歡迎各位老師及同學(xué)

歡迎各位老師及同學(xué)！香鱗毛蕨的轉(zhuǎn)錄組測序報告人：佟偉霜2012.01.07轉(zhuǎn)錄組是什么---what1轉(zhuǎn)錄組的常用方法----how2RNA-Seq能做什么？3我們是怎樣做的？4我們的結(jié)果如何？5Contents1.轉(zhuǎn)錄組是什么？DNA轉(zhuǎn)錄的所有RNAmRNA轉(zhuǎn)錄組即特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和ncRNA?；蛐酒夹g(shù)——Microarray基因表達(dá)序列分析技術(shù)——Serialanalysisofgeneexpression，SAGE大規(guī)模平行測序技術(shù)——Massivelyparallelsignaturesequencing，MPSSRNA測序技術(shù)——RNAsequencing，RNA-seq2.轉(zhuǎn)錄組是怎樣做的------常用方法優(yōu)點：成本適中，其對較高表達(dá)的基因檢測比較準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)分析軟件較多，整個方法較為成熟缺點：對低表達(dá)基因檢測敏感度不夠，前期工作基礎(chǔ)要求較高，而且很難檢測出融合基因轉(zhuǎn)錄、多順反子轉(zhuǎn)錄等異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.常用方法------基因芯片技術(shù)流程

RNAcDNAHydrizationwithmicroarrysTranscriptmeRNAcDNAAnchoringenzymecDNAfragmentLigatedwithlinkercDNAfragmentwithlinkerTaggingenzymeTagLigationandPCRdiTagAnchoringenzymeConcatemersSequecing

Transcriptme優(yōu)點：不需基因序列的信息，能夠全局性地檢測所有基因的表達(dá)水平，可顯示基因差異，可獲得未知基因特別是那些低拷貝基因缺點：文庫構(gòu)建流程長，技術(shù)要求高，單條短序列標(biāo)簽所含的基因信息很少，不適于遺傳信息缺乏的植物2.常用方法------基因表達(dá)序列分析技術(shù)流程RNAcDNAClonedtoadaptorvectorscDNAlibrarywithadaptors

PCRcDNAfragmentwithadaptorsT4polymerasedGTPsscDNAfragmentwithadaptorsLoadonmicrobeadsandsequncing

Transcriptme優(yōu)點：獲得更長的短標(biāo)簽，因而精度更高；此外，MPSS技術(shù)特有的微球熒光測序可直接高通量讀出序列，簡化了測序過程缺點：涉及PCR擴增、克隆等可能會產(chǎn)生堿基偏向性的操作步驟，從而影響轉(zhuǎn)錄本的正確識別2.常用方法------大規(guī)模平行測序技術(shù)流程轉(zhuǎn)錄組測序RNA片段化(200-700bp)用連有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA（真）隨機引物引導(dǎo)cDNA合成去除rRNA富集mRNA（原核生物）cDNA片段(200-700bp)反轉(zhuǎn)錄成cDNA加接頭總RNA2.常用方法------RNA-Seq流程2.常用方法------RNA-Seq提供更多信息，可以得到用基因芯片難以得到的轉(zhuǎn)錄可變剪接序列對低表達(dá)基因的檢測更加準(zhǔn)確，并且可以定量確定轉(zhuǎn)錄水平。RNA-seq技術(shù)得到的標(biāo)簽長度(由采取的高通量測序技術(shù)的讀長而定，可達(dá)400bp)比SAGE和MPSS顯著增加，提高了識別轉(zhuǎn)錄本的特異性和準(zhǔn)確性成本更低有參考基因組---轉(zhuǎn)錄組重測序轉(zhuǎn)錄組測序2.RNA-Seq

------分類無參考基因組---轉(zhuǎn)錄組從頭組裝2.RNA-Seq

------數(shù)據(jù)分析基因表達(dá)差異分析檢測基因融合基因結(jié)構(gòu)的優(yōu)化鑒定基因的可變剪接新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測SNP分析Unigene功能注釋UnigeneGeneOntology分類結(jié)構(gòu)的優(yōu)化Unigene表達(dá)差異分析蛋白編碼區(qū)預(yù)測（CDS）UnigenePathway富集分析有參考基因組---轉(zhuǎn)錄組重測序無參考基因組---轉(zhuǎn)錄組從頭組裝2.RNA-Seq

------無參考基因組的數(shù)據(jù)分析流程原始序列數(shù)據(jù)Unigenes基因注釋Unigene表達(dá)量注釋預(yù)測編碼蛋白框（CDS）Unigene功能注釋Unigene表達(dá)差異分析Unigene的GO和Pathway分析GO功能顯著性富集分析Pathway顯著性富集分析CleanreadsSWISS-PROT的網(wǎng)址是：http://www.ebi.ac.uk/swissprot/SWISS-PROT是經(jīng)過注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，由歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)維護。COG庫的網(wǎng)址是：：/COG

蛋白質(zhì)直系同源簇(COGs)數(shù)據(jù)庫是對細(xì)菌、藻類和真核生物的21個完整基因組的編碼蛋白，根據(jù)系統(tǒng)進化關(guān)系分類構(gòu)建而成。KEGG的網(wǎng)址是：：http://www.genome.ad.jp/kegg/

京都基因和基因組百科全書(KEGG)是系統(tǒng)分析基因功能，聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識庫。NCBI的BLUST網(wǎng)址是：/BLAST/

2.RNA-Seq

------常用數(shù)據(jù)庫3.RNA-Seq能做什么？-----應(yīng)用領(lǐng)域單核苷酸突變選擇性剪接可選啟動子等位基因的差異表達(dá)RNA編輯融合基因基因（轉(zhuǎn)錄本）的精確結(jié)構(gòu)各種器官的基因表達(dá)模式不同發(fā)育階段的基因表達(dá)模式動植物疾病作物抗逆性、適應(yīng)性研究分子育種藥用植物代謝途徑分析功能基因組癌癥及復(fù)雜疾病農(nóng)業(yè)及藥用植物3.RNA-Seq能做什么?-----實例（有參考基因組）DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolutionrevealshighcomplexityofthericetranscriptome.實驗材料實驗結(jié)果研究目的全面了解水稻基因表達(dá)情況愈傷組織根尖（14d）莖尖（14d）葉（2stages）稻花/稻穗（3stages）總測序量28G,每個樣本不低于5M的SEreads鑒定了28563個基因的5’和3’UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)7232個新轉(zhuǎn)錄本,新轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度低，且具有組織表達(dá)特異性發(fā)現(xiàn)23800個可變剪接發(fā)現(xiàn)1356個融合基因GenomeRes.2010May;20(5):646-54.3.RNA-Seq能做什么?-----實例（有參考基因組）CharacterizationofTranscriptionalComplexityduringBerryDevelopmentinVitisvimiferaUsingRNA-Seq實驗材料實驗結(jié)果選取在成熟季節(jié)開花后5,10,和15個星期葡萄分別代表葡萄果實成熟的著果期,始熟期和成熟期;分別選3棵向陽樹和3棵背陰樹，每棵樹相應(yīng)位置隨機摘取10個漿果，該實驗設(shè)2個重復(fù)，分別作為樣本池進行totalRNA提取。PlantPhysiology,April2010,Vol.152,pp.1787–17953個stages共測了2.2G的數(shù)據(jù)量，82.4%的reads可以定位到1個（66.6%）或多個（15.8%）基因組位置將測序所得reads與reference（8.4X框架圖）數(shù)據(jù)比較，鑒定出85,870個SNP3.RNA-Seq能做什么?-----實例（有參考基因組）實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)385個基因具有AS（alternative

splicing），其中只在一個漿果發(fā)育stage發(fā)生AS有210個基因，只在兩個漿果發(fā)育stage發(fā)生AS有97個基因，只在三個漿果發(fā)育stages都發(fā)生了AS有78個基因鑒定了新的基因，發(fā)現(xiàn)了glutathione-S-transferase(GST)家族的53個新基因，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中28個新基因，這些基因因為表達(dá)豐度低、缺少探針序列而無法被芯片檢測到隨機選取15個基因進行qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)12個基因qRT-PCR結(jié)果與RNA-Seq相一致3.RNA-Seq能做什么?-----實例（無參考基因組）TheGeneticMapofArtemisiaannuaL.IdentifiesLociAffectingYieldoftheAntimalarialDrugArtemisinin實驗材料研究目的構(gòu)建與青蒿素產(chǎn)量相關(guān)的遺傳圖譜濃縮的嫩葉,成熟葉片,及花芽上的腺毛細(xì)胞Science327,328(2010)3RNA-Seq能做什么?-----實例（無參考基因組）實驗結(jié)果香鱗毛蕨Dryopteris

fragrans(L.)Schott

鱗毛蕨科鱗毛蕨屬多年生蕨類植物。該屬植物所含有的酚類化合物具有較強的驅(qū)蟲、抑制腫瘤、抗病毒和殺菌作用。在我國北部地區(qū)，民間流傳香鱗毛蕨能治療各種皮膚病，因此近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。4.我們是怎樣做的？4.我們是怎樣做的？實驗材料組培的香鱗毛蕨無菌苗實驗處理Ck：25℃48h；1:4℃48h；2:35℃48h預(yù)期結(jié)果獲得與香鱗毛蕨溫光處理條件下酚類代謝相關(guān)基因5.我們的結(jié)果如何？結(jié)果(6).預(yù)測編碼蛋白框（CDS）(1).產(chǎn)量統(tǒng)計(5).Unigene代謝通路分析(4).Unigene的GO分類(2).組裝結(jié)果(3).Unigene功能注釋(8).差異Unigene的GO分析和Pathway分析(7).Unigene表達(dá)差異分析5.我們的結(jié)果如何？-----(1)產(chǎn)量統(tǒng)計SamplesTotalReadsTotalNucleotides(nt)Q20percentageNpercentageGCpercentage*CK26,775,8742,409,828,66092.36%0.00%49.57%127,039,8502,433,586,50091.31%0.00%48.68%227,047,3802,434,264,20092.47%0.00%49.88%表1.測序產(chǎn)量統(tǒng)計Tab.1YieldstatisticalofRNA-Seq5.我們的結(jié)果如何？-----(2)組裝結(jié)果ContigScaffoldUnigeneck17313775380560951189469771305256121792148832264292表2測序序列統(tǒng)計Tab.2DistributionfragmentofRNA-Seq5.我們的結(jié)果如何？-----(2)組裝結(jié)果圖1CK的Unigene的長度分布圖Fig.1UnigenelengthdistributionofsampleCK5.我們的結(jié)果如何？-----(2)組裝結(jié)果圖2All-Unigene的Gap（N）分布圖Fig.2GapdistributionofAll-Unigene5.我們的結(jié)果如何？-----(2)組裝結(jié)果綜合所有樣品得到的Unigene序列：原始組裝結(jié)果：All-Unigene共66716可確定方向的序列（5'->3'）：All-Unigene.5-3.fa無法確定方向的序列：All-Unigene.no_orientation.faUnigene10_Allsize3699gap80.21%GCAAGGAGCACATGTGTGACTGATGAAGGTAACCTGAAGCAAGCTGCTCAGCTTAATATTTTTGAGACCTCGACTCAACCAACCAAGGAGGGTCCCTCAGATCCTTCAGATAANNNNNNNNGTTACAATCTTGCTTGCAAATAGAATCTT5.我們的結(jié)果如何-----(3)Unigene功能注釋其中預(yù)測只有一般功能的序列最多為4305條，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)及核結(jié)構(gòu)相關(guān)序列最少分別為4和3條；其中與次生代謝產(chǎn)物的運輸和代謝相關(guān)序列有較多為1051條，與各種氨基酸，糖類，脂類代謝的較多。5.我們的結(jié)果如何？-----(4)Unigene的GO分類基因的分子功能6316

細(xì)胞組分相關(guān)27529參與的生物過程21417

51015.我們的結(jié)果如何？-----(5)代謝通路分析PathwayAllgeneswithpathwayannotation(18989)PathwayIDMetabolicpathways代謝途徑5012(26.39%)ko01100Biosynthesisofsecondarymetabolites次生代謝產(chǎn)物合成途徑2788(14.68%)ko01110Spliceosome剪接體1384(7.29%)ko03040Plant-pathogeninteraction植物病原體交互作用1128(5.94%)ko04626Proteinprocessinginendoplasmicreticulum內(nèi)