第三章 微生物學(xué)質(zhì)量控制

第三章

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物學(xué)及寄生蟲控制

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是指經(jīng)人工培育或人工改造，對其攜帶的微生物和寄生蟲實(shí)行控制、遺傳背景明確或來源清楚，并飼養(yǎng)在相應(yīng)的環(huán)境設(shè)施內(nèi)，用于科學(xué)研究、教學(xué)、生物制品或藥品檢定，以及其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量控制包括：微生物、寄生蟲學(xué)質(zhì)量控制遺傳學(xué)質(zhì)量控制營養(yǎng)學(xué)質(zhì)量控制環(huán)境質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按微生物學(xué)控制的分類

根據(jù)微生物和寄生蟲的凈化程度,GB/T14922.2-2011版國家標(biāo)準(zhǔn)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四級：一級：普通級動(dòng)物(Conventionalanimal,CV)二級：清潔動(dòng)物(Cleananimal,CL)三級：無特定病原體動(dòng)物

(Specificpathogenfreeanimal,SPF)四級：無菌動(dòng)物(Germfreeanimal,GF)和悉生動(dòng)物(Gnotobioticanimal,GN)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級GB/T14922.2-2011版國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：小鼠清潔級SPF級無菌級大鼠清潔級SPF級無菌級地鼠普通級清潔級SPF級無菌級豚鼠普通級清潔級SPF級無菌級家兔普通級清潔級SPF級無菌級犬普通級SPF級猴普通級SPF級大、小鼠取消了普通級。第一節(jié)普通級動(dòng)物

（Conventionalanimal,簡稱CV動(dòng)物）定義：是指不攜帶國標(biāo)所規(guī)定的人獸共患病病原體和動(dòng)物烈性傳染病病原體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在我國又被稱為一級動(dòng)物，是微生物學(xué)控制要求最低的動(dòng)物。飼養(yǎng)條件：開放環(huán)境來源：經(jīng)微生物學(xué)檢查不帶有上述病原體的動(dòng)物，或二三級動(dòng)物放在開放環(huán)境中飼養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)成本低，一般場所即可飼養(yǎng)。普通動(dòng)物特點(diǎn)：1、微生物學(xué)特點(diǎn)要求最低，不攜帶所規(guī)定的人獸共患病病原和動(dòng)物烈性傳染病的病原。2、飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)于開放系統(tǒng)。但仍然對溫度（18~29℃）、濕度（40%~70%）、飼料、墊料、飲水、衛(wèi)生等有一定控制。3、生理學(xué)特點(diǎn)外觀健康，飲食排泄正常，無異常分泌物，無臨床癥狀，臟器無眼觀病灶。普通動(dòng)物的應(yīng)用：多用于生物醫(yī)學(xué)中教學(xué)示教；或作為某些科學(xué)研究為探索方法而從事的預(yù)試驗(yàn)之用；豚鼠、兔、犬、猴等大動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究;不可用于疫苗的生產(chǎn)和檢定。第二節(jié)清潔動(dòng)物

（Cleananimal，簡稱CL動(dòng)物）定義：除普通動(dòng)物應(yīng)排除的病原外，不攜帶對動(dòng)物危害大和對科學(xué)研究干擾大的病原體。是根據(jù)我國國情而設(shè)定的等級動(dòng)物。來源：SPF動(dòng)物、無菌動(dòng)物、悉生動(dòng)物或剖腹產(chǎn)動(dòng)物清潔級動(dòng)物的特點(diǎn)：清潔級動(dòng)物比普通級動(dòng)物要求排除的微生物和寄生蟲多,但比SPF動(dòng)物少。清潔級動(dòng)物除肉眼觀察無病外，尸體解剖時(shí)，主要臟器、組織無論是肉眼觀看還是病理組織切片均應(yīng)無病變。

清潔級動(dòng)物的飼養(yǎng)管理

清潔級動(dòng)物飼養(yǎng)于溫濕度恒定的萬級空氣凈化的屏障系統(tǒng)中。其所用的飼料、墊料、飲用水、籠器具等都經(jīng)過消毒滅菌處理。工作人員需換滅菌工作服、鞋、帽、口罩等進(jìn)入動(dòng)物室進(jìn)行操作。

清潔級動(dòng)物的應(yīng)用：清潔級動(dòng)物是根據(jù)我國國情而設(shè)立的等級動(dòng)物。它較普通級動(dòng)物健康，又較SPF級動(dòng)物易達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可免受動(dòng)物疾病的干擾，其敏感性與重復(fù)性亦較好。目前在我國已成為適用于科研的標(biāo)準(zhǔn)級別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。第三節(jié)無特定病原體動(dòng)物

（Specificpathogenfreeanimal，簡稱SPF動(dòng)物)定義：動(dòng)物機(jī)體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在，但帶有非特定的微生物和寄生蟲的動(dòng)物。最初來源：來源于無菌動(dòng)物、悉生動(dòng)物

SPF動(dòng)物特點(diǎn)：SPF動(dòng)物除一、二級動(dòng)物應(yīng)排除的病原體外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對研究實(shí)驗(yàn)干擾大的病原。

SPF動(dòng)物的飼養(yǎng)管理

必須飼養(yǎng)在溫濕度恒定的萬級空氣凈化的屏障系統(tǒng)中，實(shí)行嚴(yán)格的微生物控制。飼育設(shè)施有：SPF級動(dòng)物房、超凈生物層流架、IVC獨(dú)立送風(fēng)系統(tǒng)、帶空氣過濾帽的飼養(yǎng)盒。屏障系統(tǒng)內(nèi)（大規(guī)模生產(chǎn)），隔離器內(nèi)保種。

【上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司】【中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心】【國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心】

IVC獨(dú)立送風(fēng)系統(tǒng)IVC盒SPF動(dòng)物的應(yīng)用：

目前國際上公認(rèn)SPF動(dòng)物適用于所有科研實(shí)驗(yàn)，是國際標(biāo)準(zhǔn)級別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1、醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究

2、血清、疫苗生產(chǎn)

3、生物學(xué)鑒定工作第四節(jié)

無菌動(dòng)物（Germfreeanimal

簡稱GF）定義：用現(xiàn)有的檢測技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)外的任何部位均檢不出任何活的微生物和寄生蟲的動(dòng)物。來源：第一代通過無菌剖腹產(chǎn)術(shù)或無菌卵的孵化，以后通過無菌動(dòng)物雌雄交配繁殖或無菌剖腹產(chǎn)術(shù)，保姆鼠代奶擴(kuò)群。無菌動(dòng)物的發(fā)展概況種類培育者及育成時(shí)間小鼠Pleasants,1959大鼠Reyniers1946；Gustafsson,1948豚鼠Miyakawa1958;Tanami,1959;兔Wostmann1959;Luckey,1963狗Glimsedt,1946貓Bleby,1969山羊、綿羊Smith,1961,1966豬Whitenair,1960馬Drummond等,1973猴Reyniers,1942雞Reyniers,1943鵪鶉Woodard等,1965;Miles,1966無菌動(dòng)物特點(diǎn)：1.形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：消化系統(tǒng)

(1)盲腸肥大，它的總重量是普通動(dòng)物的

5-10倍。

(2)腸道肌層薄，腸絨毛變細(xì)變短

血液循環(huán)系統(tǒng)

(1)心臟變小

(2)白細(xì)胞數(shù)變少，且數(shù)量波動(dòng)范圍小免疫系統(tǒng)

(1)胸腺、淋巴組織、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)育不良

(2)脾臟縮小，無二級濾泡，網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞功能下降。免疫功能基本處于原始狀態(tài)。2.生理學(xué)特點(diǎn)：壽命無菌動(dòng)物的壽命普遍長于普通動(dòng)物，如大鼠正常2-3年，無菌達(dá)4年。營養(yǎng)和代謝體內(nèi)不能合成維生素B和K，易產(chǎn)生這兩種維生素的缺乏癥無菌動(dòng)物血中含氮量少，腸管對水的吸收率低，代謝周期比普通動(dòng)物長

生長率

不同種屬不一樣．

(1)無菌鳥類生長率高于同種普通鳥

(2)無菌大、小鼠與普通鼠差不多

(3)無菌豚鼠和無菌兔比普通的慢生殖無菌條件對動(dòng)物的生殖影響不大。

(1)無菌大、小鼠略高于普通大小鼠

(2)豚鼠和兔繁殖能力比普通級低抗輻射能力無菌動(dòng)物抗輻射能力強(qiáng)，抗實(shí)驗(yàn)性燙傷和抗休克死亡能力也強(qiáng)于普通動(dòng)物。免疫功能

(1)血清中IgG、IgM水平低，幾乎不存在丙種球蛋白和特異性抗體

(2)免疫應(yīng)答速度慢，過敏反應(yīng)、對異體移植物的排斥反應(yīng)以及自身免疫現(xiàn)象消失或減弱無菌動(dòng)物在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

1、微生物學(xué)研究

(1)病因?qū)W的研究

(2)微生物間的拮抗作用

(3)病毒性疾病研究

(4)真菌感染研究

２、免疫學(xué)研究

無菌動(dòng)物體內(nèi)既無抗原也無特異性抗體，處于一種“原始狀態(tài)”，很適合用于各種免疫功能的研究。如，無菌動(dòng)物暴露于微生物，先產(chǎn)生α球蛋白，再產(chǎn)生β球蛋白，最后產(chǎn)生γ球蛋白。制備高效價(jià)，無交叉反應(yīng)的特異性抗體。

３、腫瘤學(xué)研究制備人體腫瘤模型需要免疫抑制動(dòng)物，而普通動(dòng)物給予免疫抑制劑后常繼發(fā)感染死亡，所以可以應(yīng)用無菌動(dòng)物?？梢匝芯看怪眰魅镜闹掳┎≡?，如白血病病毒。研究致癌物質(zhì)的致癌作用和微生物的關(guān)系。４、老年病學(xué)研究無菌動(dòng)物普遍壽命比普通動(dòng)物長，說明微生物和機(jī)體老化有關(guān)。普通大鼠壽命2年，而無菌大鼠壽命3-4年。５、營養(yǎng)學(xué)的研究無菌動(dòng)物是研究營養(yǎng)的良好模型，很多營養(yǎng)成分是靠細(xì)菌產(chǎn)生的。如VB和VK是靠腸道細(xì)菌合成的，無菌動(dòng)物體內(nèi)不能合成VB和VK，所以可以用來研究哪些細(xì)菌合成了哪些維生素。６、放射醫(yī)學(xué)研究無菌動(dòng)物可以耐受大劑量的放射線照射。可用區(qū)別放射引起的癥狀和繼發(fā)感染的癥狀。７、毒理學(xué)研究藥物的毒理作用常常與腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物有關(guān)。用無菌動(dòng)物進(jìn)行研究，可以準(zhǔn)確地分析藥物的毒理作用和藥物的合理使用。８、心血管病研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)腸道微生物可以分解膽汁酸，降低血液中膽固醇水平。９、宇航中的應(yīng)用可以用來攜帶地外微生物。

因飼養(yǎng)環(huán)境的局限性，無菌動(dòng)物主要用于某些特殊實(shí)驗(yàn)研究無菌動(dòng)物的飼料及飼養(yǎng)環(huán)境飼料：60Co照射墊料、飲水及其他用品必須經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌消毒。注意維生素B、維生素K的補(bǔ)充。飼養(yǎng)條件：必須飼養(yǎng)在與自然界完全隔離的無菌隔離器內(nèi)。無菌動(dòng)物的檢查第五節(jié)

悉生動(dòng)物（Gnotobiotic

animal，簡稱GN）定義：又稱已知菌動(dòng)物，指動(dòng)物體內(nèi)帶有明確的

微生物種類的動(dòng)物。飼養(yǎng)條件：無菌隔離器內(nèi)來源：人為將已知的微生物投給無菌動(dòng)物，使其體內(nèi)帶有已知菌單菌動(dòng)物雙菌動(dòng)物多菌動(dòng)物悉生動(dòng)物特點(diǎn)：微生物特點(diǎn)：體內(nèi)攜帶有已知微生物來源：無菌動(dòng)物植入微生物飼養(yǎng)管理：

必須飼養(yǎng)在溫濕度恒定的百級空氣凈化的隔離系統(tǒng)中，實(shí)行嚴(yán)格的微生物控制。悉生動(dòng)物腸道內(nèi)存在細(xì)菌可以合成維生素，不會(huì)像無菌動(dòng)物一樣發(fā)生維生素缺乏癥。抵抗力、生活力較強(qiáng)，易于飼養(yǎng)管理。悉生動(dòng)物的應(yīng)用目前廣泛應(yīng)用于傳染性疾病、代謝性疾病等的病因?qū)W的研究，還有微生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤、骨髓移植等方面。悉生動(dòng)物的飼養(yǎng)管理必須飼養(yǎng)在溫濕度恒定的百級空氣凈化的隔離系統(tǒng)中，實(shí)行嚴(yán)格的微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)控制。飼養(yǎng)管理方法與無菌動(dòng)物相同。第六節(jié)

潔凈動(dòng)物與普通動(dòng)物的比較潔凈動(dòng)物通常是指來源于剖腹產(chǎn)、實(shí)行嚴(yán)格的微生物控制、飼養(yǎng)于空氣凈化系統(tǒng)設(shè)施內(nèi)的動(dòng)物，包括清潔動(dòng)物、SPF動(dòng)物、悉生動(dòng)物和無菌動(dòng)物。潔凈動(dòng)物與普通動(dòng)物相比，在很多方面均存在差異。一、微生物控制比較種類飼育環(huán)境說明無菌動(dòng)物隔離系統(tǒng)無法檢出任何生命體悉生動(dòng)物隔離系統(tǒng)確知帶有的微生物SPF動(dòng)物屏障系統(tǒng)確知不帶有的微生物清潔動(dòng)物屏障系統(tǒng)確知不帶有的微生物普通動(dòng)物開放系統(tǒng)微生物情況不明確二、對科研實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的比較實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目GFSPFCLCV傳染病無無無未知寄生蟲無無無未知試驗(yàn)結(jié)果明確明確明確有疑問用動(dòng)物數(shù)少少較少多或大量統(tǒng)計(jì)價(jià)值很好可能好較好不準(zhǔn)確長期實(shí)驗(yàn)

好好可能好困難死亡率很少少較少高長期實(shí)驗(yàn)成活率100%90%80%40%實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)可能可能可能不可能結(jié)果討論價(jià)值很高高較高有疑問因此，使用無菌動(dòng)物、悉生動(dòng)物、SPF動(dòng)物和清潔級動(dòng)物做實(shí)驗(yàn)，由于它們有明確的微生物背景和可控的飼育環(huán)境，可大大提高動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。三、生物學(xué)特性的比較潔凈動(dòng)物與普通動(dòng)物相比，在血液學(xué)、血液生化指標(biāo)及主要臟器系數(shù)方面均產(chǎn)生一定變化。如清潔級大鼠與普通大鼠相比，白細(xì)胞較少，其中中性粒細(xì)胞少，淋巴細(xì)胞相對增加；血清堿性磷酸酶、膽紅素、膽固醇值較高;尿素氮、肌酐值比較低；空腸淋巴結(jié)、脾臟較輕；肺、腎組織形態(tài)比普通大鼠健康。四、潔凈動(dòng)物的培育一、無菌動(dòng)物的培育無菌動(dòng)物的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)：胎盤屏障和屏障觀念。1、無菌手術(shù)小哺乳動(dòng)物動(dòng)物：子宮切除術(shù)（剖腹產(chǎn)）大哺乳動(dòng)物動(dòng)物：子宮切開術(shù)（剖腹產(chǎn)）鳥類：消毒卵2、哺乳人