第二章 代謝調(diào)節(jié)3

酶含量的調(diào)節(jié)

（主要通過基因表達調(diào)控來影響蛋白質(zhì)含量）基因表達（geneexpression）特定核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。原核生物：基因組結(jié)構(gòu)簡單，轉(zhuǎn)錄和翻譯是在同一時空進行。真核生物：基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間上均被隔開。2.1酶蛋白的合成

大腸桿菌（E.coli）基因組約含4300個基因，只有5％高水平表達；人類基因組約含3.0萬個基因，只有2％高水平表達。其中有些基因在各種細胞內(nèi)是以恒定水平表達的，這些基因被稱為管家基因。以恒定水平表達的方式，被稱為組成性表達。

(如β-actin,G3PD)

可誘導(dǎo)基因：

這些基因需在特定環(huán)境信號刺激下才能表達，被稱為可誘導(dǎo)基因。能增強基因表達的物質(zhì)，稱為誘導(dǎo)劑（inducer）。

可阻遏基因

另有一些基因在特定環(huán)境信號刺激下，表達水平下降，稱為可阻遏基因。

能阻抑基因表達的物質(zhì)，稱為阻遏劑(repressor)。操縱子（operon）

是由功能上相關(guān)聯(lián)的多個編碼序列（結(jié)構(gòu)基因）及其上游的調(diào)控序列串聯(lián)在一起構(gòu)成的一個轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)單位。2.1.1原核生物基因表達的調(diào)控（轉(zhuǎn)錄水平）JacobandMonod(1961)Regulatorygenepromoter

operator

structuralgenes

ABC

CAPsiteIPORNA聚合酶附著部位阻遏蛋白cAMP-CAP結(jié)合部位阻遏蛋白受體部位

operon

調(diào)控序列

編碼序列多順反子mRNA

轉(zhuǎn)錄翻譯

A、B、C3個蛋白質(zhì)操縱子操縱序列啟動序列CAP位點調(diào)節(jié)基因調(diào)控序列編碼序列（結(jié)構(gòu)基因）多順反子mRNA：

功能上相關(guān)聯(lián)的多個結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起、被轉(zhuǎn)錄成一個mRNA、翻譯成多種蛋白質(zhì)，這種mRNA被稱為多順反子mRNA?！瓒舻鞍资荏w部位——RNA聚合酶附著部位——cAMP-CAP結(jié)合位點——表達阻遏蛋白——表達酶蛋白

2.1.1.1誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)酶蛋白合成的機理（基因表達與培養(yǎng)液中存在的碳源有關(guān)）（1）

培養(yǎng)液中存在高濃度Glc,或Glc

和Lac同時存在時，

E.coli優(yōu)先利用葡萄糖——“葡萄糖效應(yīng)”；

可以通過阻遏蛋白的負性調(diào)控，使Lac操縱子結(jié)構(gòu)基因關(guān)閉；（2）Glc被耗盡，或存在高濃度Lac時，

可以通過乳糖（別乳糖）誘導(dǎo)，使基因開啟；并需要CAP-cAMP的正性調(diào)控。培養(yǎng)液：

存在高濃度Glc,或Glc和Lac同時存在時，E.coli不利用Lac.，乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因關(guān)閉。培養(yǎng)液：Glc被耗盡，或只存在高濃度Lac時，E.coli

利用

Lac.，乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因開啟、表達。乳糖→別乳糖→作為誘導(dǎo)劑，使阻遏蛋白變構(gòu)失活→不能與操縱序列結(jié)合→RNA聚合酶發(fā)揮作用，催化結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。實驗室常用IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）作為誘導(dǎo)劑

乳糖/別乳糖是一種弱誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)能力有限，需要CAP的增強作用。即需要“Lac誘導(dǎo)＋CAP的正性調(diào)控”

CAP是別構(gòu)蛋白，需要被cAMP結(jié)合形成活性復(fù)合物，才能發(fā)揮正性調(diào)控作用。無Glc時cAMP的水平受培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的影響PDEGlucoseAC→cAMP水平↑→CAP-cAMP

與CAP位點結(jié)合

（出現(xiàn)Glc效應(yīng)的原因）高濃度GlcGlc耗盡后不能實現(xiàn)CAP-cAMP的正性調(diào)控→cAMP水平→不能激活CAP激活PDE抑制AC→分解代謝產(chǎn)物啟動Lac的誘導(dǎo)作用PDE↓、AC↑促進RNApolⅡ活性

增強基因轉(zhuǎn)錄活性

Lac操縱子基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控（要點）（1）受阻遏蛋白的負性調(diào)控和CAP的正性調(diào)控的協(xié)調(diào)作用，控制基因轉(zhuǎn)錄速率；（2）在Glc和Lac都存在時，優(yōu)先利用Glc,通過阻遏蛋白的負性調(diào)控，關(guān)閉基因；（3）Glc耗盡后，乳糖/別乳糖作為誘導(dǎo)劑，并通過

cAMP-CAP正性調(diào)控，促使基因轉(zhuǎn)錄。

2.1.1.2阻遏劑阻抑酶蛋白合成的機理調(diào)節(jié)基因表達無活性的阻遏蛋白，不能與操縱序列結(jié)合，RNA聚合酶催化基因轉(zhuǎn)錄，基因呈開放狀態(tài)。色氨酸作為輔阻遏物，與阻遏蛋白形成有活性的輔阻遏物－阻遏蛋白復(fù)合物。后者與操縱序列結(jié)合阻止RNA聚合酶移動，基因關(guān)閉。

色氨酸操縱子（Trp

operon）ROtrpRPtrpEtrpDtrpCtrpBtrpA結(jié)構(gòu)基因

調(diào)控區(qū)trpE

基因5′端的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有一段約162bp長度的前導(dǎo)序列。前導(dǎo)序列中含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個互補的短序列。Ⅲ與Ⅳ序列互補，可形成衰減子（attenuator）結(jié)構(gòu)。

在高濃度色氨酸存在下，通過形成特殊的“衰減子”結(jié)構(gòu)，對轉(zhuǎn)錄進行更加精細的負性調(diào)控。

162bp在序列Ⅰ中，第10、11位有兩個Trp密碼子?！八p子”結(jié)構(gòu)的形成與序列Ⅰ中的兩個Trp密碼子有關(guān)。

色氨酸操縱子的“衰減子”調(diào)控

“衰減”控制是原核生物普遍存在的精細而靈敏的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制2.1.2真核生物的基因表達調(diào)控1）基因表達在細胞核和胞質(zhì)不同時空中進行2）真核生物基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜（有如下特點）（1）基因組結(jié)構(gòu)龐大

3X109bp,約含3.0萬個基因,95％為非編碼區(qū)（2）由DNA、組蛋白和酸性蛋白形成超螺旋管的染色體結(jié)構(gòu)而存在（3）含大量重復(fù)序列（高度/中度/反向重復(fù)序列）

（4）結(jié)構(gòu)基因為單拷貝序列,單順反子轉(zhuǎn)錄（5）斷裂基因（內(nèi)含子、外顯子間隔排列）染色體的組裝斷裂基因（splitegene）3）基因自身結(jié)構(gòu)的改變

基因丟失基因擴增基因重排

DNA甲基化修飾(形成5M-CpG，使基因沉默)4）多環(huán)節(jié)調(diào)控

（1）基因活化

（2）轉(zhuǎn)錄水平

轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運

（3）翻譯水平

翻譯后加工、靶向運輸

CpG島的甲基化修飾，使基因沉默

2.1.2.1真核基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控

其中由DNA和組蛋白構(gòu)成核小體,作為染色體的基本單位。2.1.2.1.1組蛋白與非組蛋白

DNA真核生物染色體主要由三大類成分

組蛋白（富含Arg、Lys）非組蛋白（酸性蛋白）

DNA真核生物染色體主要由三大類成分

組蛋白（富含Arg、Lys）非組蛋白（酸性蛋白）由組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2分子組成八聚體為核心，外繞1?圈DNA雙鏈（146bp）,構(gòu)成核小體，核小體之間含1個H1組蛋白，由一條DNA鏈串連起來形成念珠樣結(jié)構(gòu)。組蛋白——呈堿性，對DNA

轉(zhuǎn)錄有阻抑作用：非組蛋白——一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控

核小體組成H1H1組蛋白H2A、H2B、H3和H4的肽鏈N末端尾,特定位點上的氨基酸殘基（如Lys/K）可發(fā)生酶促共價修飾：

如乙?；⒘姿峄?、甲基化、泛素化等，參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。目前已發(fā)現(xiàn)有100多個位點發(fā)生了共價修飾，對基因轉(zhuǎn)錄起到激活或抑制作用。已有30多種特異的組蛋白修飾抗體可供試驗。研究發(fā)現(xiàn)：組蛋白乙酰化修飾，促進基因轉(zhuǎn)錄；組蛋白去乙?；?，使基因沉默。目前研究發(fā)現(xiàn)，基因啟動子部位CpG島的DNA甲基化、組蛋白乙?；c去乙?；?，被認為是表觀遺傳修飾的主要分子機制。在各種修飾物的綜合作用下，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。2.1.2.1.2RNA聚合酶Ⅱ及轉(zhuǎn)錄起始因子

真核生物RNA聚合酶（三類）RNApolⅠ——催化合成45SrRNA前體分子；再加工為28S、18S和5.8SrRNA；RNApolⅢ——主要負責催化5SRNA、tRNA和7SRNA等小分子RNA的轉(zhuǎn)錄；RNApol

Ⅱ——催化幾乎所有編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，先轉(zhuǎn)錄生成hnRNA，再加工為mRNA。

RNApol

的作用需一大類轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)助（1）與RNApolⅡ?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄因子為TFⅡ類

（2）TFⅡ類轉(zhuǎn)錄因子有A、B、D、E、F、H、J等多種亞型（3）轉(zhuǎn)錄啟動前，TFⅡD與RNApolⅡ及其他TFⅡ類轉(zhuǎn)錄因子按一定時空順序結(jié)合先形成PIC。

（已知TFⅡ類轉(zhuǎn)錄因子參與幾乎所有轉(zhuǎn)錄過程，

又被稱為通用轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物（PIC）的形成2.1.2.1.3順式作用元件（cis-actingelements）

是指真核生物基因組中參與調(diào)控自身DNA鏈內(nèi)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄活性的特異堿基序列(調(diào)控序列)

。啟動子（promoter）增強子(enhancer)沉默子(silencer)GGGCGGTATAATCAAT-60100bp-4060bp

-2530bp

啟動子

結(jié)構(gòu)基因編碼鏈（＋）模板鏈（-）5'轉(zhuǎn)錄起始點

（＋1）

增強子3'根據(jù)順式作用元件的作用和位置又有

35（1）啟動子

位于轉(zhuǎn)錄起始點上游，能被RNApolⅡ識別、結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄的一段堿基序列。常有特殊的共有序列：

（2）增強子是增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的特異堿基序列。

（遠離轉(zhuǎn)錄起始點，位置靈活，其作用與方向、距離無關(guān)）（3）沉默子

對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用的特異堿基序列，屬于負性調(diào)控元件。共有堿基序列——TATA盒、GC盒、CAAT盒等TATA盒（核心序列）——是TFⅡD和RNAPolⅡ結(jié)合位點

34①

啟動子作用前，需要與通用轉(zhuǎn)錄因子、RNApolⅡ結(jié)合外，還需其他多種調(diào)節(jié)蛋白的參與。②

增強子必須與特異調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合后，才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強作用。根據(jù)作用性質(zhì)，又分：順式作用元件都必須與相應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合后，才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。注意：組織特異性增強子——受特異調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)誘導(dǎo)性增強子——受激素或細胞因子誘導(dǎo)而產(chǎn)生的調(diào)節(jié)蛋白③沉默子的負性調(diào)控，也必須與特異調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合后才能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

順式作用元件（啟動子、增強子、沉默子的調(diào)控作用，均需相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的參與。）CAAT盒GC盒TAAT盒（＋1

）

promoter2.1.2.1.4反式作用因子（trans-actingfactor）能直接或間接與順式作用元件相互作用，進而調(diào)控特異基因轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白,或稱轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子

（transcriptionfactor,TF）。

按其功能不同，常分以下兩大類：

基本轉(zhuǎn)錄因子

特異轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄抑制因子——與沉默子結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子——與增強子結(jié)合——指參與形成PIC的TFⅡ類調(diào)節(jié)蛋白

DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain,DBD）轉(zhuǎn)錄激活域（activatingdomain,AD）鋅指（zincfinger）結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合域(DBD)

亮氨酸拉鏈（Leuzipper）結(jié)構(gòu)螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋（helix-turn-helix,HTH）轉(zhuǎn)錄激活域（AD）——控制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成,并激活轉(zhuǎn)錄活性(富含酸性aa區(qū)、Gln區(qū)和Pro區(qū))轉(zhuǎn)錄因子兩個重要的功能結(jié)構(gòu)域

形成同源或異源二聚體，增強與DNA結(jié)合力。常有兩個或兩個以上鋅指結(jié)構(gòu)，利于插入DNA雙螺旋的深溝并與之結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)LDL-R基因的表達，需要TFII類轉(zhuǎn)錄因子、RNAPolII、多種轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用2.1.2.1.5反義RNA(antisenseRNA)MizunoandSimons(1983年)發(fā)現(xiàn):

能夠通過堿基互補與細胞內(nèi)同源mRNA（為正義RNA）結(jié)合，從而抑制mRNA翻譯為蛋白質(zhì)的RNA，稱反義RNA。1995年復(fù)旦大學Shu

Guo博士在美國康奈爾大學實驗：結(jié)果：兩組線蟲體內(nèi)的par-1基因表達均被抑制反義RNA注入線蟲體內(nèi)→以阻斷par-1基因表達正義RNA注入線蟲體內(nèi)（作對照）→期待觀察到增強效果華盛頓卡內(nèi)基研究院FireA博士注意到，Guo博士研究結(jié)果已經(jīng)不能單用反義RNA技術(shù)來解釋了，推測可能還有其它的成分參與了這一過程。純化的反義RNA純化的正義RNAdsRNA雜合體分別注入線蟲體內(nèi)

對同源mRNA表達

有弱的抑制作用

有強烈抑制作用實驗結(jié)果證實dsRNA具有強烈的阻抑基因表達的作用

FireA將dsRNA對同源mRNA表達的阻斷作用稱之為RNA干擾（RNAinterference,RNAi）。

1998年，F(xiàn)ire將實驗結(jié)果公布于Nature雜志。2006年，F(xiàn)ierAandMelloC兩人因發(fā)現(xiàn)RNA干擾機制同獲諾貝爾生理學醫(yī)學獎安德魯·法爾克雷格·梅洛參與RNAi機制幷發(fā)揮重要作用的酶蛋白

Dicer酶（特殊的RNA酶）：

將dsRNA降解成21－25個核苷酸長度的片段，后者稱為siRNA(smallinterferenceRNA)。

RISC復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex）（RISC是一種核蛋白復(fù)合物，具有螺旋酶、核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶和同源搜索區(qū)等多功能酶活性）作用：降解同源mRNA

miRNP(微小核糖核蛋白，microRNAprotein)對mRNA的翻譯進行抑制作用。

RNAi機制（基本過程）

RNAi技術(shù)的應(yīng)用1）研究基因功能尤其可以將RNAi與基因組學研究結(jié)合起來，對特異基因進行篩選，確認特異基因的功能。目前已有報道利用RNAi技術(shù)確認了磷脂酰肌醇激酶和細胞核因子－кB的信號傳導(dǎo)通路的基因。2）已發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)有數(shù)百種(microRNAs)

miRNA參與調(diào)控基因表達，參與細胞生長、發(fā)育、分化、免疫應(yīng)答等調(diào)控。3）用于疾病的治療

體外合成dsRNA,

利用RNA干擾技術(shù)對抗多種病毒感染：如抗免疫缺陷病毒（HIV）、SAS病毒等，用于在易感細胞中防治感染產(chǎn)物的生成。也用于對抗特殊的癌癥基因：如黑色素瘤、胰腺癌、白血病等。還包括心腦血管性疾病、神經(jīng)退行性變等。

RNAi技術(shù)是近幾年興起的非常有效、特異性很高的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)。

RNAi技術(shù)不僅在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中被廣泛運用，在臨床研究中，如抗病毒、抗腫瘤、藥物篩選等，也正在被廣泛采用。RNAi和miRNA孕含著巨大的科學價值和應(yīng)用前景。其他臨床或臨床前試驗：

Quark制藥公司，研制靶標是TP53基因的siRNA，用于治療急性腎衰竭Alnylam制藥公司聯(lián)合其他公司，正在研制治療高膽固醇血癥、亨廷頓舞蹈病、丙型肝炎病毒、流感等的siRNA。2.1.2.1.6RNA加工剪接

mRNA——5‘加“帽”、3’加“尾”，甲基化修飾，剪接

tRNA——形成反密碼環(huán)、加上3'－CCAOH末端，堿基修飾

rRNA——剪裁，與蛋白質(zhì)組裝成“核糖體”復(fù)合物2.1.2.2翻譯水平的調(diào)控

（1）翻譯前調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性（2）選擇性翻譯mRNA

（3）調(diào)節(jié)翻譯的起始（4）翻譯后加工eIF-2eIF-2-p(失活)eIF-2k血紅素（－）Met-tRNA

40S小亞基

mRNA60S大亞基起始復(fù)合物→啟動翻譯（珠蛋白鏈）