第十二章 遺傳工程

第十三章遺傳工程（P256）第一節(jié)遺傳工程概述

遺傳工程（P257）：指利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或產(chǎn)品，從而改良生物體的一種遺傳學(xué)手段。廣義遺傳工程包括:

細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、染色體工程、細(xì)胞器工程等。狹義遺傳工程是指:

基因工程(重組DNA技術(shù))。一、基因工程概述:

概念（P256）

：

利用人工的方法把生物的遺傳物質(zhì)在體外進(jìn)行切割、拼接和重組，獲得重組DNA分子然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞或個(gè)體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過程。

第二節(jié)基因工程20世紀(jì)70年代誕生2001年我國的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和林木已達(dá)22種，其中轉(zhuǎn)基因棉花、大豆、馬鈴薯、煙草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麥等進(jìn)行了田間試驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因棉花已經(jīng)大規(guī)模商品化生產(chǎn)?；蚬こ袒蚬こ滩僮鞯膶ο笫荄NA分子。又稱為重組DNA技術(shù)?；蚬こ淘隗w外切割、拼接，構(gòu)建重組DNA分子；將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞或生物體；使外源基因在受體內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，并使受體的遺傳特性得到修飾或改變。有性雜交和基因工程通過有性雜交實(shí)現(xiàn)遺傳重組，在獲得目標(biāo)性狀的同時(shí)常常伴有其他不需要的性狀改變。通過基因工程只轉(zhuǎn)移個(gè)別基因，只改變目標(biāo)性狀?；蚬こ膛c有性雜交相比較的優(yōu)越性：跨越物種障礙只改變個(gè)別性狀人為控制表達(dá)步驟(P257)：

①．從細(xì)胞和組織中分離DNA；②．限制性內(nèi)切酶酶切DNA分子，制備DNA片段；③．將酶切DNA分子與載體DNA連接,構(gòu)建能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制的重組DNA分子；④．把重組DNA分子引入宿主受體細(xì)胞復(fù)制；⑤．重組DNA隨宿主細(xì)胞的分裂而分配到子細(xì)胞,建立無性繁殖系(Clone)或發(fā)育成個(gè)體；⑥．從細(xì)胞群體中選出所需要的無性繁殖系或個(gè)體。二、基因工程的工具酶（P258）：

限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）

DNA連接酶

反轉(zhuǎn)錄酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）（一）限制酶（P258）：

是在識別雙鏈DNA分子中某些特定核苷酸序列的基礎(chǔ)上，切割DNA雙鏈的內(nèi)切酶。目前已分離和鑒定出200多種不同的限制酶

限制性內(nèi)切核酸酶或稱限制性酶(restrictionenzyme),是基因工程最重要的工具。在細(xì)菌中這些酶的功能是降解外來DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。這類酶能識別雙鏈DNA分子中特異的核苷酸序列，并在特定的位置將雙連DNA分子切斷。1、限制性內(nèi)切酶的命名：

根據(jù)其來自的生物名稱，用英文字母和數(shù)字表示；

如:EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)2、限制性內(nèi)切酶的類別：

第Ⅰ類酶、第Ⅱ類酶、第Ⅲ類酶共性：只切割雙鏈DNA分子，需要鎂離子激活。識別和切割位點(diǎn)：回文結(jié)構(gòu)4～6bp出現(xiàn)兩種末端：粘性末端(粘端)平頭末端(平端)

第Ⅱ類限制性酶粘性末端與平頭末端（二）DNA連接酶(P260):

催化DNA中相鄰的3’-OH和5’-磷酸基末端之間形成磷酸二脂鍵并把兩段DNA連接起來。(三）逆轉(zhuǎn)錄酶（P260）以RNA為模板來指導(dǎo)DNA合成的DNA聚合酶，又稱依賴于RNA的DNA聚合酶。在基因工程中主要用途是以mRNA為模板合成互補(bǔ)的DNA鏈（complementary,cDNA）.三、載體（P262）

載體是將外源基因送入受體細(xì)胞的工具。

可作為DNA載體的有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌或酵母菌人工染色體BAC、YAC等

（一）載體的條件(P262)：①在宿主細(xì)胞中能獨(dú)立復(fù)制，有獨(dú)立的復(fù)制起始位點(diǎn)；②.載體DNA分子中有一段不影響其復(fù)制的非必需區(qū)域，即限制酶切位點(diǎn)又稱多克隆位點(diǎn)；③.有選擇標(biāo)記，便于選擇含重組DNA分子的宿主細(xì)胞；④.相對分子質(zhì)量小，多拷貝，易于操作。PUC19質(zhì)粒（二）載體種類載體有多種，對載體的分類方法較多1、據(jù)使用目的分類（1）克隆載體：繁殖目的基因，稱克隆載體（2）表達(dá)載體：表達(dá)目的基因

2、據(jù)載體來源分（1）質(zhì)粒

（2）噬菌體如:λ-噬菌體（3）人工載體：YAC、BAC(1)質(zhì)粒載體(P264)：

質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體外存在的一種能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子。

質(zhì)粒具有重組表型檢測標(biāo)記，檢測是否攜帶外源DNA片段。

如pUC18質(zhì)粒具有以下特點(diǎn)(P280)：①.

分子量小，可接受較大外源片段(<10Kb)；②.拷貝數(shù)多，每個(gè)細(xì)胞中有500個(gè)；③.克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)多，克隆方便；④.具有a－互補(bǔ)顯色表型，用于檢測重組質(zhì)粒的選擇標(biāo)記。缺點(diǎn)：質(zhì)粒攜帶的外源基因小于10Kb互補(bǔ)

在質(zhì)粒載體上帶有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中含有－半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和頭146個(gè)氨基酸的編碼序列。在這一編碼區(qū)中插入有一個(gè)多克隆位點(diǎn)。細(xì)菌細(xì)胞含有野生質(zhì)粒（沒有外源DNA插入），在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，易于識別。當(dāng)外源片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，lacZ基因失去功能，不能代謝X-gal因此，帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落(陽性克隆)。細(xì)菌是否攜帶質(zhì)粒的篩選：質(zhì)粒攜帶氨芐青霉素抗性基因。在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素。攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌保留下來，不攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞被殺死。質(zhì)粒載體的篩選：細(xì)菌是否攜帶質(zhì)粒？質(zhì)粒是否攜帶外源DNA？質(zhì)粒是否攜帶外源DNA的篩選（互補(bǔ)顯色反應(yīng)）:如果質(zhì)粒不帶外源DNA，lacZ基因的產(chǎn)物能夠參與形成完整的β－半乳糖苷酶；該酶能把培養(yǎng)基中的X－gal（5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷）分解成半乳糖和5－溴－4－氯靛藍(lán)；5－溴－4－氯靛藍(lán)呈深藍(lán)色。如果質(zhì)粒攜帶外源DNA，則lacZ基因被破壞，細(xì)胞不能形成完整的β－半乳糖苷酶，菌落呈白色。(2)病毒載體（P281）

以λ噬菌體為例：基因組全長48kb。噬菌體DNA中間約2/3的序列為中間基因簇，位于兩端的為DNA左、右臂。中間基因簇可被外源DNA替代而不影響浸染細(xì)菌的能力。能接受15-23kb外源DNA片段，既可做克隆載體又可做表達(dá)載體。

(3)克隆大片段DNA的載體：

以細(xì)菌人工染色體（BAC）為例：

F因子經(jīng)基因工程改造成BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。

特點(diǎn)：

帶有外源DNA的BAC載體在細(xì)胞中是單拷貝的；多克隆位點(diǎn)。載體本身分子量很小(7.4kb)；選擇標(biāo)記：氯霉素抗性基因；

四、DNA的體外重組1.體外通過限制性內(nèi)切酶的修剪和DNA連接酶的連接；2.目標(biāo)DNA分子+載體

DNA，共價(jià)連接；3.獲得重組DNA分子。

五、目的基因的分離與鑒定㈠、基于基因文庫的基因分離方法（P267）：1.構(gòu)建基因庫（library）：

基因文庫是由單一來源的特定組織或器官的DNA或cDNA片段匯總形成的克隆群體。

①.基因組文庫(genomiclibrary)

：

將某生物全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。理想的核基因庫應(yīng)能包括全部基因組序列。②.cDNA文庫：

以mRNA為模板è經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNAè構(gòu)建基因庫?；蚪M文庫與cDNA文庫的比較：

基因組文庫包含基因組的所有基因。cDNA文庫只包括某一特定細(xì)胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時(shí)期的表達(dá)序列。分離特定基因，cDNA庫比較方便。研究調(diào)控序列，必須基因組文庫。2.從基因庫中分離特定的基因：①.DNA探針：是待篩選的目的基因或克隆的一段互補(bǔ)的核酸序列。利用DNA探針可以從基因庫中篩選特定的克??；制備的探針可以是雙鏈也可以是單鏈，但在雜交反應(yīng)中使用的是單鏈；探針必須帶有標(biāo)記，如同位素、熒光素等②.篩選基因庫：將轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后菌落印影在濾膜上；用堿裂解使雙鏈DNA變性成單鏈，牢固地結(jié)合在膜上；再用變性過的目的基因的放射性DNA或mRNA作探針進(jìn)行雜交放射性自顯影，凡X光片上有黑點(diǎn)即為陽性克隆定位找出培養(yǎng)皿所對應(yīng)的菌落③.序列測定和分析：

從基因庫中篩選出的陽性克隆è

分析、鑒定è

得到目的基因。

一般采用Sanger(1977)發(fā)明的雙脫氧核糖核酸終止法(dideoxynucleotidechaintermination)測定核酸序列。5’TACGCATACGACATTGCAAC3’ddTATGCTGTAACGTTG5’ddTGCGTATGCTGTAACGTTG5’ddTGCTGTAACGTTG5’ddTGTAACGTTG5’待測序的DNA模板引物DNA聚合酶dNTPddTTPSanger雙脫氧鏈終止法ddTAACGTTG5’ddTTG5’ddTG5’電泳方向㈡、T-DNA標(biāo)簽分離基因（P286）：T-DNAT-DNA㈢、基于PCR的基因克?。壕酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainReaction，PCR)可以體外快速擴(kuò)增DNA。美國Mullis(1986)發(fā)明，是現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展史上的一個(gè)里程碑。PCR反應(yīng)三個(gè)步聚(一個(gè)循環(huán))：1.變性：94~95℃使模板DNA雙鏈變成單鏈；2.復(fù)性：50~70℃下，引物分別與互補(bǔ)的DNA單鏈互補(bǔ)配對；3.延伸：在引物的引導(dǎo)和Taq酶作用下，于72℃下合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。PCR技術(shù)的關(guān)鍵

人工合成寡核苷酸片段（引物）耐熱的TaqDNApolymerase

（來自Thermusaquaticus，94kDa）PCR方法已成為分子生物學(xué)研究常規(guī)手段而且還用于遺傳、發(fā)育、進(jìn)化、疾病診斷、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域PCR技術(shù)的發(fā)明是現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展史上的又一個(gè)里程碑發(fā)明人獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)㈣、人工合成基因：

根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來，可人工合成基因。

將目的基因與載體連接，構(gòu)建重組DNA分子；重組DNA分子必須導(dǎo)入宿主細(xì)胞才能擴(kuò)增或表達(dá)。第三節(jié)外源基因?qū)胨拗髦亟MDNA分子的構(gòu)建用相同的內(nèi)切酶酶解目的基因與載體；將載體與目的基因混合；用DNAligase連接。重組DNA分子的構(gòu)建一、重組DNA導(dǎo)入原核生物原核生物基因工程的受體通常是大腸桿菌。CaCl2處理轉(zhuǎn)化、電激轉(zhuǎn)化接合二、外源基因?qū)胫参铫逯参锉磉_(dá)載體（P271）：能將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并能整合到基因組上；具有復(fù)制起始點(diǎn)和啟動(dòng)子。Ti質(zhì)粒(tumor-Inducing,Ti)

一種細(xì)菌質(zhì)粒，它自然存在于土壤農(nóng)桿菌細(xì)胞中。

Ti質(zhì)粒一部分DNA叫轉(zhuǎn)移DNA(transferDNA，T-DNA)，當(dāng)農(nóng)桿菌感染植物時(shí)，T-DNA便轉(zhuǎn)移到植物的染色體上，誘導(dǎo)冠癭瘤，并能合成冠癭堿，作為農(nóng)桿菌的碳源和氮源。Ti質(zhì)粒特點(diǎn)：

具有五個(gè)主要功能區(qū)域：①.

T-DNA②.質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(PT)；③.冠癭堿(opine)代謝區(qū)；④.復(fù)制原點(diǎn)；⑤.Vir區(qū)（毒性區(qū)）T-DNA中直接參與轉(zhuǎn)移并整合的序列：僅是T-DNA兩端與其它序列交界處的25bp重復(fù)序列，右端的這段序列稱為右界(RB)，左端的序列稱為左界(LB)。

Vir區(qū)的毒性基因：T-DNA轉(zhuǎn)移所必需。㈡外源基因?qū)胫参铮≒273）：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因槍法根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumt