第二章 DNA的復制

第2章DNA的復制、損傷與修復中山醫(yī)學院生物化學教研室銀巍yinwei@遺傳物質的分子機制分子生物學的核心Watson&Crick:

一種遺傳物質，必須能行使兩種功能，即自我復制和對細胞的高度特異性的影響遺傳物質的基本屬性：基因的自我復制控制性狀的表達復制(replication)是指遺傳物質的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復制親代DNA子代DNA本章主要內容：

復制的一般特征

DNA復制的酶學復制的過程逆轉錄和其他復制方式

DNA損傷（突變）與修復DNA復制DNAReplication第一節(jié)復制的方式——半保留復制(semi-conservativereplication)雙向復制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復制(semi-discontinuousreplication)復制的基本規(guī)律一、半保留復制是DNA復制的基本特征DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制。半保留復制的概念:AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復制過程中形成的復制叉子代DNA子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式:

全保留式半保留式混合式密度梯度實驗:——實驗結果支持半保留復制的設想。含重氮-DNA的細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結果(CsClgradientcentrifuge)

N15

N14

DNASemi-ConservationReplicationM.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:675,1958.按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復制的意義:遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，但不是絕對的。原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制。二、DNA復制從起始點向兩個方向延伸形成雙向復制復制中的放射自顯影圖像A.環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點B.復制中的兩個復制叉C.復制接近終止點(termination,ter)oriterABC復制中的DNA復制原點復制叉真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復制子(replicon)

。復制子是獨立完成復制的功能單位。5’3’oriorioriori5’3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復制3’三、DNA一股子鏈復制的方向與解鏈方向相反導致半不連續(xù)復制3535解鏈方向3′5′3′3′5′領頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)三、DNA一股子鏈復制的方向與解鏈方向相反導致半不連續(xù)復制順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領頭鏈(leadingstrand)

。另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱為隨從鏈(laggingstrand)

。復制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制的半不連續(xù)性。復制時DNA雙鏈解開分成二股單鏈，新鏈沿著張開的二股單鏈生成，復制中形成的這種Y字形的結構稱為復制叉。復制叉（replicationfork）DNA復制的酶學第二節(jié)TheEnzymologyDNAReplication參與DNA復制的物質:底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol；模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質因子。一、核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復制的基本化學反應(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPiDNA鏈的延伸（ElongationofaDNAchain）聚合反應的特點:DNA新鏈生成需引物和模板；新鏈的延長只可沿5→3方向進行。二、DNA聚合酶催化核苷酸之間聚合全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性2.核酸外切酶活性5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性:53外切酶活性:?能切除突變的DNA片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。核酸外切酶活性:（一）原核生物的DNA聚合酶分為三型DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ原核生物的DNA聚合酶功能：DNA-polⅠ(109kD）對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。ArthurKornberg

1918StanfordUniversity

Stanford,CA,USATheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。

Large(Klenow)fragmentofDNApolymeraseIDNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生突變，細菌依然能存活。DNA-polⅡ對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認為，它參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復。功能：DNA-polⅢ(250kD)是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。亞基（130000）主要功能是合成DNA亞基具有35外切酶活性（校正功能）亞基可增強其活性亞基可能起組裝作用核心酶由、和亞基組成：DNA聚合酶Ⅲ的β-鉗子2個-亞基分別和1個核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在復制叉1個全酶分子的2個核心酶能夠相對獨立運動，分別負責合成前導鏈和后隨鏈。功能：-復合物是DNA夾子加載蛋白，負責將可沿DNA鏈滑動的一對-亞基（DNA夾子）加載于DNA，使DNA聚合酶Ⅲ具有持續(xù)合成能力。-復合物由6種亞基組成：、、、、、（二）常見的真核細胞DNA聚合酶有五種DNA-pol起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復制。在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。在線粒體DNA復制中起催化作用。DNA-pol

DNA-polDNA-polDNA-pol真核生物的DNA聚合酶三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇功能是復制保真性的酶學依據復制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準確傳代的基本原理。此外還需酶學的機制來保證復制的保真性。（一）核酸外切酶活性在復制中辨認切除錯配堿基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來的酶，外切酶是有方向性的。A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。DNApolⅠ的校讀功能（二）復制的保真性依賴正確的堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子結構協(xié)調非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。DNA聚合酶具有監(jiān)控進入的dNTP配對的能力。DNA聚合酶還能夠區(qū)分rNTP和dNTP，DNA聚合酶的活性中心對rNTP有空間排斥作用。DNA聚合酶的活性中心催化DNA合成只有當正確的堿基配對形成之時，引物的3-OH和進入的dNTP的-磷酸基團才能處于適當的位置，發(fā)生催化反應，形成3,5-磷酸二酯鍵。嘌呤的化學結構能形成順式和反式構型，與相應的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應處于反式構型。遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能；復制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。DNA復制的保真性至少要依賴三種機制：四、復制中的分子解鏈伴有DNA分子拓撲學變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)在研究復制時，將與復制有關的蛋白質命名為：

DnaA,DnaB,DnaC,‥‥‥DnaX

將相關的基因命名為：

dnaA,dnaB,dnaC,‥‥‥dnaXMapoftheE.colichromosome解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。引物酶(primase)——復制起始時催化生成RNA引物的酶。單鏈DNA結合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整。108局部解鏈后（二）DNA拓撲異構酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈復制過程正超螺旋的形成：解鏈過程中正超螺旋的形成既能水解、又能連接磷酸二酯鍵。

拓撲異構酶Ⅰ

拓撲異構酶Ⅱ拓撲異構酶分類：拓撲異構酶作用特點：拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應不需ATP。拓撲異構酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。作用機制：五、DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式：HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’DNA連接酶的作用：DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：DNA生物合成過程TheProcessofDNAReplication第三節(jié)（一）復制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成E.coli復制起始點oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復序列

反向重復序列53531.DNA解鏈MapoftheE.colichromosome復制起點的一般特征:①由多個獨特的短重復序列組成。②短重復序列被多亞基的復制起始因子所識別并結合。③一般富含AT，利于雙螺旋DNA解旋，以產生單鏈DNA復制模板。DnaA蛋白辨認起始點,形成起始復合物DnaB蛋白解螺旋DnaC蛋白協(xié)助DnaB在多種蛋白質參與下，DNA解開成單鏈SSB維持單鏈穩(wěn)定E.coliDNA復制起始

Dna盒DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構酶引物酶SSB35352.引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶(DnaG)和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物3'HO5'引物酶（二）復制的延長過程：領頭鏈連續(xù)復制，隨從鏈不連續(xù)復制復制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol先導鏈或領頭鏈(leadingstrand)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復制是連續(xù)進行的，得到一條連續(xù)的子鏈。5’3’3535解鏈方向復制的半不連續(xù)性3535解鏈方向復制方向與解鏈方向相反，須等待解開足夠長度的模板鏈才能繼續(xù)復制，所得到一條由不連續(xù)片段組成的子鏈。后隨鏈或隨從鏈(laggingstrand)

岡崎片段（Okazakifragment）3’5’3’3’5’

在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制的復制片段在復制的終止點(ter)處匯合。與Tus蛋白結合，形成Tus-Ter復合物，阻止復制叉前進。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）復制的終止過程：切除引物、填補空缺、連接切口555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接：真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不是同步起動。

復制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復制因子(replicationfactor,RF)。（一）真核生物復制的起始與原核基本相似染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA引物，去除后留下空隙。（二）端粒酶參與解決染色體末端復制問題端粒酶參與解決染色體末端復制問題前導鏈產生完整的子染色單體。后隨鏈3端留下縮短的未復制的ssDNA區(qū)。端粒(telomere)

指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構。端粒的功能：維持染色體的穩(wěn)定性維持DNA復制的完整性端粒的結構特點：由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。末端DNA序列是多次重復的富含G、C堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…真核生物復制子多、岡崎片段短、復制叉前進速度慢等；DNA復制從引發(fā)進入延伸階段發(fā)生DNA聚合酶/轉換；切除岡崎片段RNA引物的是核酸酶RNaseHⅠ和FEN1等。真核生物與原核生物DNA復制的差異：逆轉錄和其他復制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第四節(jié)雙鏈DNA是大多數生物的遺傳物質。某些病毒的遺傳物質是RNA。少數低等生物如M13噬菌體，它的感染型只含單鏈DNA。原核生物的質粒，真核生物的線粒體DNA，都是染色體外存在的DNA。這些非染色體基因組，采用特殊的方式進行復制。一、線粒體DNA按D環(huán)方式復制環(huán)形、雙螺旋DNA分子兩條鏈一條為重鏈（H鏈），另一條為輕鏈（L鏈）dNTPDNA-polγ

線粒體DNA分子特點：有特異的復制起點；環(huán)形線粒體DNA兩條鏈（H和L）的復制不同步D環(huán)或取代環(huán)（displacementloop）：線粒體DNA復制開始以H鏈作為模板合成新的L鏈，取代原來的L鏈并和H鏈互補，而原來的L鏈則保持單鏈狀態(tài)，形成類似英文字母D的區(qū)域；兩條鏈具有不同的復制起點和相反的合成方向；線粒體DNA復制也需要RNA引物。線粒體DNA復制特點：二、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復制環(huán)形雙螺旋DNA分子；一條為模板鏈，另一條為非模板鏈。E.coli噬菌體DNA的分子結構特點：僅以一條鏈作為模板合成若干環(huán)形DNA分子拷貝；噬菌體DNA復制的方式是滾環(huán)復制。噬菌體DNA復制特點：噬菌體DNA復制首先由它自己編碼的A蛋白在非模板鏈上造成缺口，再以所產生的游離3端羥基作為引物，并在宿主細胞的DNA聚合酶、解旋酶和SSB蛋白等作用下合成新鏈，新鏈和模板鏈互補并取代了原來的非模板鏈。這種復制方式稱為滾環(huán)復制。滾環(huán)復制：3-OH5-P55533335'滾環(huán)復制5'5335+-雙螺旋DNA在復制起點解鏈不一定導致兩條鏈同時復制，也可能利用一條鏈作為模板起始DNA合成。雙螺旋DNA的兩條DNA鏈的復制起點也可能處于不同的位置。滾環(huán)復制和D環(huán)不對稱復制的存在說明：逆轉錄Reversetranscription

因發(fā)現(xiàn)逆轉錄病毒的遺傳物質而獲1975年諾貝爾獎的三位科學家鳥類Rous肉瘤病毒（RSV）感染正常細胞腫瘤DNA合成抑制劑轉錄抑制劑逆轉錄病毒RNA基因組和原病毒逆轉錄病毒感染哺乳動物細胞及其整合到宿主染色體Retroviralinfectionofamammaliancellandintegrationoftheretrovirusintothehostchromosome.逆轉錄病毒在宿主細胞內經歷原病毒再借助宿主RNA聚合酶轉錄、包裝而繁殖（一）逆轉錄合成雙鏈cDNA（二）雙鏈cDNA插入宿主染色體形成原病毒原病毒或前病毒：存在于真核染色體中和逆轉錄病毒RNA基因組相對應的雙鏈DNA序列。逆轉錄病毒（retroviruses）：RNA病毒，含有逆轉錄酶逆轉錄：在逆轉錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過程。RNA指導的DNA聚合酶活性；DNA指導的DNA聚合酶活性；RNAseH的活性是指它能夠從53和35兩個方向水解DNA-RNA雜合分子中的RNA。逆轉錄酶以tRNA為引物合成雙鏈cDNA逆轉錄酶有3種酶的活性：逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象：

RNA模板逆轉錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉錄酶雙鏈DNA*逆轉錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣具有遺傳物質的傳代與表達功能。逆轉錄酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶堿水解TTTT分子生物學研究可應用逆轉錄酶，合成DNA以mRNA為模板，逆轉錄合成與mRNA堿基序列互補的DNA鏈，稱為cDNA

complementaryDNADNA損傷（突變）與修復DNADamage(Mutation)&Repair第五節(jié)DNA突變具體指個別dNMP殘基以至片段DNA在構成、復制或表型功能的異常變化，也稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。一、突變的意義（一）突變是進化、分化的分子基礎自發(fā)突變/自然突變

（二）突變導致基因型改變沒有可察覺的表型改變個體之間基因型的差別稱為多態(tài)性（polymophism）（三）突變導致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎dbSNP—單核苷酸多態(tài)性數據庫，包括SNPs，小范圍的插入/缺失，多態(tài)重復單元，和微衛(wèi)星變異。DbSNP包含種族特異的頻率和基因型數據，實驗條件，分子上下文，及中性多態(tài)和臨床變異的定位信息。OMIM—在線人類孟德爾遺傳—約900個OMIM記錄的等位變異二、引發(fā)突變的因素物理因素：紫外線、各種輻射

UV胸苷酸二聚體的形成化學因素：常見的化學誘變劑化合物類別作用點分子改變堿基類似物如：5-溴尿嘧啶5-BUA5-BUG-A--T--G--C-羥胺類（NH2OH）TC-T--A--C--G-亞硝酸鹽（NO2）CU-G--C--A--T-烷化劑如：氮芥類，NitrominsGmGDNA缺失G運用沙門菌檢測致癌物：組胺酸異樣的沙門菌胞壁缺陷同時修復系統(tǒng)不活化a:接種在無組胺酸培養(yǎng)基中只有少數細菌生長；b-d:等量細菌接種到同樣培養(yǎng)基中，每盤中央放置由高到低梯度濃度的含待測樣品的濾紙，誘變劑可以提高回復突變率，因而增加菌落的生長。多種化學或物理因素造成細胞DNA損傷堿基丟失堿基改變核苷酸插入或缺失DNA鏈斷裂DNA鏈間共價交聯(lián)DNA損傷類型三、突變的類型（一）點突變（pointmutation）——指DNA分子上一個堿基的變異發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1、轉換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。2、顛換正常成人Hb(HbA)N–pro·

glu

·glu·

·

·

C鐮形紅細貧血病人Hb(HbS)N–pro·

val

·glu·

·

·

CCT

CGAGCACGTG（二）缺失（deletion）、插入(insertion)缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。谷酪蛋絲5’

……G

CA

GUA

CAU

GUC

……丙纈組纈正常5’……GA