第四章DNA重組(含逆轉錄病毒簡介)

遺傳重組概述第一節(jié)同源重組第二節(jié)位點專一性重組第三節(jié)細菌中的轉座成分概述：?

只要有DNA，就會發(fā)生重組減數(shù)分裂高等Euk、體細胞核基因、葉綠體和線粒體溫和噬菌體轉座子轉座?生存→變異→突變，重組

適應環(huán)境、加速進化?廣義遺傳重組：任何造成基因型變化的基因交流過程?

重組可分為四類（DNA序列、蛋白質因子）

Ecoli中四種DNA重組的特征?狹義遺傳重組：涉及到DNA分子內(nèi)斷裂-復合的基因交流?遺傳重組與重組DNA的區(qū)別類型需同源序列需RecA蛋白需序列特異性的酶同源重組

＋

＋

－位點專一

＋

－

＋轉座

－

－

＋異常重組

－

－?第一節(jié)同源重組

homologousrecombination發(fā)生在同源DNA序列之間的重組Euk

減數(shù)分裂時的染色單體之間的交換細菌的轉化，轉導，接合后重組噬菌體重組發(fā)生前提是重組的兩條DNA必須靠近，同源序列之間嚴格配對一、同源重組的特點：?

涉及同源序列間的聯(lián)會配對，且交換的片段較大?生成異源雙鏈區(qū)?存在重組熱點（Chi）?需要重組酶（RecA）?DNA單鏈或單鏈末端是交換發(fā)生的重要信號雙倍體染色體交換二、同源重組的機制1.單鏈侵入模型2.Holliday模型（雙鏈侵入模型）3.雙鏈斷裂修復模型3‘5‘5‘3‘Meselson-Radding模型單鏈入侵模型（鏈轉移模型）置換侵入Loop切除同化異構化分支遷移5’切割Holliday的異構化Holliday結構一經(jīng)生成即可不斷地處于異構化180o180o置換5‘5‘（1）（2）Holliday模型雙鏈侵入模型2.侵入3.交互連接、異構化、分支遷移1.切割4.拆分核酸內(nèi)切酶連接酶Holliday結構兩種拆分方式“親本鏈”“重組體”雙鏈斷裂修復模型分支遷移（branchmigaration）－－雙螺旋形成的交叉連接以拉鏈式效應擴散，產(chǎn)生異源雙鏈heteroduplexDNA異源雙鏈的修復導致基因轉變：一個基因轉變?yōu)樗牡任换虻倪z傳現(xiàn)象三、原核同源重組（E.coli）?發(fā)生在雙方DNA的同源區(qū)域

部分復制的染色體DNA之間或染色體DNA與外源DNA之間，細菌的轉化、結合和轉導

1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位點?具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性?單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性，使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈－－－RecA的作用位點?RecBCD有固定切割位點3‘a(chǎn)、RecBCD結合在DNA的平頭末端（產(chǎn)生機制不清楚）b、外切、解鏈、移動（ATP）c、兔耳狀loop結構產(chǎn)生（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD

在loop單鏈區(qū)的

chi位點3’方4～6堿基處切斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶）?

chi位點：GCTGGTGG

目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點

E.coli

含1000個e、RecBCD

切割產(chǎn)生3’單鏈末端

2、RecA

蛋白

（1）

活性a、RecA

有單、雙鏈DNA結合活性b、RecA

有NTPase

活性（底物差異活性）與單鏈DNA結合時活性最大---依賴于DNAc、RecA

有啟動一個分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分子的能力，即聯(lián)會同源DNA

（但其靶DNA必須有缺口－－結合DNA）

（2）RecA

蛋白催化雙鏈和單鏈DNA

的反應階段a、聯(lián)會前階段（緩慢）

RecA

與單鏈結合b、單鏈與雙螺旋的互補鏈迅速配對，形成雙鏈連接分子

Holliday（5’侵入）c、從雙螺旋結構中緩慢置換一條鏈產(chǎn)生一段長的異源雙鏈DNA，

反應結束時，RecA

結合到雙鏈上RecA引起的鏈交換和Holliday結構的生成

RecA入侵單鏈被置換鏈RecA引發(fā)鏈侵入模型RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.

RecA啟動的單鏈入侵

3、原核同源重組的其它蛋白

需要E.coli

中三個基因RuvA，RuvB

和RuvC

的產(chǎn)物a、RuvA

識別Holliday結構的連接點b、RuvB

為分支遷移提供動力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC

核酸內(nèi)切酶---專一性識別Holliday結構的連接點

?E.coli

重組的各階段（損傷修復）損傷DNA復制產(chǎn)生缺口RecA鏈交換第二次鏈交換DNApol

?通過DNA合成填滿缺口RuvA，B分支遷移RuvC切割Holliday連接點第二節(jié)位點特異性重組

site-specificrecombination一、概念：發(fā)生在特異序列的DNA分子間的重組特點：在特定的結合序列部位有序列專一酶（整合酶）催化斷裂重接

如：噬菌體整合到細菌基因組

二、λphage的整合與切除附著位點（attachmentsiteatt）溶源性細菌(lysogen)原噬菌體E.Coli

attB

含BOB’三序列23bpλphageattP

含POP’三序列240bp核心序列“O”完全一致，全長15bp（同源部分）BOB’+POP’BOP’+POB’

attB

attP

attL

attRIntIHFIntIHFXIS整合過程λ整合酶（integrase

Int）（λ編碼）：單獨存在只能催化BOB’和POP’之間的重組，不能催化BOP’和POB’之間的重組寄主的整合宿主因子IHF（integrationhostfactor）：寄主基因編碼切除酶（Excisionase

Xis)：λ噬菌體的xis基因編碼，與Int形成復合體

發(fā)生在O內(nèi)的重組交換位點相距7bp?Int蛋白能切斷DNA，并使它重新連接，進而使holliday結構拆分?重組時attP和attB部位交叉斷裂，互補單鏈末端進行交叉雜交第三節(jié)細菌中的轉座成分轉座子(元)或轉座元件(transposonortransposableelement):

基因組上不必借助于同源序列就可以移動的DNA片段，它們可以直接從基因組的一個位點移到另一個位點（供體和受體）。轉座（transposition）：轉座元件的轉移過程（不十分確切）1、發(fā)現(xiàn)和發(fā)展?1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes

玉米果皮、糊粉層花斑突變

玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機理

跳躍基因（jumpinggene）?1947冷泉港實驗室（美）BarbaraMcClintocka)不依賴供體序列與靶位點間序列的同源性b)轉座不是簡單的轉移，涉及轉座子的復制Hotspots(熱點)Regionalpreference(在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機插入)d)某些轉座因子（Tn3）對同類轉座因子的插入具有排它性

（免疫性）e)靶序列在轉座因子兩側會形成正向重復

f)轉座因子的切除與轉座將產(chǎn)生復雜的遺傳學效應2、轉座重組的特點c)轉座插入的靶位點并非完全隨機（插入專一型）二、Prok.轉座子種類簡單轉座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）復合轉座子（compositetransposon）

?共同特征：

a）兩端有20～40bp的IR（invertrepeat

），為轉座酶的識別位點

b）具有編碼轉座酶（transposase）的基因

c)插入靶位點后會出現(xiàn)靶位點的正向重復（3～9bp）1、插入序列是細菌染色體、質粒和某些噬菌體的正常組分?命名：IS＋編號（鑒定類型）長度700～2000bp

靶位點的DR形成a)

Tn/TnAfamily轉座酶基因、調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpR

StrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrR

TmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2.5kb20kb

Tn3IRTnpA

Res

TnpR

AmpR

IR38bp38bp

轉座酶

regulatorβ-內(nèi)酰胺酶

2、復合轉座子?兩種類型

b）兩端重復序列為IS的復合轉座子ISL

ISR臂中心區(qū)臂?兩側的IS既可以是IR，又可以是DR（directrepeat

）狀態(tài)（IR多）?當兩個IS組件相同時，其中任一個都可行使轉座功能?不同時，主要依靠一個DNA重組DNA重組三、轉座子的轉作機制及模式?三種類型：復制型、非復制型和保守型1、復制型轉座模式?需兩種酶：轉座酶（作用于原拷貝兩末端）解離酶（作用于復制后的拷貝）?兩大步

a)共合體形成切口－連接－復制

b)拆分2、非復制型轉座模式?供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂?供體位點如不能被修復則有致死效應3、保守型轉座模式?另一種非復制型?與λ整合機制相似其轉座酶與λ整合酶家族有關4、TnA轉座模式?復制型轉座轉座酶(tnpA)、解離酶(tnpR)?解離酶需要特異的內(nèi)部位點

雙重功能：解離功能

tnpA及自身的阻遏物?拆分位點–res

共合體拆分位點?轉座結果產(chǎn)生5bp

的正向重復序列

四、轉座子轉座頻率的調(diào)控?每個轉座子控制自身轉座的核心----控制轉座酶的水平不到一個轉座酶分子／世代／細胞1、Tn10轉座機制?Tn10為復合型轉座子?IS10R元件提供轉座酶活性-----合成轉座酶的序列?自發(fā)轉座頻率---10-7?Tn10轉座酶水平是控制轉座的關鍵?有兩種控制轉座的方式

a）通過反義RNA的翻譯水平控制?IS10R外側邊緣兩個啟動子?PIN控制I