目的基因的連接轉(zhuǎn)化refresh

實(shí)驗(yàn)三、PCR產(chǎn)物的電泳、回收目的基因的連接、轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.PCR產(chǎn)物的電泳、回收；2.PCR產(chǎn)物與T載體的連接3.感受態(tài)細(xì)胞的制備；4.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；5.鋪制LB培養(yǎng)平版；6.涂菌培養(yǎng)過(guò)夜。

實(shí)驗(yàn)回顧RNA提取RT-PCR目的DNA片段質(zhì)粒TA載體連接重組質(zhì)粒目的DNA轉(zhuǎn)化無(wú)質(zhì)粒的E.Coli

死亡有質(zhì)粒的E.Coli

存活PCR平板篩選一、PCR產(chǎn)物的電泳及回收1）PCR產(chǎn)物電泳：

15ul產(chǎn)物+3ul上樣液

1%瓊脂糖凝膠，100伏，30分鐘。8:10~~9:20預(yù)期PCR電泳結(jié)果結(jié)合片子講切膠的問(wèn)題

(不要切引物）2）

PCR產(chǎn)物的回收（擠膠法）

（1）在UV燈下，用手術(shù)刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，放入封口膜中；

（2）將切下來(lái)的膠塊，標(biāo)記好姓名，-20℃冰箱中。（3）放在封口膜內(nèi)直接擠壓，用加樣器吸取擠壓后得到的液體。1、凍融法：1）

在UV燈下，用手術(shù)刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下,-70oC冷凍至少15min。2）

在65oC水浴中使膠融化，加入等倍體積TE-飽合酚,劇烈振蕩30秒鐘，然后-70oC冷凍15min。3）

室溫融化后，12,000rpm離心5min，將上層水相移至另一管中，用2.5倍體積乙醇和0.1倍體積3mol/LNaAc(pH5.2)沉淀、漂洗和干燥DNA。

常見(jiàn)回收方法介紹2、擠膠法

（1）在UV燈下，用手術(shù)刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，放入小離心管中；

（2）將切下來(lái)的膠塊，-70oC冷凍15min；

（3）放在封口膜內(nèi)直接擠壓，用加樣器吸取擠壓后得到的液體。3、回收試劑盒（商業(yè)化）。1）

當(dāng)回收的片段是用于與載體的連接，準(zhǔn)確判斷回收片段的DNA含量是非常重要的。將回收得到的片段進(jìn)行電泳分析，通過(guò)與DNAMarker條帶的比較，可以粗略判斷回收片段的量，為連接反應(yīng)估計(jì)加入多少目的基因片段提供參考，可增加連接效率。2）如何在膠上估計(jì)DNA的含量：

DNAmarker參比法。（50ng/5ul）

電泳樣本：Marker5ul、T載體1ul、回收片段。電泳后通過(guò)判斷電泳樣品的亮度，大致判斷連接片段和載體的比例?；厥蘸箬b定二、PCR產(chǎn)物與T載體的連接

T載體一般是從公司購(gòu)買(mǎi)的，因此，載體DNA的含量和濃度是已知的。連接反應(yīng)成敗的關(guān)鍵是估計(jì)目的DNA的量?？砂聪铝信浞竭M(jìn)行連接反應(yīng)：回收的DNA片段7lT載體1lT4DNA連接酶buffer1lT4DNAligase1l終體積10l

輕彈管底混合，離心機(jī)甩一下，置25oC水浴1~2h。連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化，也可以置-20oC保存?zhèn)溆?。（低溫連接效果比室溫好）9:20~~9:45TA克隆原理

1、TagDNA

聚合酶的一個(gè)功能：使PCR產(chǎn)物的3`端突出一個(gè)A。3`

AA3`5`5`3`

TT3`5`5`2、商業(yè)設(shè)計(jì)的T載體：在3`端多出一個(gè)T。3、兩者的粘性末端可以互補(bǔ)配對(duì)。應(yīng)用時(shí)避免反復(fù)凍融，防止T的斷裂丟失。如果與T載體連接后主要以自身環(huán)化為主，要考慮T可能已經(jīng)丟失。其他說(shuō)明：1）

連接反應(yīng)的關(guān)鍵是目的基因片段與載體的比例，一般片段與載體比例為2:1或3:1（摩爾比），根據(jù)片段大小決定比例。2）平端連接平端連接通常需要先將載體的5端磷酸去掉，然后再進(jìn)行連接，這樣可以防止載體的自身環(huán)化。當(dāng)載體的5端磷酸去掉后，片段與載體的連接就會(huì)留下一個(gè)缺口，連接酶由于載體5端缺乏磷酸而無(wú)法形成磷酸二酯鍵，轉(zhuǎn)化入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酶會(huì)將缺乏的磷酸基團(tuán)加上，再形成磷酸二酯鍵。

三、感受態(tài)細(xì)胞的制備9:45~10：45

感受態(tài)細(xì)胞制備原理

培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌在低滲CaCl2

存在的情況下，細(xì)菌變得膨脹而易于外源基因的導(dǎo)入。另外，鈣離子溶液處理的細(xì)胞對(duì)外源DNA的攝取能力增強(qiáng)。說(shuō)明：1）感受態(tài)細(xì)胞的膜已經(jīng)很脆，應(yīng)該超低溫保存。

如果反復(fù)凍融會(huì)使細(xì)胞活力受影響，而且細(xì)胞膜的變化可能復(fù)原，由感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)回轉(zhuǎn)到普通細(xì)胞狀態(tài)，失去接受外源DNA的能力。2）無(wú)菌操作。在火焰附近操作，火焰附近是無(wú)菌區(qū)。各種器具均需消毒。無(wú)菌超凈工作臺(tái)

感受態(tài)細(xì)胞的制備1）將大腸桿菌在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，置37oC12-16小時(shí)。2）

次日從瓊脂平板上取一單菌落，于2mlLB培養(yǎng)基中，37oC，225rpm速度震蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。3）

取1ml上述培養(yǎng)物接種于100mlLB培養(yǎng)基中，37oC，225rpm的速度震蕩培養(yǎng)直至OD值為0.5左右(約3小時(shí))。

（上述1－3步驟已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)室完成）水浴搖床5）棄上清，除凈剩余液體，然后加入100ul

冰冷的100mmol/LCaCl2致敏液懸浮細(xì)胞，冰浴5分鐘。6）6000rpm，離心5分鐘，回收細(xì)胞，棄上清，加入100ul冰冷100mmol/LCaCl2溶液，懸浮細(xì)胞。7）4oC可保存1-2周；長(zhǎng)期保存，可加甘油至終濃度為15%，置-70oC備用。（無(wú)菌操作）4）

取1ml菌液冰浴5min，然后6000rpm，離心5min，收集菌體。LB培養(yǎng)基瓊脂平板的制備蛋白胨：10g酵母提取物：5gNaCl：10g瓊脂：15g蒸餾水：800ml終體積：1L高壓滅菌20分鐘。學(xué)生操作：冷卻至50oC，加入抗生素。

鋪瓊脂平板10:45~~11:00下午實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化2、平板篩選4、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

1）將200l感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，然后加入3lDMSO,混合后，加入10l連接反應(yīng)液(含重組質(zhì)粒),

溫和混勻，置冰上10分鐘。

(目的：防止細(xì)胞被脹破。)

2）42oC，45秒，然后迅速放回冰中1-2分鐘。13:00~~14:3010l連接反應(yīng)液一般可以進(jìn)行2-3次轉(zhuǎn)化

3）加入1mlLB培養(yǎng)液，37oC，225rpm搖蕩培養(yǎng)30分鐘。4）6,000rpm，離心10秒鐘，倒掉上清，用剩余的約200lLB培養(yǎng)液重懸菌體。5）將殘存菌液輕輕混勻，鋪于含有氨基芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上涂勻，室溫放置5-10min，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)14-16小時(shí)。轉(zhuǎn)化后的平皿面朝下放置：防止水蒸氣形成的水滴影響細(xì)菌單菌落的形成。轉(zhuǎn)化菌的藍(lán)白篩選基本原理：載體中LacZ基因可編碼b-半乳糖苷酶，后者可分解培養(yǎng)物中的X-gal，使其呈