(shí)可見(jiàn)腸、生殖器、漿膜結(jié)核及全身性結(jié)核。豬主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)核，最?；疾〉牟课皇穷M下、咽、頸及腸系膜淋巴結(jié)。禽類(lèi)主要對(duì)禽型結(jié)核桿菌敏感，主要侵害肝、脾等。人的結(jié)核以肺結(jié)核最為常見(jiàn)，此外有淋巴結(jié)核、腸結(jié)核、骨結(jié)核等。據(jù)WHO報(bào)道，每年約有800萬(wàn)新病例發(fā)生，至少有300萬(wàn)人死于該病。一、結(jié)核分支桿菌與結(jié)核病人感染結(jié)核病，除通過(guò)呼吸道途徑外，還可通過(guò)動(dòng)物性食品尤其是污染的牛乳經(jīng)消化道而感染，病畜肉對(duì)人也有一定威脅。因此，牛乳或肉食品中的結(jié)核桿菌污染以及奶牛等畜禽的結(jié)核病在食品衛(wèi)生方面具有重要意義，是預(yù)防人類(lèi)結(jié)核病的重要環(huán)節(jié)。一、結(jié)核分支桿菌與結(jié)核病In1882,afewyearsafterhediscoveredthebacillusresponsibleforanthrax,GermanphysicianRobertKoch(1843-1910)publishedhisstudiesrevealingtheorganismbehindTB,Mycobacteriumtuberculosis.Suddenly,contaminatedrawmilk,andit'sroleininfantmortality,becamealotclearer.二、生物學(xué)特性（一）形態(tài)與染色特性

結(jié)核分枝桿菌為細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲、兩端鈍圓的桿菌，長(zhǎng)1~4μm，寬0.2~0.5μm。牛分枝桿菌則比較粗短。無(wú)芽孢，無(wú)動(dòng)力。在陳舊培養(yǎng)物或干酪化的淋巴結(jié)中可看到分枝狀。分枝桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞壁脂質(zhì)含量較高，約占干重的60%，特別是有大量分枝菌酸(mycolicacid)包圍在肽聚糖層的外面，可影響染料的穿入，若經(jīng)加溫或延長(zhǎng)染色時(shí)間而著色后能抵抗強(qiáng)脫色劑鹽酸乙醇的脫色，故又稱(chēng)抗酸桿菌(acid-fastbacilli)。二、生物學(xué)特性（一）形態(tài)與染色特性

分枝桿菌一般用齊尼（Ziehl-Neelsen)抗酸染色法，以5%石炭酸復(fù)紅加溫染色后可以染上，但用3%鹽酸乙醇不易脫色。若再加用美藍(lán)復(fù)染，則分枝桿菌呈紅色，而其他細(xì)菌和背景中的物質(zhì)為藍(lán)色。近年發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞壁外尚有一層莢膜。一般因制片時(shí)遭受破壞而不易看到。若在制備電鏡標(biāo)本固定前用明膠處理，可防止莢膜脫水收縮，在電鏡下可看到菌體外有一層較厚的透明區(qū)，即莢膜。莢膜對(duì)結(jié)核分枝桿菌有一定的保護(hù)作用。

（二）培養(yǎng)特性專(zhuān)性需氧。最適溫度為37℃，低于30℃不生長(zhǎng)。對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，必須在含有血清或卵黃、某些無(wú)機(jī)鹽和碳源的特殊培養(yǎng)基上才能生長(zhǎng)。即使在最適條件下生長(zhǎng)仍很緩慢，需10~20d才能在固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)可見(jiàn)菌落。常用的有羅氏（Lowenstein-Jensen）固體培養(yǎng)基。菌落為淺黃色，小而干燥，不透明，表面粗糙、皺縮，形似菜花心。在液體培養(yǎng)基中一般1～2周即可生長(zhǎng)，可形成菌膜，加入吐溫-80（Tween-80）等表面活性劑，則可提高細(xì)菌生長(zhǎng)率，并使其均勻生長(zhǎng)。二、生物學(xué)特性（三）生化特性各型結(jié)