第12章復(fù)制(藥學(xué))

DNA的生物合成(復(fù)制)DNABiosynthesis，Replication

第十章中心法則

CentralDogmaRNADNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄少數(shù)病毒復(fù)制翻譯

蛋白質(zhì)（病毒）復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA復(fù)制的基本規(guī)律BasicRulesofDNAReplication

第一節(jié)復(fù)制的方式——半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)復(fù)制的高保真性(highfidelity)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)一、半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和意義DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念A(yù)GGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

目錄1958–MatthewMeselson和FranklinStahl美國(guó)科學(xué)家馬修.梅塞爾(MatthewKeelson)福蘭克林.斯塔爾(FranklinStahl)密度梯度實(shí)驗(yàn)

——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。二、復(fù)制的半不連續(xù)性3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。

DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化TheEnzymologyofDNAReplication第二節(jié)參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫為DNA-pol模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質(zhì)因子一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

目錄聚合反應(yīng)的特點(diǎn)DNA新鏈生成需引物和模板；新鏈的延長(zhǎng)只可沿5→3方向進(jìn)行。二、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性2.核酸外切酶活性5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性53外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。

核酸外切酶活性目錄（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。(損傷修復(fù)，填補(bǔ)空隙）DNA-polⅠ（109kD）323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

3

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

功能是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ不同種類亞基數(shù)目1≥7≥10相對(duì)分子質(zhì)量103000880009000005′→3′核酸聚合酶活性+++3′→5′核酸外切酶活性+++5′→3′核酸外切酶活性+--聚合速度（核苷酸/分）1000~1200240015000~60000持續(xù)合成能力3~2001500≥500000分子數(shù)/細(xì)胞40010010~20功能切除引物，修復(fù)修復(fù)復(fù)制（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制,參與核DNA的修復(fù).在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol三、復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)復(fù)制按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀

（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對(duì)的底物。B：堿基配對(duì)正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇?DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。?嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。

1.遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；2.聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；3.復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制

四、復(fù)制中的分子解鏈及DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白E.Coli基因圖目錄解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整

解旋酶(helicase)解螺旋酶作用：斷裂互補(bǔ)堿基間的氫鍵，使DNA成單鏈dnaA、B、C…DnaA、B、C…ATP引物酶(Primase)

5′5′催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一種特殊的RNA聚合酶DNA合成需在RNA引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行RNA引物5′3′5′3′單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）作用：防止單鏈DNA重新形成雙鏈，防止單鏈DNA被核酸酶水解（協(xié)同效應(yīng)）SSB108

局部解鏈后（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

解鏈過程中正超螺旋的形成目錄拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ分類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制

五、DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’目錄DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能

小結(jié)主要成員

主要作用DnaA識(shí)別復(fù)制起始位點(diǎn)解螺旋酶解開DNA雙鏈SSB維持已解開單鏈DNA的穩(wěn)定引物酶合成RNA引物TOPO使打結(jié)、纏繞、正超螺旋的DNA松馳DNA-polⅢDNA復(fù)制DNA-polⅠ水解引物、填補(bǔ)空隙、修復(fù)作用DNA連接酶催化雙鏈DNA中單鏈缺口的連接DNA生物合成過程TheProcessofDNAReplication第三節(jié)1.復(fù)制的起始2.復(fù)制的延長(zhǎng)3.復(fù)制的終止（一）復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成

E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列53531.DNA解鏈E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC跨度為245bp，有3組串聯(lián)重復(fù)序列和2對(duì)反向重復(fù)序列

GATTNTTTATTT…GATCTNTTNTATT…GATCTCTTATTAG串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列…TTTGGATAA…..TTATCCACA

TGTGGATTA……TTATACACA…

反向重復(fù)序列(invertedrepeatsequence)：在同一多核苷酸鏈內(nèi)的相反方向上存在的重復(fù)的核苷酸序列。2.引發(fā)體和引物DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3535含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶（二）復(fù)制的延長(zhǎng)復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目錄領(lǐng)頭鏈的合成目錄隨從鏈的合成目錄目錄（三）復(fù)制的終止終止子位點(diǎn)：terA-terFTus:與終止子位點(diǎn)結(jié)合的蛋白質(zhì)

由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補(bǔ)空隙，由DNA連接酶將DNA片段連接起來。555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成

?細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。與蛋白激酶活性有關(guān)。?蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。?真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。?復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。?增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在復(fù)制起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。（一）復(fù)制的起始3553領(lǐng)頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核小體（二）復(fù)制的延長(zhǎng)染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）復(fù)制的終止53355335+5333355目錄端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。功能?維持染色體的穩(wěn)定性?維持DNA復(fù)制的完整性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。?末端DNA序列是多次重復(fù)的富含T、G堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成

對(duì)外:抵御核酸酶等外界對(duì)內(nèi):染色體脫氧核糖核酸的因素的襲擊末端復(fù)制問題保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性染色體染色體脫氧核糖核酸的末端復(fù)制問題：3’5’5’3’RNA引物3’3’RNA引物水解

即DNA復(fù)制過程不能"自始至終"完整地復(fù)制整個(gè)線性染色體，而是每次都在其5'末端留下一個(gè)空缺未能填補(bǔ)（即RNA引物降解），如果細(xì)胞沒有辦法添補(bǔ)這些空隙，染色體DNA將隨著每一次的細(xì)胞分裂而不斷縮短，直至這種缺隙侵蝕到染色體的結(jié)構(gòu)基因而使細(xì)胞消亡。端粒酶的催化延長(zhǎng)作用爬行模型目錄DNA聚合酶復(fù)制子鏈進(jìn)一步加工目錄反轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四節(jié)反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)RNADNA反轉(zhuǎn)錄酶一、反轉(zhuǎn)錄病毒和反轉(zhuǎn)錄酶

反轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板反轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA二、反轉(zhuǎn)錄研究的意義

反轉(zhuǎn)錄酶和反轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

反轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。對(duì)反轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。

滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplication)三、滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制

是某些低等生物的復(fù)制形式，如X174和M13噬菌體等。3-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制5'5335目錄dNTPDNA-polγ

D環(huán)復(fù)制(D-loopreplication)

是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復(fù)制形式。

DNA損傷（突變）與修復(fù)DNADamage(Mutation)andRepair第五節(jié)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。

一、突變的意義（一）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)（二）突變導(dǎo)致基因型改變（三）突變導(dǎo)致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)

二、引發(fā)突變的因素物理因素紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV化學(xué)因素目錄三、突變的分子改變類型錯(cuò)配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變(pointmutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

2.顛換（一）錯(cuò)配鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

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·

C肽鏈CTCGAG基因（二）缺失、插入和框移缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。移碼突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。

缺失或插入都可導(dǎo)致移碼突變

。谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變（三）重排DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。

由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型目錄四、DNA損傷的修復(fù)修復(fù)(repairing)

是對(duì)已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。光修復(fù)(lightrepairing)切除修復(fù)(excisionrepairing)重組修復(fù)(recombinationrepairing)SOS修復(fù)

修復(fù)的主要類型（一）光修復(fù)光修復(fù)酶(photolyase)

UVUvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHP

（二）切除修復(fù)是細(xì)胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)機(jī)制，主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。DNA連接酶ATPE.coli的切除修復(fù)機(jī)制目錄切除修復(fù)動(dòng)畫著色性干皮病(XP)案例分析

著色性干皮病(XP)

此病為常染色體隱性遺傳病,患者皮膚對(duì)日光敏感,病變累及顏面,肩，臂等.發(fā)病機(jī)制

XPA基因第631位堿基由胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?轉(zhuǎn)換)第211位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻K止密碼子所編碼的XPA蛋白在C端缺失了63個(gè)氨基酸XPA蛋白功能(參與DNA的切除修復(fù))產(chǎn)生缺陷DNA損傷修復(fù)失效日曬誘發(fā)DNA鏈嘧啶二聚體形成皮膚發(fā)生色素沉著,萎縮.

先復(fù)制再修復(fù)。子代鏈在對(duì)應(yīng)模板鏈的損傷處留下缺口，先將同源母鏈DNA上相應(yīng)的核苷酸片段轉(zhuǎn)移替補(bǔ)，然后再合成一段序列填充缺口。（三）重組修復(fù)（四）SOS修復(fù)當(dāng)DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時(shí)，由此而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。在E.coli，各種與修復(fù)有關(guān)的基因，組成一個(gè)稱為調(diào)節(jié)子(regulon)的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。這種修復(fù)特異性低，對(duì)堿基的識(shí)別、選擇能力差。通過SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細(xì)胞是可存活的。然而DNA保留的錯(cuò)誤較多，導(dǎo)致較廣泛、長(zhǎng)期的突變。習(xí)題選擇1.DNA復(fù)制時(shí)，序列5'－TpApGpApCpT－3'指導(dǎo)合成的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)是(

)A、5'－ApTpCpTpTpAp－3'B、5'－ApGpTpCpTpAp－3'C、5'－ApGpUpCpUpAp－3'D、3'―TpGpTpCpTpAp―5'

E、5‘－ApGpGpCpGpAp－3’

２．岡崎片段是指(