第5章 離子交換層析

第五章離子交換層析（Ionexchangechromatography）2/4/2023海南大學農(nóng)學院wss1離子交換層析的概念離子交換層析是利用分離物（蛋白質(zhì)）表面的荷電的離子或基團與帶相反電荷的不溶性基質(zhì)（離子交換劑）進行可逆的交換。更確切地，是先用蛋白質(zhì)偶極離子置換基質(zhì)官能團上的平衡離子（反離子），然后蛋白質(zhì)本身又隨著平衡離子的比例的增加而被置換下來。根據(jù)蛋白質(zhì)各組分所帶電荷的性質(zhì)及電荷量的差異，被置換的速度不同而在層析過程中達到分離。2/4/20232內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應用2/4/20233第一節(jié) 基本原理1.離子交換劑2.交換反應3.原理4.離子交換劑與離子結合的關系5.兩性電解質(zhì)與離子交換劑的結合力2/4/20234離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進行的。2/4/20235

纖維素－O－CH2－COO一—Na+

基質(zhì)電荷基團反離子

羧甲基纖維素離子交換劑組成示意圖1.離子交換劑（1）離子交換劑：即是通過化學鍵合的方法向惰性支持物上連接可解離的化學基團后的產(chǎn)物。由基質(zhì)、電荷基團（或功能基團）和反離子構成。2/4/20236陰離子交換劑與陽離子交換劑的基本構成：

基質(zhì)－電荷基團－反離子（反離子基團）陰離子交換劑陽離子交換劑2/4/20237RA+B+

RB+A+

RA代表陽離子交換劑，它在溶液中解離出來的陽離子A+與溶液中的陽離子B+能發(fā)生可逆的交換反應。2.交換反應2/4/20238離子交換反應：R-A++B+R-B++A+平衡常數(shù)表示離子交換劑對溶液中不同離子的親和力：[A][B]AB[RB][RA]++K

=[A]=[B]KA

B=[RB][RA]++KAB=1[RA]＞[RB]KAB＞1[RA][RB]KAB1＜＜[RB]=[RA]2/4/20239KAB值反映離子交換劑對不同離子的親合力或選擇性的參數(shù)，稱KAB值為離子交換劑對A+和B+的選擇系數(shù)。2/4/2023103.離子交換層析的原理利用蛋白質(zhì)及欲分離的生物分子帶電性質(zhì)的差異為分離依據(jù)；帶電荷的蛋白質(zhì)樣品可以與離子交換劑的帶正電荷或負電荷的基團結合；蛋白質(zhì)樣品同離子交換劑的結合力取決于彼此間相反電荷基團的靜電吸引力，pH影響這種吸引力；蛋白質(zhì)的洗脫通過改變洗脫液的鹽離子強度和pH來完成。2/4/202311

大分子依其與離子交換劑親和力的不同，而以不同牢度被吸附于離子交換劑上，通過改變離子強度或(和)pH使大分子再從離子交換劑上先后被洗脫下來。2/4/202312混合樣品帶負電荷，與陰離子交換劑結合。樣品堿性較弱，吸附力較弱，用低濃度鹽洗脫。樣品堿性強，與交換劑結合牢，解脫難。用高濃度鹽洗脫。各樣品帶電荷不同，與離子交換劑的結合能力不同。依解離的難易的差異，而達到分離。2/4/202313離子交換層析示意圖2/4/2023海南大學農(nóng)學院wss14Whathappensinionexchange?SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------2/4/202315Whathappensinionexchange?Equilibration++++++-------anionexchangebead2/4/202316Whathappensinionexchange?Sampleapplicationandwash-----------++++++----2/4/202317Whathappensinionexchange?Elution----------------------------------++++++++++++--2/4/202318Whathappensinionexchange?Regeneration-----------------------++++++2/4/2023194.離子交換劑與離子結合的關系強酸性離子交換劑、強堿性離子交換劑對各種反離子的結合與否以及結合力的強弱遵循一定的規(guī)律；并對樣品選擇離子交換劑、洗脫液離子類型、pH狀態(tài)都至關重要。離子交換劑與各種水合離子的結合力是與離子的電荷量成正比，與水合離子的半徑的平方成反比關系。2/4/202320離子交換劑在溶液中與水合離子結合能力的趨勢結論：離子價數(shù)愈高，結合力愈大。離子間電荷相同時，離子的原子序數(shù)愈高，水合離子半徑愈小，結合力愈大。故元素周期表中離子結合力的趨勢的方向為：從小至大。(P71表5-1)2/4/2023215.兩性電解質(zhì)與離子交換劑的結合力蛋白質(zhì)、酶、多肽、核苷酸及核酸等兩性電解質(zhì)與離子交換劑的結合力取決于其本身的物理化學性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當pH﹤pI,帶正電荷，被陽離子交換劑吸附。pH﹥pI,帶負電荷，被陰離子交換劑吸附。pI離pH愈遠，分離物所帶電荷越強，越容易被離子交換劑吸附，吸附力強，越難解吸附。2/4/202322內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應用2/4/202323第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)離子交換劑的基本要求：1.高度的不溶性；2.多孔的結構，巨大的表面積；3.豐富的交換基團；4.穩(wěn)定的物理化學性質(zhì)。2/4/202324一、分類A.陽離子交換劑是在不溶性載體上,結合有中性pH下帶負電荷的官能團（羧甲基或磺丙基基團）。這類樹脂適合于分離等電點在中性以上的蛋白質(zhì)。三角形代表負電荷的官能團，釋放的反離子帶正電荷。+--+++--2/4/202325陰離子交換劑帶正電荷官能團，反離子帶負電荷。B.陰離子交換劑的官能團（二乙氨乙基DEAE或季氨堿QAE）樹脂在中性pH條件帶正電荷。釋放的反離子帶負電荷，在中性pH時能與酸性蛋白質(zhì)相互作用。+__++_2/4/202326離子交換樹脂的基本類型陽離子交換劑強酸性弱酸性陰離子強堿性交換劑弱堿性交換基團磺酸基羧酸基季銨基伯、仲銨基交換離子-SO3H-COOH-NH3-NHR、-NH2工作范圍（pH）1～147～140～120～7水解穩(wěn)定性穩(wěn)定易水解穩(wěn)定易水解離子吸附速度大H型小大OH型小2/4/202327請記?。宏栯x子交換劑本身帶酸性基團，在其pK以上荷負電。陽離子分為：強酸性、中強酸性、弱酸性陰離子交換劑本身帶堿性基團，在其pK以下荷正電。陰離子分為：強堿性、中強堿性、弱堿性2/4/2023281.疏水性離子交換劑疏水性離子交換劑中的基質(zhì)是人工合成的、與水結合力較小的物質(zhì)，稱為樹脂。其基質(zhì)的化學本質(zhì)是苯乙烯和二乙烯苯合成呈網(wǎng)狀的聚合體，引入不同的電荷基團。2/4/202329疏水性離子交換劑具有如下特性而被廣泛應用：

大量的活性基團較高的交換容量良好的機械強度穩(wěn)定的物理化學性質(zhì)均勻的球形顆粒、型號齊全以及豐富的產(chǎn)品2/4/2023302.親水性離子交換劑親水性離子交換劑的基質(zhì)是一類天然的或人工合成的、與水結合力較大的物質(zhì)。有：纖維素Sephacel、交聯(lián)葡聚糖Sephadex交聯(lián)瓊脂糖Sepharose2/4/2023311）纖維素Sephacel離子交換劑基本結構:以微晶纖維素為基質(zhì)，化學方法引入電荷基團，構成各種陽離子、陰離子交換劑;示弱陰離子樹脂的結構（DEAE-Sephacel）BeadedCellulose-O-CH2-CH2N+-H-Cl-CH2CH3CH2CH32/4/2023322/4/2023海南大學農(nóng)學院wss332)交聯(lián)葡聚糖Sephadex離子交換劑以交聯(lián)葡聚糖G－25和G－50為基質(zhì)，化學法引入電荷基團構成各種陰離子、陽離子交換劑。（DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex）。DEAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-QAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-CH2-CH(OH)-CH3-Cl-CH2CH3CH2CH3CH2CH3CH2CH32/4/2023342/4/2023海南大學農(nóng)學院wss353)瓊脂糖Sepharose離子交換劑以交聯(lián)瓊脂糖CL-6B為基質(zhì)，化學法引入電荷基團構成陽離子交換劑CM－SepharoseCL-6B和陰離子交換劑DEAE-SepharoseCL-6B。CM(SepharoseCl-6B)-O-CH2-C-02Na+DEAE-SepharoseCl-6B-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-CH2-CH3CH2-CH32/4/202336親水性離子交換劑的結構瓊脂糖離子交換劑的基本結構以交聯(lián)瓊脂糖CL－6BSepharose為基質(zhì)。其網(wǎng)孔的大小通過交聯(lián)劑的比例調(diào)節(jié)，適合分離各種不同分子量的物質(zhì)。2/4/202337ScanningelectronmicrographofanagarosegelMagnificationx50,000Ref: AndersS.Medin,PhDThesis,UppsalaUniversity19952/4/202338二、離子交換劑的性質(zhì)1.顏色與形狀2.交聯(lián)度3.吸水量或膨脹度4.交換容量5.穩(wěn)定性6.比重7.流速2/4/202339離子交換劑的性質(zhì)1.顏色與形狀2.交聯(lián)度:離子交換劑的基質(zhì)的交聯(lián)度根據(jù)適用的要求，調(diào)節(jié)交聯(lián)劑在基質(zhì)中的比例或百分濃度而制成各種（篩孔）型號的交換劑。3.吸水量與膨脹度：是指離子交換劑在水溶液中吸取的體積，即篩孔中所占的體積（Vi）。吸水量與膨脹度受基質(zhì)的性質(zhì)、離子強度、pH、電荷基團及交聯(lián)度的影響。4.交換容量：離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進行交換的能力。2/4/202340離子交換劑的膨脹度與離子強度的關系1）在相同離子強度的條件時,膨脹度隨著基質(zhì)的交聯(lián)度的增加而降低。2）在相同離子強度的條件時，強酸、強堿型的離子交換劑的膨脹度大，弱酸、弱堿的膨脹度小。說明前者的解離度達最大，帶電荷基團之間的排斥力大，結果膨脹度亦大。2/4/202341pH對離子交換劑膨脹度的影響弱陽離子交換劑的膨脹度隨著pH的增高而增大弱陰離子交換劑的膨脹度隨著pH的降低而增大弱離子交換劑在其近pK值時的pH中膨脹度最小交聯(lián)度大的或帶強電荷基團的離子交換劑，其膨脹度基本與pH的變化無關2/4/202342離子交換劑的性質(zhì)1.顏色與形狀2.交聯(lián)度:離子交換劑的基質(zhì)的交聯(lián)度根據(jù)適用的要求，調(diào)節(jié)交聯(lián)劑在基質(zhì)中的比例或百分濃度而制成各種（篩孔）型號的交換劑。3.吸水量與膨脹度：是指離子交換劑在水溶液中吸取的體積，即篩孔中所占的體積（Vi）。吸水量與膨脹度受基質(zhì)的性質(zhì)、離子強度、pH、電荷基團及交聯(lián)度的影響。4.交換容量：離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進行交換的能力。2/4/202343交換容量的影響因素篩孔：篩孔的直徑與分離物的分子量大小密切相關。(表P76)離子強度：離子強度的增加引起對交換劑上結合蛋白質(zhì)位點的競爭，而降低交換容量，在解離中便利用逐漸加大離子強度的原理。2/4/202344pH與交換容量的關系弱陰離子交換劑的交換容量是隨著pH的下降而增大弱陽離子交換劑的交換容量是隨著pH的上升而增大強陰離子與強陽離子交換劑的交換容量基本與pH變化無關，因其完全呈解離狀態(tài)，始終很高2/4/202345交換容量的影響因素若加樣量超過樹脂的容量，寶貴的活性會隨著未吸附的物料一起流失；若樹脂過量，會大大減少活性物質(zhì)的回收。測定實驗：2/4/202346注意交換容量包含樣品中的總蛋白量，而非僅僅是活性蛋白。各種蛋白樣品與樹脂的交換容量是不同的，應分別測定。放大實驗時，應適當留一定的結合空間，并使之在最小量。2/4/202347最佳上樣pH的選擇pH5.05.56.06.57.09.0+SSSSSS4℃,30～60min搖勻，充分結合＋＋＋＋＋＋＋

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在低的pH時，蛋白質(zhì)未結合，上清有活性，隨著pH的上升，蛋白質(zhì)與樹脂結合愈多，直至完全結合，上清中再檢測不到活性。+－離心，檢測上清的活性最佳上樣時高于緩沖液一個pH2/4/2023485穩(wěn)定性：都具有理化穩(wěn)定性。6比重：7流速：2/4/202349內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應用2/4/202350第三節(jié)操作一、離子交換劑的選擇、處理與轉(zhuǎn)型二、緩沖液的選擇三、分離物質(zhì)的交換四、程序2/4/202351一、離子交換劑的選擇、處理與轉(zhuǎn)型被分離物質(zhì)帶正電荷，選擇陽離子交換劑；被分離物質(zhì)帶負電荷，選擇陰離子交換劑；被分離物質(zhì)為兩性離子，依據(jù)其在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)所帶電荷選擇交換劑。陰離子交換劑結合帶陽離子交換劑結合帶負電荷的蛋白質(zhì)正電荷的蛋白質(zhì)2/4/202352①對于已知pI的物質(zhì)：在高于其等電點的pH，用陰離子交換劑；在低于其等電點的pH，用陽離子交換劑。②對于未知pI的物質(zhì)：可參照電泳的結果，在中性或偏堿性的條件下進行電泳，向陽極移動較快的物質(zhì)，在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附；向陰極移動或向陽極移動較慢的，可被陽離子交換劑吸附。2/4/202353離子交換劑的選擇的原則★分離生物大分子一般采用親水性基質(zhì)。具有可人工控制的分子篩，及較多的可交換的基團；★分離酶、核酸、蛋白質(zhì)等采用弱性的離子交換劑。其交換容量大，親水性，對生物樣品的穩(wěn)定性好，易發(fā)生結合；★洗脫液的pH與被分離物的pI至少相差一個pH值，才能將各種成份分開。pH﹥pI一個單位時選擇陰離子交換劑；pH﹤pI一個單位時選擇陽離子交換劑。2/4/202354離子交換劑的選擇的原則例：。pI＝5.2的物質(zhì)在不同的pH條件下帶電荷性質(zhì)、帶凈電荷量不同，而能分別與陽離子、陰離子交換劑結合。實驗上選擇陰離子，因為從pH6.2－8.5條件溫和。不影響生物樣品活性；選擇陽離子時，pH從4.2－3.0，條件極端，可能使樣品失去活性。2/4/2023552.離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型目的：要求其帶上使用時所期望的離子或基團。處理步驟：先用水浸泡至充分膨脹即可進行處理。除細顆粒酸堿浸泡水洗滌堿或酸處理水洗滌緩沖液平衡再生：通過酸堿反復處理或借助轉(zhuǎn)型處理完成。轉(zhuǎn)型：指離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)到另一種反離子的過程，轉(zhuǎn)型后的離子交換劑會按使用要求帶上一定種類的離子或基團。除雜質(zhì)：P84表5-92/4/202356為什么金屬離子(Na+、K+等)可以吸附在H-型強酸型陽離子交換柱上，而后又可以用HCl來再生強酸型陽離子交換柱?

親和力大小不僅與離子性質(zhì)有關，而且與其濃度有關。前者根據(jù)一價金屬離子的親和力順序不難理解，而后者是采用高濃度HCl來再生強酸型陽離子交換柱。2/4/202357二、緩沖液的選擇離子交換劑吸附被分離物的量與緩沖液的pH值和離子濃度有密切關系。起始緩沖液：pH值一般比有效成分的pI值高一個單位或低一個單位，離子強度為0.1。洗脫液：離子強度和pH值應使有效成分從離子交換劑上解離下來。一般離子強度要比起始緩沖液高，pH值是隨著離子交換劑性質(zhì)變化而變化。2/4/202358三、交換動態(tài)法---柱層析法：交換效率高，應用廣泛。適合于制備、純化及分析。適用于實驗室、科研，教學以及模型的建立；靜態(tài)法---可以大容器：盆、缸、桶、罐等操作。樣品液與交換劑進行混合、攪拌、吸附，濾去上清液，再解吸附，濃縮。適合工廠，生產(chǎn)車間，產(chǎn)品的中試。其操作方便，設備簡陋，快速定性等優(yōu)勢。2/4/202359四、程序填裝柱子柱子平衡加入樣品開始洗脫分步收集定性檢測合并峰值濃縮樣品除去鹽離子定量分析計算回收率及純化倍數(shù)再生2/4/202360離子交換劑層析裝置（梯度洗脫配置）2/4/2023611.裝柱與加樣量樣品的準備樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品的不溶物應在透析后或凝膠過濾前以離心法除去。2.洗脫原則：增加離子強度、改變pH值方式：梯度洗脫（Gradientelution）階段洗脫(Stepwiseelution)2/4/202362

2/4/202363離子強度的線性梯度洗脫曲線p86鹽濃度吸收曲線2/4/202364離子強度非線性梯度(階梯式洗脫曲線)2/4/202365影響梯度洗脫速率變化的因素A：當CA、CB的濃度確定后，總體積V越小，梯度速率變化越快。ABB：當體積V確定時，CB－CA差值越大，梯度速率變化越快。0.50.40.30.20.10.50.40.30.20.1Vt1Vt22/4/202366比較線性梯度與階梯式梯度洗脫顯示：在樣品組分、柱子規(guī)格、緩沖液成份、洗脫速度相似的條件時，其分辨率有差異。但并未表現(xiàn)明顯優(yōu)勢。依據(jù)實驗經(jīng)驗，當分離物各組分差異較小時，選用線性梯度；差異較大則選用階梯式梯度，以減小體積和節(jié)省時間。2/4/202367A.C.相同條件的線性梯度

A.流速8毫升/小時，C為20毫升/小時；

B與A的流速相同，離子梯度不同

結果：三者顯示分辨率不同的結果線性梯度、洗脫速度與分辨率2/4/202368梯度圖的分析當緩沖液的pH﹥pI（樣品）時，樣品帶負電荷，結合到陰離子交換劑，解吸附時，將pH下降，越來越靠近pI，直至其pI、甚至pH﹤pI,樣品電荷由－0＋。樣品解離。A為陰離子交換劑。pH從10－7.5，變化。當緩沖液的pH﹤pI（樣品）時，樣品帶正電荷，結合到陽離子交換劑，解吸附時，將pH上升，越來越靠近pI，直至其pI、甚至pH﹥pI,樣品電荷由＋0－。樣品解離。B為陽離子交換劑。pH從4.5－8.9變化。AB2/4/202369內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應用2/4/202370去離子水的制備自來水過濾R-SO3H柱RN(CH3)3OH柱去離子水混合柱RN(CH3)3OH柱1.水處理2/4/202371交換柱的填充樹脂一般采用強酸型陽離子交換樹脂和強堿型陰離子交換樹脂，如001×7(732#)和201×7(717#)；由于交換容量不同，實驗中通常采用一根陽離子交換柱和二根陰離子交換柱?；旌现矐吹冉粨Q容量比例混合；混合柱的作用：由于離子交換是可逆反應，經(jīng)過陽離子交換柱和陰離子交換柱處理的去離子水，還存在著微量未交換的離子。若讓它再通過混合柱，由于兩種交換過程同時進行，離子交換后生成的H+和OH?結合成水而除去，進一步提高了水的質(zhì)量。實驗室精制去離子水可采用

5cm×100cm混合柱處理一次去離子水。2/4/2023722.分離純化小分子物質(zhì)

離子交換層析廣泛應用于無機離子、有機酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。2/4/202373核苷酸的解離性質(zhì)（pK）核苷酸磷酸基一級解離氨基磷酸基二級解離pIAMP0.93.76.22.35GMP0.72.46.11.55CMP0.84.56.32.66UMP1.0__6.4__見圖P88的分離圖譜2/4/2023743.分離純化生物大分子物質(zhì)

離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來進行分離純化的，是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。用離子交換層析制備、純化電荷量不同的生命物質(zhì)時，不但被分離物的活性可以保存，而且分辨率較高。2/4/202375各蛋白質(zhì)樣品的等電點BSApI=4.7糜蛋白酶pI=8.8胰蛋白酶pI=8.1細胞色素CpI=9.8～10.12/4/2023764.測定蛋白質(zhì)的等電點pH

活力單位5678pH梯度變化，間隔0.2單位。檢測每管的活力單位。確定該酶的等電點。2/4/202377pI=5.3陽離子交換劑05.05.58.0活性陰離子pH8.0－－pH6.5－－pH5.5－＋pH5.0＋pH4.5＋＋pH4.0＋＋＋不吸附，上清有活性吸附，上清無活性陽離子pH8.0－－－pH6.5－－pH5.5＋—pH5.0—pH4.5＋＋pH4.0＋＋＋不吸附，上清有活性吸附，上清無活性用陽離子時，活性出現(xiàn)在高pH的上清中;用陰離子時，活性出現(xiàn)在低pH的上清中。陰離子交換劑2/4/202378小節(jié)進行離子交換的蛋白質(zhì)在實驗條件下必須有單一電荷。溶液中單一電荷的蛋白質(zhì)可被離子交換劑樹脂上的小離子交換，固定在樹脂上；通過增加溶液中反離子濃度或降低蛋白質(zhì)所帶電荷量等方法可將蛋白質(zhì)從樹脂上洗脫下來。蛋白質(zhì)的等電點是離子交換劑層析的重要依據(jù)。進行離子交換層析的最佳溶液pH值一般與蛋白質(zhì)的等電點相差一個單位；使蛋白質(zhì)的靜電荷量即可保證結合在離子交換劑上，又利于洗脫與分離。交換樹脂的選擇:被分離物質(zhì)帶正電荷，選擇陽離子交換劑，被分離物質(zhì)帶負電荷，選擇陰離子交換劑；被分離物質(zhì)為兩性離子，依據(jù)其在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)所帶電荷選擇交換劑。2/4/202379樹脂的溶脹（膨脹）與pH、離子強度、與交換容量的關系。