純化與精制-沉淀法

1.2.4純化與精制沉淀法通過加入某種試劑或改變?nèi)芤簵l件，使生化產(chǎn)物以固體形式從溶液中析出的分離純化技術(shù)稱為固相析出分離技術(shù)無定形態(tài)沉淀：雜亂無章的相互碰撞形成較大顆粒有規(guī)則的形態(tài)結(jié)晶：同種分子或離子相互聚集形成有規(guī)則的形狀1.沉淀定義利用沉淀劑使所需提取的生化物質(zhì)或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。沉淀和結(jié)晶本質(zhì)上同屬一個過程，都是新相析出的過程，兩者的區(qū)別在于構(gòu)成單位的排列方式不同，晶體的原子、離子或分子排列是規(guī)則的，而沉淀是不規(guī)則的。沉淀和結(jié)晶通常被統(tǒng)稱為固相析出技術(shù)。第一節(jié)沉淀法概述2.沉淀特點優(yōu)點：操作簡單、經(jīng)濟(jì)、濃縮倍數(shù)高缺點：針對復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強(qiáng)；雜質(zhì)含量高3.應(yīng)用范圍（1）抗生素、有機(jī)酸、氨基酸等小分子（2)蛋白質(zhì)、酶、多糖、多糖等大分子鹽析法

有機(jī)溶劑沉淀法等電點沉淀法選擇性變性沉淀法離子型聚合物沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法高價金屬離子沉淀法4.沉淀法分類一.鹽析法1.原理1.1基本概念鹽析：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度隨鹽濃度的升高會急劇下降，并產(chǎn)生沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽溶：在低鹽濃度下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高，溶解度略有上升，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。第二節(jié)蛋白質(zhì)沉淀方法2.鹽析機(jī)理示意圖①鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，降低了用于溶解蛋白質(zhì)的有效水量，減弱了蛋白質(zhì)的水合程度，破壞了蛋白表面的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降；②鹽離子電荷的中和作用，使蛋白質(zhì)溶解度下降；鹽析的機(jī)理3.鹽析公式-沉淀基礎(chǔ)(1）Cohnx經(jīng)驗公式S—蛋白質(zhì)溶解度，mol/L;I—離子強(qiáng)度c:離子濃度；Z：離子化合價β，Ks—常數(shù)圖1碳氧血紅蛋白的溶解度與硫酸銨離子強(qiáng)度的關(guān)系圖β－鹽濃度為0時，蛋白質(zhì)溶解度的對數(shù)值。與蛋白質(zhì)種類、溫度、pH值有關(guān)，與鹽無關(guān)；Ks—鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽的種類有關(guān)，與溫度、pH值無關(guān)。（2）β和Ks的物理意義Ks鹽析法(分級沉淀）：在一定pH和溫度下，改變體系離子強(qiáng)度進(jìn)行鹽析的方法；β鹽析法(分級沉淀）：在一定離子強(qiáng)度下，改變pH和溫度進(jìn)行鹽析； 其中，Ks鹽析法由于蛋白質(zhì)對離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。而β鹽析法由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的純化。（3）鹽析的方法3.1選用鹽析用鹽的幾點原則鹽析作用要強(qiáng)鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽溶解度受T影響小鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經(jīng)濟(jì)3.鹽析用鹽的選擇3.2一般的規(guī)律為在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異：半徑小的高價離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價離子作用較弱（Ks）磷酸鉀>硫酸鈉>硫酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂3.3常用的鹽析用鹽硫酸銨：離子強(qiáng)度大，鹽析作用強(qiáng)；溶解度大（767g/L），對T不敏感；分級效果好，對蛋白有穩(wěn)定作用，價廉；具腐蝕性且緩沖能力差，硫酸鈉磷酸鹽檸檬酸鹽4.影響鹽析的因素(1)溶質(zhì)種類的影響：(2)溶質(zhì)濃度的影響：蛋白質(zhì)濃度大，鹽的用量小，共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質(zhì)濃度小，鹽的用量大，共沉作用小、分辨率高(3)pH值：影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量通常調(diào)整體系pH值使其在pI附近；且pr穩(wěn)定性好(4)鹽析溫度-常溫一般在高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降5.硫酸銨鹽析操作（1）固體加入法：以少量多次方式緩慢加入硫酸銨，其用量由表可得。如：現(xiàn)有20ml料液，飽和度為20％，以加固體硫酸銨的方式鹽析，需要達(dá)到的硫酸銨飽和度為40％，問需要加入多少固體硫酸銨？鹽析飽和度（Saturation）的概念：以硫酸銨為例：250C時，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L定義為100%飽和度。（50％飽和度？）25℃硫酸銨水溶液由原來的飽和度達(dá)到所需飽和度時，每升硫酸銨水溶液應(yīng)加入固體硫酸銨的克數(shù)（2）加飽和硫酸銨溶液V-加入體積；V0－原液體積S3－所加硫酸銨的飽和度S2－需要達(dá)到的硫酸銨的飽和度S1－原液硫酸銨的飽和度二.有機(jī)溶劑沉淀法1.概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。2.有機(jī)溶劑沉淀的特點（1）分辨率高；（2）溶劑容易分離，并可回收使用；產(chǎn)品潔凈；（3）容易使蛋白質(zhì)等生物大分子失活；（4）應(yīng)注意在低溫下操作；（5）成本高3.原理：（1）降低了溶質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致沉淀。（2）由于有機(jī)溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，從而降低了親水性，導(dǎo)致脫水凝聚－破壞水化膜。（3）加有機(jī)溶劑后，pr等分子的空間結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，使內(nèi)部疏水基團(tuán)部分外露，并與有機(jī)溶劑的疏水基團(tuán)結(jié)合成疏水層，從而使蛋白沉淀。4.常用的有機(jī)溶劑及其選擇介電常數(shù)要小致變性作用要小毒性要小、揮發(fā)性適中水溶性要好（與水無限混溶）4.1選擇原則4.2常用的有機(jī)溶劑沉淀劑（1）乙醇：沉淀作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉淀；（2）丙酮：沉淀作用更強(qiáng)，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣；（3）甲醇介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48；丙酮的介電常數(shù)是22；容易獲取5.影響有機(jī)溶劑沉淀的主要因素（1）溫度－預(yù)冷低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有利于提高收率（溶解度下降）；（有機(jī)溶劑溶于水放熱）（2）攪拌速度－散熱（3）溶液pH值：目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)帶有相同的電荷，pI附近；穩(wěn)定性好（4）離子強(qiáng)度:離子強(qiáng)度低有利于沉淀，0.01－0.05mol/L（5）樣品濃度:0.5－2%?。喝軇┯昧看螅厥章实?，但共沉淀作用小濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強(qiáng)，分辨率低三.等電點沉淀1.概念： 調(diào)節(jié)體系pH值，使兩性電解質(zhì)的溶解度下降，析出的操作稱為等電點沉淀。2.原理： 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當(dāng)溶液pH值處于等電點時，分子表面凈電荷為0，雙電層破壞和水化膜變薄，由于分子間引力，形成蛋白質(zhì)聚集體，進(jìn)而產(chǎn)生沉淀。3.等電點沉淀實例①從豬胰臟中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右進(jìn)行等電點沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì)(pI=3．O)。工業(yè)生產(chǎn)胰島素(pI＝5.3)時，先調(diào)pH至8.0除去堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH至3.0除去酸性蛋白質(zhì)(同時加入一定濃度的有機(jī)溶劑以提高沉淀效果)。②堿性磷酸酯酶的pI沉淀提取：發(fā)酵液調(diào)pH4.0后出現(xiàn)含堿性磷酸酯酶的沉淀物，離心收集沉淀物。用pH9.0的0