第2章 核酸的結(jié)構(gòu)與功能

Chapter2

Structure&Functionof

Nucleicacid

第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能

2014.9.12

2.1細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)

2.2DNA螺旋結(jié)構(gòu)及多態(tài)性

2.3DNA的非標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4染色體的結(jié)構(gòu)與組裝

2.5RNA的結(jié)構(gòu)與功能

2.6DNA的變性、復(fù)性、分子雜交

第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能

2.1細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)

1)DNA是遺傳物質(zhì)

回顧:

二十世紀(jì)四、五十年代，Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，提出DNA是遺傳物質(zhì)。

A.Hershey和M.Chase噬菌體雙標(biāo)記感染試驗(yàn),證明DNA是遺傳信息的載體。DNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)是DNA分子內(nèi)堿基的排列順序DNA分子以密碼子的方式蘊(yùn)藏了所有生物的遺傳信息.4

DNA分子堿基序列表面上似乎不規(guī)則，實(shí)際上高度有序。

任何一段DNA序列都可反映它高度的個(gè)體性或種族特異性。分子生物學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，DNA控制了生物的遺傳性狀。無(wú)論DNA或RNA，都是由許許多多個(gè)核苷酸連接而成的生物大分子，而每個(gè)核苷酸又由磷酸、核糖和堿基3部分組成。

DNA真核細(xì)胞基因組的最大特點(diǎn)是它含有大量的重復(fù)序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開。所謂C值，通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量。C值反?，F(xiàn)象（C-valueparadox）不斷增加的生物體的復(fù)雜度導(dǎo)致相應(yīng)基因數(shù)量的增加？果蠅基因總數(shù)13500線蟲18500擬南芥28000人30000RNA切割作用可以保證從單個(gè)基因產(chǎn)生多個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。生物的復(fù)雜性同其基因組的大小之間幾乎沒有相關(guān)性。2.2DNA的結(jié)構(gòu)1.DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA又稱脫氧核糖核酸，是deoxyribonucleicacid的簡(jiǎn)稱，它是一種高分子化合物，其基本單位是脫氧核苷酸。在DNA分子中，磷酸和脫氧核糖是不變的，而4種含氮堿基即腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）是可變的。在DNA分子中，嘌呤永遠(yuǎn)與嘧啶配對(duì)，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對(duì)，鳥嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對(duì)。如一條鏈上某一堿基是C，另一條鏈上與它配對(duì)的堿基必定是G。堿基之間的這種一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系叫堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。真核細(xì)胞DNA序列可被分為3類1、不重復(fù)序列在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個(gè)或幾個(gè)拷貝，它占DNA總量的10%～80%。不重復(fù)序列長(zhǎng)約750～2000bp，相當(dāng)于一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的長(zhǎng)度。蛋清蛋白、蠶的絲心蛋白、血紅蛋白和珠蛋白等都是單拷貝基因。

2、中度重復(fù)序列

這類序列的重復(fù)次數(shù)在101～104之間，占總DNA的10%～40%，如小鼠中占20%，果蠅中占15%，各種rRNA、tRNA以及某些結(jié)構(gòu)基因如組蛋白基因等都屬于這一類。組蛋白基因：

組蛋白基因在各種生物體內(nèi)重復(fù)的次數(shù)不一樣，但都在中度重復(fù)的范圍內(nèi)。

基因組中存在大量重復(fù)序列用以編碼組蛋白是有其重要意義的。DNA復(fù)制時(shí)，組蛋白也要成倍增加，而且往往在DNA合成一小段后，組蛋白馬上就要與其相結(jié)合，這要求在較短的時(shí)間內(nèi)合成大量的組蛋白，因而需要有大量的組蛋白基因存在。

3、高度重復(fù)序列——衛(wèi)星DNA

只存在于真核生物中，占基因組的10%~60%，由6~100個(gè)堿基組成，在DNA鏈上串聯(lián)重復(fù)高達(dá)數(shù)百萬(wàn)次。因?yàn)樾l(wèi)星DNA不轉(zhuǎn)錄，其功能不詳。它們是異染色質(zhì)的成份，可能與染色體的穩(wěn)定性有關(guān)。

研究DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)意義：闡明遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu),功能,表達(dá),調(diào)控.DNA幾乎是所有生物遺傳信息的攜帶者，是信息分子，攜帶

兩類遺傳信息:1)負(fù)責(zé)編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成的信息及編碼RNA的信息,

這類信息中，DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)及RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)間基本上是共線性關(guān)系。2）與基因信息表達(dá)有關(guān)，負(fù)責(zé)基因活性的選擇性表達(dá)，這部分DNA參與復(fù)制、基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞分化等功能。在細(xì)胞周期的不同時(shí)期、個(gè)體發(fā)育的不同階段、不同器官、組織、以及不同外界環(huán)境下，決定基因開啟或關(guān)閉，開啟量多少。DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的重要意義不僅在于它以密碼子方式蘊(yùn)藏了遺傳信息，而且還決定了DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)。從DNA結(jié)構(gòu)與遺傳學(xué)功能的關(guān)系上看，從一級(jí)結(jié)構(gòu)中得到的許多信息都需要用二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行解釋;此外,大量的遺傳特征需從二級(jí)和空間結(jié)構(gòu)上挖掘，所以二級(jí)和空間結(jié)構(gòu)已成為弄清生命遺傳奧秘的主要研究領(lǐng)域之一。2.3DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。DNA不僅具有嚴(yán)格的化學(xué)組成，還具有特殊的高級(jí)結(jié)構(gòu)，它主要以有規(guī)則的雙螺旋形式存在。在生物活體中，不論DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)還是高級(jí)結(jié)構(gòu)，都是時(shí)刻變化的。DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。通常情況下，DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分兩大類：一類是右手螺旋，如A-DNA和B-DNA；另一類是左手螺旋，即Z-DNA。2.4DNA螺旋結(jié)構(gòu)及多態(tài)性大量研究表明，DNA結(jié)構(gòu)并非固定不變，它的某些區(qū)段因功能需要和特定的nt序列而呈現(xiàn)特殊結(jié)構(gòu)，如三螺旋和四螺旋。這些DNA結(jié)構(gòu)雖然形態(tài)各異，但都以一級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，都具有重要的生物學(xué)意義。1）B-DNA：

Watson&Crick闡述的DNA纖維結(jié)構(gòu)即為B-型結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）。結(jié)構(gòu)受環(huán)境影響,

DNA鈉鹽在較高濕度(92％)纖維結(jié)構(gòu)是B-DNAB-DNA含水量高，是大多數(shù)DNA在細(xì)胞中的Conformation.

29大溝和小溝

由于每種堿基對(duì)占據(jù)的空間不對(duì)稱，且脫氧核糖中連接堿基的每一個(gè)C1′并不正好處在螺旋的相對(duì)位置上（堿基和主鏈之間的鍵偏離螺旋直徑）使雙螺旋骨架的兩股鏈在螺旋軸上的間距不相等，因此，在螺旋分子表面形成了寬窄不等的大溝和小溝。分子生物學(xué)第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能30大溝(majorgroove)寬(2.2nm)小溝(minorgroove),寬(1.2nm)。由于空間位阻較小，大溝比小溝能攜帶更多的與蛋白識(shí)別并結(jié)合的信息，即大溝中的堿基種類差異易于識(shí)別，對(duì)蛋白質(zhì)識(shí)別并結(jié)合于雙螺旋結(jié)構(gòu)上的特異序列區(qū)域非常重要。分子生物學(xué)第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能只有在溝內(nèi)，蛋白質(zhì)才能“感覺”到不同堿基順序，相反，在雙螺旋結(jié)構(gòu)的主鏈骨架上基本沒有信息，故蛋白質(zhì)與骨架的相互作用呈非特異性，只有與溝內(nèi)堿基相互作用，才呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)與雙鏈DNA的特異性作用。在人工合成的12聚體中，組成堿基對(duì)的兩堿基分布并非同一平面，而是沿長(zhǎng)軸旋轉(zhuǎn)一定角度，形狀像螺旋槳葉片，稱螺旋槳扭曲(propellertwisting)。分子計(jì)算發(fā)現(xiàn)這種構(gòu)象能提高堿基堆積力，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。2）DNA螺旋結(jié)構(gòu)多態(tài)性（polymorphism）Polymorphism即不均一性，多樣性研究發(fā)現(xiàn)DNA分子存在一種以上的雙螺旋結(jié)構(gòu)類型。實(shí)際上，DNA能以多種螺旋形式存在，包括天然及人工合成，這一現(xiàn)象稱：DNA結(jié)構(gòu)多態(tài)性大多數(shù)DNA都以B型存在，但不是一成不變.

細(xì)胞內(nèi)雙螺旋結(jié)構(gòu)是動(dòng)態(tài)可變的，DNA具有構(gòu)象變化的性質(zhì)是其發(fā)揮功能的前提，這種變化范圍可從B型雙螺旋結(jié)構(gòu)參數(shù)的微小改變到雙螺旋分開形成單鏈。產(chǎn)生多態(tài)性的主要原因：多核苷酸鏈骨架含大量可轉(zhuǎn)動(dòng)單鍵及單鍵轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)所帶動(dòng)基團(tuán)的移動(dòng)，當(dāng)所存在細(xì)胞環(huán)境改變時(shí)，這些構(gòu)象間可發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。在每一種構(gòu)象家族中，參數(shù)還有輕微變化。如：A型、C型等的右手螺旋構(gòu)象和Z型的左手雙螺旋構(gòu)象。A型DNA當(dāng)相對(duì)濕度75%，或脫水、鈉鹽變?yōu)殁淃}、銫鹽，及由于加入乙醇或鹽類使水的活度降低時(shí)，DNA由B型→A型。A-DNA也是右手雙螺旋，但螺體粗短，堿基對(duì)與中心軸的傾角為19°但B-DNA為1°。當(dāng)nt中脫氧核糖構(gòu)象變化，則同股鏈中相鄰磷酸基間距縮短0.1nm，這一變化使每股螺旋的堿基對(duì)數(shù)目由B-DNA的10（溶液中10.5）轉(zhuǎn)變?yōu)锳-DNA的11。

A型與B型的另一差異：堿基對(duì)在螺旋中的位置B-DNA堿基對(duì)集中于螺旋軸；A-DNA堿基對(duì)向大溝方向移動(dòng)0.5nm，使兩種構(gòu)象的外型不同。由于RNA分子有2＇-OH基，且核糖C2′羥基采取C3′內(nèi)式構(gòu)象，有利于形成A-DNA

所以RNA雙鏈區(qū)及DNA-RNA雜交分子和RNA-DNA雙螺旋區(qū)域都以A-DNA構(gòu)象存在。

Z-型DNA（左手螺旋）

在研究Oligo-dCGCGCG六聚體晶體X-射線衍射后，發(fā)現(xiàn)DNA還存在Z-型（Z-DNA）是左手雙螺旋。Z-DNA基本重復(fù)單位是嘌呤-嘧啶，嘧啶的苷鍵——反式取向嘌呤的苷鍵——順式取向而右手螺旋中，苷鍵構(gòu)象都是反式，因此，是嘌呤苷鍵構(gòu)型的不同產(chǎn)生了左手雙螺旋。

Z-型鏈骨架中磷原子和脫氧核糖的連接呈鋸齒形，故稱Z型。已證明Z-DNA參與了基因表達(dá)的調(diào)控，調(diào)控基因的啟閉。因Z-DNA的形成，使局部DNA雙鏈處于不穩(wěn)定狀態(tài)，利于DNA雙鏈解開，而DNA解鏈?zhǔn)荄NA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的必要環(huán)節(jié)。Z-HelixDNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中左手螺旋——

Z-DNA的研究B-DNA是最常見的DNA構(gòu)象，A-DNA和Z-DNA可能具有不同的生物活性。Z-DNA調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)模式在鄰近調(diào)控系統(tǒng)中，與調(diào)節(jié)區(qū)相鄰的轉(zhuǎn)錄區(qū)被Z-DNA抑制，只有當(dāng)Z-DNA轉(zhuǎn)變?yōu)锽-DNA后，轉(zhuǎn)錄才得以活化。3）DNA的非標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）反向重復(fù)序列

invertedrepeat

指雙鏈DNA中有些區(qū)段，含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)相同，但方向相反的序列（按確定方向閱讀雙鏈中每條鏈序列都相同）。

5′GGTACC3′3′CCATGG5′

每條鏈從5′→3′方向閱讀時(shí)序列都是GGTACC即：有二重對(duì)稱性。

這種結(jié)構(gòu)要求DNA互補(bǔ)鏈中的每一條都可發(fā)生鏈內(nèi)互補(bǔ)，故具有鏈內(nèi)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Hairpin或雙鏈內(nèi)形成十字形結(jié)構(gòu)cruciformstructure的傾向.反向重復(fù)序列大多是限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列。EcoRI含兩個(gè)相同亞基二聚體，結(jié)合在DNA識(shí)別位點(diǎn)上：

TCGCGAATTCGCGGCGCTTAAGCGCT當(dāng)有Mg2+在時(shí)，EcoRI在特定位點(diǎn)切割DNA。S1核酸酶能特異切斷DNA分子局部單鏈區(qū)?？捎脕?lái)鑒定這類結(jié)構(gòu)。4）三股螺旋DNA當(dāng)雙鏈中的一條鏈為全嘌呤鏈，另一條鏈為全嘧啶鏈時(shí)，DNA能轉(zhuǎn)化成三鏈結(jié)構(gòu)triplexHoogsteen1963年提出DNA三螺旋結(jié)構(gòu)理論。三螺旋中的第三股鏈可來(lái)自分子間或分子內(nèi)。根據(jù)第三股鏈的組成和糖環(huán)構(gòu)型分不同類型。（1）分子內(nèi)DNA三螺旋在一條自身回折的寡嘧啶與寡嘌呤螺旋大溝內(nèi)結(jié)合了第三股寡核苷酸。第三鏈堿基與原螺旋Watson-Crick堿基對(duì)中嘌呤形成Hoogsteen配對(duì)第三鏈與寡嘌呤核苷酸間同向平行。

絞鏈DNA是一種分子內(nèi)折疊形成的三螺旋。當(dāng)DNA一段多聚嘧啶或多聚嘌呤序列為鏡像重復(fù)時(shí)，即回折產(chǎn)生H-DNA，如交替出現(xiàn)的T和C序列，其互補(bǔ)鏈為重復(fù)的A和G序列，就可能形成H-DNA結(jié)構(gòu)。

（2）分子間的DNA三螺旋結(jié)構(gòu)一定條件下，單鏈脫氧核苷酸能插入DNA螺旋大溝特定區(qū)域，通過氫鍵形成局部分子間DNA三螺旋結(jié)構(gòu)。（3）平行的DNA三螺旋結(jié)構(gòu)指三螺旋中第三條鏈的序列與DNA第一條鏈的序列相同，方向也相同。這種結(jié)構(gòu)因與基因重組recombination有關(guān)，稱R-DNA。5）DNA的四鏈結(jié)構(gòu)(G-quarter)X衍射發(fā)現(xiàn)，polyG能采取四螺旋構(gòu)象，螺旋單元是鳥嘌呤的四聯(lián)體，4個(gè)G有序排列在一個(gè)近正方形片層中，相鄰堿基間G-G氫鍵相連，形成首尾相接的環(huán)形，以螺旋方式堆積而成，每片層含4個(gè)G，分別來(lái)自4條多聚G鏈。1989年，Sundpuist等模擬一種原生動(dòng)物棘毛蟲端粒DNA時(shí)，人工合成了一段DNA，發(fā)現(xiàn)在一定條件下模擬的富-G單鏈DNA可形成四鏈體DNA，推測(cè)染色體端粒尾的單鏈之間也形成了四鏈DNA。

富-G的DNA序列多見于一些在功能上及進(jìn)化上都相當(dāng)保守的基因組區(qū)域：研究表明，富-GDNA鏈所形成的G4－DNA可能是作為分子之間相互識(shí)別的元件之一。在細(xì)胞中起特殊作用。

舉例：端粒DNA是四鏈DNA

線性染色體DNA的3'-端有幾百個(gè)類似AGGGTT（人）；GGGGTT（四膜蟲）；酵母G1-4T，G1-8A的序列；特點(diǎn):4個(gè)G通過配對(duì)形成分子內(nèi)或間的四螺旋，依賴于環(huán)境有不同構(gòu)象?！涠肆Ｃ福阂环N核糖核蛋白酶，催化端粒中重復(fù)單位的延長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)端粒的3'-端。

在無(wú)限增殖的真核細(xì)胞（如癌細(xì)胞）中調(diào)節(jié)端粒丟失與端粒DNA從頭合成之間的平衡。科學(xué)家把端粒稱為“生命之鐘”，因?yàn)樗械募?xì)胞每分裂一次，端粒就縮短一點(diǎn)。當(dāng)端粒短到不能再縮時(shí)，細(xì)胞就無(wú)法繼續(xù)分裂而死亡。“如果端?？s短了，細(xì)胞就會(huì)老化。相反，如果端粒酶的活動(dòng)顯著，端粒的長(zhǎng)度也就能得以保持，并且細(xì)胞衰老也將延后。癌細(xì)胞就是一個(gè)例子，癌細(xì)胞被認(rèn)為是具有永久生命力的。相反，某些特定的遺傳疾病會(huì)出現(xiàn)，一些有缺陷的端粒酶這樣的特征，導(dǎo)致細(xì)胞受到損害。這一發(fā)現(xiàn)有助于新的治療措施的發(fā)展。端粒被稱作“生命時(shí)鐘控制器”，如果未來(lái)人類找到了它的控制開關(guān)，人類或能實(shí)現(xiàn)“青春常駐”。2.4DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。超螺旋結(jié)構(gòu)是DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式，可分為正超螺旋與負(fù)超螺旋兩大類，它們?cè)谔厥馇闆r下可以相互轉(zhuǎn)變，如負(fù)超螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶溴乙錠拓?fù)洚悩?gòu)酶溴乙錠松馳DNA正超螺旋ThestructureofsupercoilsDNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。超螺旋結(jié)構(gòu)是DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式，可分為正超螺旋與負(fù)超螺旋兩大類。研究細(xì)菌質(zhì)粒DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)，天然狀態(tài)下該DNA以負(fù)超螺旋為主，稍被破壞即出現(xiàn)開環(huán)結(jié)構(gòu)，兩條鏈均斷開則呈線性結(jié)構(gòu)。在電場(chǎng)作用下，相同分子質(zhì)量的超螺旋DNA比線性DNA遷移率大，線性DNA又比開環(huán)的DNA遷移率大，以此可判斷質(zhì)粒結(jié)構(gòu)是否被破壞。超螺旋類型：①負(fù)超螺旋（纏繞不足時(shí)產(chǎn)生）右手反時(shí)針方向，主要存在于螺旋內(nèi)部。②正超螺旋（過度纏繞產(chǎn)生）右手順時(shí)針方向，在螺旋基礎(chǔ)上進(jìn)一步扭曲產(chǎn)生。超螺旋性質(zhì)：1.Tm升高，例：多瘤病毒DNA的超螺旋Tm′=140℃，正常Tm值：85~95℃。2.粘度降低，沉降速度加快，

由于結(jié)構(gòu)緊密，在凝膠電泳中的遷移率比松弛形分子加快，隨著卷曲量的增加，遷移率逐漸減慢，可分割形成電泳帶。超螺旋DNA的生物學(xué)功能：1.超螺旋結(jié)構(gòu)致密易向核內(nèi)組裝。2.超螺旋結(jié)構(gòu)影響雙螺旋的解旋能力，從而影響DNA分子與其它分子間的相互作用。生物體超螺旋大多數(shù)是負(fù)超，與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、修復(fù)有關(guān)。例：DNA復(fù)制起始時(shí)分子中的負(fù)超有助于起始因子結(jié)合到特定部位，起始復(fù)制，負(fù)超的保持主要依賴于拓?fù)洚悩?gòu)酶。

拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)鋵W(xué)：是數(shù)學(xué)的一個(gè)分科，研究形狀或圖象逐一連接轉(zhuǎn)化時(shí)，保持不變的形狀圖象的數(shù)學(xué)特征。在真核和原核生物細(xì)胞中，都有催化雙螺旋DNA的超螺旋化，或回到松弛狀態(tài)的酶，稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶，它能引起拓?fù)洚悩?gòu)反應(yīng)，使拓?fù)洚悩?gòu)體之間相互轉(zhuǎn)化。

無(wú)論拓?fù)洚悩?gòu)酶催化反應(yīng)的形式怎么不同，都與DNA鏈的切斷與縫合有關(guān)。根據(jù)作用機(jī)理不同分為Ⅰ型和Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶。Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoⅠ）特點(diǎn)：a.僅切斷雙鏈DNA中的一條鏈，催化瞬時(shí)的鏈斷裂和再連接反應(yīng)，連接數(shù)改變1.b.無(wú)需ATP供能，不催化需能的超螺旋化。

c.使高度超螺旋DNA松弛（染色體DNA是超螺旋化的）。拓?fù)洚悩?gòu)酶生物功能：

1.恢復(fù)在細(xì)胞增殖過程中產(chǎn)生超螺旋如雙螺旋在復(fù)制時(shí)被解開，在復(fù)制叉前面產(chǎn)生正超，轉(zhuǎn)錄過程也導(dǎo)致聚合酶前面產(chǎn)生正超，在酶后產(chǎn)生負(fù)超等。2.防止DNA過度超螺旋，使其保持在穩(wěn)定狀態(tài)。適當(dāng)?shù)某菪龑?duì)DNA結(jié)構(gòu)和與其它分子相互作用有影響，主要是：①調(diào)節(jié)復(fù)制起始；②保持基因穩(wěn)定；③促進(jìn)重組；④抑制有絲分裂。研究細(xì)菌質(zhì)粒DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)，天然狀態(tài)下該DNA以負(fù)超螺旋為主，稍被破壞即出現(xiàn)開環(huán)結(jié)構(gòu)，兩條鏈均斷開則呈線性結(jié)構(gòu)。在電場(chǎng)作用下，相同分子質(zhì)量的超螺旋DNA比線性DNA遷移率大，線性DNA又比開環(huán)的DNA遷移率大，以此可判斷質(zhì)粒結(jié)構(gòu)是否被破壞。質(zhì)粒的3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalentlyclosedcircularDNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)開環(huán)DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA有一條鏈斷裂，(opencircularDNA，簡(jiǎn)稱ocDNA)線狀質(zhì)粒DNA，即質(zhì)粒DNA在同一處兩條鏈都發(fā)生斷裂(linearDNA，簡(jiǎn)稱lDNA)。由于這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同，因此通常抽提的質(zhì)粒在電泳后往往出現(xiàn)3條帶，其中超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。

2.5RNA的結(jié)構(gòu)與功能細(xì)胞內(nèi)RNA功能主要是參與蛋白質(zhì)生物合成。20世紀(jì)80年代揭示了RNA功能多樣性。從大的方面講，概括其主要功能如下：①作用于RNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾；②參與基因表達(dá)的調(diào)控；③具有生物催化劑的功能；④遺傳信息的加工與進(jìn)化。

核心作用：基因表達(dá)的信息加工和調(diào)節(jié)。2)RNA也是遺傳物質(zhì)

低等生物如某些病毒和噬菌體也采用RNA作為遺傳物質(zhì)。

盡管RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)與DNA不同，但仍發(fā)揮與DNA相同的功能。不同的病毒，復(fù)制機(jī)制的細(xì)節(jié)不同，但基本原理一樣，都通過其互補(bǔ)鏈的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)。人類免疫缺陷病毒（HIV）侵入宿主T淋巴細(xì)胞，其中綠色部分為T淋巴細(xì)胞，紅色粒子為HIV病毒顆粒

由兩條單鏈正鏈RNA組成，每個(gè)RNA基因組約為9.7kb（從外到內(nèi)：外膜蛋白，內(nèi)膜蛋白，外殼蛋白，核衣殼蛋白+RNA，顆粒為反轉(zhuǎn)錄酶）采用RNA作為遺傳物質(zhì)的某些病毒：1

RNA的種類細(xì)胞核內(nèi)的RNA統(tǒng)稱為nRNA，組分十分復(fù)雜。nRNA由兩部分組成：一是核內(nèi)mRNA、tRNA和rRNA的初始轉(zhuǎn)錄混合物二是核內(nèi)小分子RNA(smallnuclearRNA，snRNA)mRNA、tRNA和rRNA各自的前體是其各基因的初始轉(zhuǎn)錄物。如：mRNA的前體是蛋白質(zhì)編碼基因的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，統(tǒng)稱核不均一RNA(hnRNA)。RNA既是信息分子，又是功能分子。生物功能的多樣性歸納:1.RNA在遺傳信息的翻譯中起決定作用rRNA在蛋白質(zhì)生物合成中起裝配和催化作用，催化肽鍵形成的肽基轉(zhuǎn)移酶活性由大亞基rRNA催化。tRNA起轉(zhuǎn)運(yùn)和信息轉(zhuǎn)換的作用，mRNA起信使和模板作用。2.RNA具有重要的催化功能和其他持家功能。自然界存在的核酶多數(shù)催化分子內(nèi)反應(yīng)，是RNA合成后加工的一種方式，包括自我切割、自我拼接、自我環(huán)化等。催化分子間反應(yīng)的核酶通常都與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成核糖核蛋白復(fù)合物。從這些復(fù)合物中分離RNA，有些單獨(dú)即具催化活性，如RNaseP中的MlRNA。2023/2/5分子生物學(xué)第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能72

3.RNA轉(zhuǎn)錄后加工和修飾依賴于各類小RNA

和其蛋白質(zhì)復(fù)合物。

RNA轉(zhuǎn)錄后加工包括:切割、修剪、修飾、異構(gòu)、附加、拼接等。各類小RNA和其蛋白復(fù)合物或選擇加工部位，或完成加工反應(yīng)，這些RNA常與蛋白形成復(fù)合物RNPs。2023/2/5分子生物學(xué)第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能73

4.RNA對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞功能具有重要調(diào)節(jié)作用。反義RNA(antisenseRNA)可通過與靶部位序列互補(bǔ)結(jié)合，或直接阻止其功能，或改變靶部位構(gòu)象而影響其功能。1995年發(fā)現(xiàn)線蟲中一些小RNA能夠關(guān)閉有關(guān)基因的表達(dá)，與植物中已知的“基因沉默”相似，由此認(rèn)識(shí)到基因功能可因RNA干擾(RNAinterference，RNAi)而受調(diào)節(jié)。

2023/2/5分子生物學(xué)第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能74基因沉默由雙鏈RNA介導(dǎo)，在兩個(gè)水平上發(fā)揮作用，一是在轉(zhuǎn)錄水平，抑制相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄，稱轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)；二是在轉(zhuǎn)錄后，結(jié)合并引起特異mRNA降解，稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。

2001年在人和鼠細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)RNAi作用，將它看成是生物界廣泛存在的基因調(diào)節(jié)方式。2.5.2RNA簡(jiǎn)要分述

1)mRNA

回顧：真核細(xì)胞mRNA的基本結(jié)構(gòu)屬于有編碼功能的mRNA非編碼mRNA

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)了一類非編碼mRNA，與傳統(tǒng)mRNA一樣，可進(jìn)行剪接和3ˊ端加尾修飾，但不具有典型開放閱讀框架(ORF)。廣泛分布于從果蠅到人類，非編碼mRNA的基因位于染色體重要功能位點(diǎn)。非編碼mRNA具有明顯生物功能，參與許多生理過程，如胚胎發(fā)育、腫瘤形成和抑制、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、染色體失活等近年提出：非編碼mRNA是“調(diào)控RNA(ribo-regulator)”概念。

細(xì)胞內(nèi)有特殊功能的RNA核酶

(Ribozyme)Ribozyme的催化功能與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)已知有多種核酶結(jié)構(gòu)：

RNaseP的RNA亞基(M1RNA)

錘頭型發(fā)夾型丁型肝炎病毒(HDV)基因組反基因組

Varkud衛(wèi)星(Vs)質(zhì)粒類型I和Ⅱ自我剪接內(nèi)含子microRNA

microRNA又稱微小RNA，是指植物和動(dòng)物細(xì)胞中自然產(chǎn)生的一類長(zhǎng)度為18~25bp的小分子RNA。1993年，VictorAmbros等在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，基因lin-4不編碼蛋白質(zhì)，它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中有一個(gè)長(zhǎng)度為22nt的miRNA。2001年，來(lái)自美、德等國(guó)的3個(gè)不同研究小組通過大規(guī)模克隆與功能研究，揭示了這些小分子RNA在動(dòng)植物體內(nèi)的調(diào)控作用，至此才被命名為microRNA。2002年，這3個(gè)小組分別報(bào)道從模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)了miRNA，之后在動(dòng)植物體內(nèi)被大量發(fā)現(xiàn)和克隆。目前從擬南芥和水稻中發(fā)現(xiàn)的miRNA已逾200種。miRNA的基因來(lái)源于染色體非編碼蛋白區(qū)的一段，有自身編碼基因，位于基因間或內(nèi)含子區(qū)，由長(zhǎng)約75bp的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體RNA被DicerRNase酶切而成。miRNA在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的功能：與特異性mRNA的3’-UTR堿基配對(duì)，通過阻止這些mRNA的翻譯來(lái)實(shí)現(xiàn)沉默基因的表達(dá)，或?qū)е履繕?biāo)mRNA降解。miRNA能通過NorthernBlot被檢測(cè)。1997年，普魯西納朊病毒prion朊病毒是蛋白質(zhì)病毒，只有蛋白質(zhì)而沒有核酸的病毒。合成朊病毒所需的信息，有可能是存在于寄主細(xì)胞之中的;蛋白質(zhì)指導(dǎo)下的蛋白質(zhì)合成;朊病毒致病的“蛋白質(zhì)構(gòu)象致病假說”.朊病毒(prion)2.5真核生物染色體及其組裝1.真核生物染色體（Chromosome）細(xì)胞周期大部分時(shí)間染色體以染色質(zhì)形式存在。結(jié)構(gòu)隨生長(zhǎng)周期改變，間期染色質(zhì)是松散的纖維狀細(xì)絲，由核小體成串排列而成，并充滿整個(gè)細(xì)胞核。一旦復(fù)制完成染色質(zhì)高度濃縮成染色體。

2.1染色體2.1.1染色體—遺傳物質(zhì)的主要載體染色體在遺傳上起著主要作用,因?yàn)橛H代能夠?qū)⒆约旱倪z傳物質(zhì)以染色體（chromosome）的形式傳給子代，保持了物種的穩(wěn)定性和連續(xù)性。Thenucleusofanondividingcell(interphase)isfilledwithadiffusematerialcalledChromatin,socalledbecauseearlymicroscopistsfoundthatitstainedbrightlywithcertaindyes.摘自:Lehninger,3rd,p35ChromatinconsistsofDNAandproteinsboundtightlytogetherandisthesubstanceofthechromosomes,whichdonotcondenseandbecomeindividuallyvisibleuntilthecellisreadytodivide.染色體包括DNA和蛋白質(zhì)兩大部分。同一物種內(nèi)每條染色體所帶DNA的量是一定的，但不同染色體或不同物種之間變化很大，人X染色體有1.28億個(gè)核苷酸對(duì)，而Y染色體只有0.19億個(gè)核苷酸對(duì)。2.2真核細(xì)胞染色體的組成作為遺傳物質(zhì)，染色體具有如下特征：①分子結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定；②能夠自我復(fù)制，使親子代之間保持連續(xù)性；③能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而控制整個(gè)生命過程；④能夠產(chǎn)生可遺傳的變異。2.3.蛋白質(zhì)

染色體蛋白主要分為組蛋白和非組蛋白兩類。

真核細(xì)胞的染色體中，DNA與組蛋白的質(zhì)量比約為1：1。DNA、組蛋白和非組蛋白及部分RNA組成了染色體。

組蛋白真核生物染色質(zhì)含5種組蛋白：H1，H2A，H2B，H3，H4，H5含量豐富，富含堿性Arg或Lys。組蛋白在不同物種中具高度保守性。H4最保守，其aa序列在大鼠、豬、牛中完全一樣，與碗豆相比102個(gè)aa中只相差2個(gè)。某些物種精子染色質(zhì)含魚精蛋白，而不是組蛋白。

組蛋白具有如下特性：1、進(jìn)化上的極端保守性不同種生物組蛋白的氨基酸組成十分相似。牛、豬、大鼠的H4氨基酸序列完全相同，與豌豆序列相比也只有兩個(gè)氨基酸的差異。2、無(wú)組織特異性只有鳥類、魚類及兩棲類紅細(xì)胞染色體不含H1而帶有H5，精細(xì)胞染色體的組蛋白是魚精蛋白。朱玉賢，《現(xiàn)代分子生物學(xué)》，高等教育出版社；趙亞華，《分子生物學(xué)教程》，科學(xué)出版社；孫乃恩，《分子遺傳學(xué)》，南京大學(xué)出版社；閻隆飛，分子生物學(xué)》，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社；李振剛，《分子遺傳學(xué)》，科學(xué)出版社；沈羽非，《真核基因表達(dá)調(diào)控》，北京高等教育出版社；Lewin,B,GenesVII,OxfordUniversityPress；TurnerP.C.etal.MolecularBiology,ScienceExpress；WeaverR.MolecularBiology,ScienceExpress。3、肽鏈上氨基酸分布的不對(duì)稱性堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上，而大部分疏水基團(tuán)都分布在C端。堿性的半條鏈易與DNA的負(fù)電荷區(qū)結(jié)合，而另外半條鏈與其他組蛋白、非組蛋白結(jié)合。4、存在較普遍的修飾作用，如甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等修飾作用只發(fā)生在細(xì)胞周期的特定時(shí)間和組蛋白的特定位點(diǎn)上。按形態(tài)和功能不同，染色質(zhì)分兩類：常染色質(zhì)(euchromatin)異染色質(zhì)(heterochro-matin)。2.1.2.染色質(zhì)和核小體由DNA和組蛋白組成的染色質(zhì)纖維細(xì)絲是許多核小體連成的念珠狀結(jié)構(gòu)。

2.6DNA的變性、復(fù)性、分子雜交1）DNA的變性

雙鏈DNA中配對(duì)堿基的氫鍵不斷處于斷裂和再生狀態(tài)中，穩(wěn)定性較低的富含A-T的區(qū)段更明顯。

雙螺旋DNA熔解成單鏈的現(xiàn)象稱DNA變性。隱藏在雙螺旋內(nèi)部的發(fā)色團(tuán)，變性后成為單鏈露出，使DNA物化性質(zhì)變化，包括：

1.DNA溶液粘度下降

2.沉淀速度增加，浮力密度上升

3.紫外吸收光譜變化

4.生物活性喪失紫外吸收光譜變化是檢測(cè)變性的最簡(jiǎn)單方法。

核酸在260nm有強(qiáng)吸收峰，表示為A260nm

吸收光的量取決于核酸分子結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)越有序，吸收的光越少。游離的核苷酸比單鏈RNA和DNA吸收更多的光，而單鏈RNA或DNA的吸收又比雙鏈DNA分子多。三者的A260nm數(shù)值如下：

雙鏈DNAA260nm=1.00

單鏈DNAA260nm=1.37游離堿基、核苷酸A260nm=1.60（以50ug/mlDNA溶液在A260下測(cè)定）DNA變性主要因素：【維持DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要是氫鍵和堿基堆積力,凡破壞這兩種力的因素都可使螺旋解鏈變性】

使DNA變性的主要因素有：

加熱（生理溫度以上）極端pH值有機(jī)溶劑：尿素，甲酰胺等加熱使DNA變性后，天然DNA和變性DNA的紫外吸收值相差34%左右，吸收值增加的中點(diǎn)稱熔解溫度。RNA的Tm較復(fù)雜，雙鏈RNA的Tm與DNA相近。單鏈RNA內(nèi)的雙螺旋區(qū)域有限，因此變性性質(zhì)和變化程度不及DNA，其Tm較低、變性曲線較寬。2023/2/51062）DNA的復(fù)性

變性DNA在一定條件下重新恢復(fù)雙鏈的過程稱復(fù)性。復(fù)性必須滿足二個(gè)條件：

①高離子強(qiáng)度，以弱除兩條鏈中磷酸基團(tuán)間排斥力，通常在0.15-0.50mol/L的NaCl的條件下進(jìn)行復(fù)性；②較高溫度，可破壞隨機(jī)形成的無(wú)規(guī)則氫鍵，但太高，不能形成有效氫鍵和維持穩(wěn)定的雙螺旋。2023/2/5分子生物學(xué)第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能107影響復(fù)性速度的因素：1.分子簡(jiǎn)單如多聚dC-多聚dG變性后彼此容易發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)鏈，可很快復(fù)性。真核生物DNA序列復(fù)雜，同樣條件下尋找互補(bǔ)鏈時(shí)間長(zhǎng)，復(fù)性速度慢。序列越復(fù)雜，所需時(shí)間越長(zhǎng)，速度越慢因此，復(fù)性與DNA分子的復(fù)雜性有關(guān)。復(fù)性是個(gè)緩慢過程，限速步驟是互補(bǔ)鏈之間的精確碰撞。2.DNA濃度同種DNA濃度越高，互補(bǔ)鏈碰撞機(jī)會(huì)越多，復(fù)性速度加快。3.DNA片段長(zhǎng)度片段長(zhǎng)的線狀分子擴(kuò)散受到妨礙，減少發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)鏈的機(jī)會(huì)。因此，復(fù)性時(shí)要將DNA剪切成400bp大小的片段，增加復(fù)性速度。2023/2/5分子生物學(xué)第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能1084.溫度,復(fù)性溫度不宜過低，一般最佳溫度在Tm－25℃。【正常Tm：85-95℃】。5.陽(yáng)離子濃度溶液陽(yáng)離子濃度能降低負(fù)電荷DNA鏈間排斥。通常鹽濃度高，復(fù)性速度快。復(fù)性主要依靠?jī)涉湹膲A基間氫鍵和堿基疏水性堆積作用，電荷存在不利于復(fù)性。因此鹽離子造成的屏蔽作用有利于復(fù)性，但只在小于0.4mol/L濃度時(shí)，才與鹽濃度有關(guān)。為比較不同DNA復(fù)性能力，規(guī)定復(fù)性實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)條件：

400核苷酸長(zhǎng)度；

Tm-25℃的溫度；陽(yáng)離子強(qiáng)度0.18mol/L。

科研中用3種方法測(cè)定DNA復(fù)性程度：

①

減色效應(yīng)，可跟蹤A260的O.D值；②用S1核酸酶水解,將樣品完全或部分水解，測(cè)定抗

S1核酸酶水解的量。③羥基磷灰石柱層析

羥基磷灰石是一種磷酸鈣鹽，經(jīng)一定處理后，具有吸附雙鏈DNA的能力，只允許單鏈DNA通過，從而可間接以算出剩余雙鏈DNA的量。2023/2/5分子生物學(xué)第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能110分子雜交指親緣關(guān)系相近不同來(lái)源的DNA單鏈或DNA單鏈與RNA單鏈間通過堿基互補(bǔ)形成雜交分子的過程。類型：1.溶液雜交（solutionhybridization）指將不同來(lái)源的DNA變性后，在溶液中進(jìn)行雜交。2.濾膜雜交（filterhybridization）用硝酸纖維素制成的濾膜，可吸附單鏈DNA或RNA，將變性DNA或RNA吸附到膜上再進(jìn)行雜交。2023/2/5分子生物學(xué)第二章核酸的結(jié)構(gòu)與功能111

利用濾膜雜交已有幾種不同目的雜交法：

Southernblot(1975年E.Southern

發(fā)明)

鑒定DNA的雜交方法

Northernblot用于RNA研究方面的分析

Westernblot

是專門針對(duì)蛋白質(zhì)的分析鑒定技術(shù)。如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)以其配體的親和反應(yīng)，抗原-抗體反應(yīng)等。

經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA分子，都必須通過毛細(xì)管或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地“吸印”轉(zhuǎn)移到濾膜上，因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交”。由于該方法是E.M.Southern首先設(shè)計(jì)出來(lái)的，所以又叫做Southernblot。Southernblot原理：是將待檢測(cè)的DNA樣品固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號(hào)。應(yīng)用：遺傳病檢測(cè)、DNA指紋分析和PCR產(chǎn)物判斷。標(biāo)記物標(biāo)記物應(yīng)具備的條件：

（1）標(biāo)記后的探針的分子結(jié)構(gòu)要盡可能與原來(lái)的分子結(jié)構(gòu)相同，絕不影響其堿基配對(duì)特異性，不影響探針分子的主要理化特性，尤其是雜交特性。（2）標(biāo)記探針的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、省時(shí)、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、靈敏度高。（3）穩(wěn)定性好、環(huán)境污染少、價(jià)廉。雜交

預(yù)雜交(加入雜交液，放入42℃雜交爐中，鮭魚精DNA100℃加熱變性5min，迅速加到雜交瓶中，使其濃度達(dá)到100μg/ml。繼續(xù)雜交4hr

)。雜交(倒出預(yù)雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42℃的雜交液，同樣加入變性的鮭魚精DNA。將探針100℃加熱5min，使其變性，迅速加到雜交瓶中。42℃雜交過夜。WesternBlot

原理：經(jīng)過SDS分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢察電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。實(shí)驗(yàn)步驟：蛋白樣品的制備；經(jīng)過SDS分離樣品；分離的蛋白轉(zhuǎn)移到膜載體上，轉(zhuǎn)移后首先將膜上未反應(yīng)的位點(diǎn)封閉起來(lái)以抑制抗體的非特異性吸附；用固定在膜上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記（一抗）結(jié)合；洗去未結(jié)合的一抗，加入酶偶聯(lián)或放射性同位素標(biāo)記的二抗，通過顯色或放射自顯影法檢測(cè)凝膠中的蛋白成分。（1）RNA的完整性。（2）轉(zhuǎn)膜完全。（3）探針標(biāo)記的效率、變性。（4）防同位素污染。（5）壓片曝光時(shí)間。NorthernBlot

2.7DNA限制圖譜DNA的限制圖譜:DNA限制酶切片段沿染色體或染色體片段的DNA長(zhǎng)鏈上依次排列的順序。DNA限制酶：RestrictionEndonuclease限制性DNA內(nèi)切酶，是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。物理圖譜物理圖譜：有關(guān)構(gòu)成基因組