說明分析成果

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)DNAsequencing技術(shù)的發(fā)展 Walter 1975DNAsequencingdeveloped:WalterGilbertandAllanMaxamofHarvardUniversityandFredSangerofCambridgeUniversitysimultaneouslycomeupwithtwotechniquesfordeterminingtheexactsequenceofbasesthatmakeupagene.GilbertandSangersharethe1980NobelPrize(alsowithPaul方末端終止法Sanger-Coulsondideoxyorenzymatic)sequencing化學(xué)裂解法Maxam-Gilbertchemical)DNA300～500技術(shù)由三部分產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的 段,差別僅1個(gè)堿基在變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳膠的放射性自顯影技術(shù)末端終止法 DNA合成的底 ordiphosphate

3’-5’phosphodiesterPhosphodiesterbondsin-O-P-O- O

3’-5’Phosphodiester H

3’-5’phosphodiester-O-P-O- H -O-P-O- O HH HDNADNAHDNApolymeraseIfragmentHHHDideoxySequencingofHReactionRequirementsDideoxySequencingof同位素32P35S基本原

DNA序列其獨(dú)特性在 采用聚丙烯酰胺區(qū)分長(zhǎng)度僅差1個(gè)堿基的單鏈DNA一個(gè)樣品的4 可以在一個(gè)泳道內(nèi)電泳，從而降 泳道間遷移率差異對(duì)精確性的影響過模板反反應(yīng)后的變性、毛細(xì)管電數(shù)據(jù)分模板DNA用質(zhì)粒抽提或膠純化試劑盒得到的質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物模 在滅菌水里如ddH2O,超純水；注意不 通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定模板濃度（〉0.1ug/ul質(zhì)量(OD260/OD280在1.6-1.8之間反 結(jié)果一般包括個(gè)文件1）.abi件，即測(cè)

序列有重復(fù) 突 是同語言有關(guān) ,黑猩猩也含有這 .人類因與黑猩猩foxP2順序只有極少差N冬氨酸T氨酸S,絲氨酸;Q,谷胺酰氨酸 引自:Nature418:869-872,一 缺失(genelosses)點(diǎn)突變--類轉(zhuǎn)換:一種嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N嘌呤,A→G或顛換:一種嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N嘌呤,或相反C→A或A→T核苷酸插入或缺失突堿基代換會(huì)產(chǎn)生4種不同義突變:不改變氨基酸順序的堿基代 子發(fā)生改變的堿基代無義突變:產(chǎn)生終止 的突變,使翻譯終止,產(chǎn)連讀突變:終止 ,產(chǎn)生延伸的多錯(cuò)義突變的堿基代換發(fā)生 的突變, 位置,將終止 子,使翻譯延續(xù),產(chǎn)生延長(zhǎng)的多肽鏈. 子的讀框,但會(huì)增加或減少突 基數(shù)不成倍數(shù),使后續(xù) 缺失(gene （genetranslocationand某一在腫瘤細(xì)胞中從的正常位置轉(zhuǎn)移到其它染色體的某個(gè)位置上稱為易位或重排。易位與重排易使癌被激活，或是抑癌失活，從而使細(xì)胞。細(xì)胞癌的編碼序列在DNA Burkitt淋巴瘤（8q24異位,激活C-myc）。其它類型 突二 突變的檢測(cè)方 （allelespecificoligonucleotide,單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP） （一）的檢 段，稱RFLP。AlleleIIAllele

Allele Allele

BclIRFLP（血友病等 等 特異性寡核苷酸探針及斑點(diǎn)雜交結(jié)探 正常探雜交結(jié)突變探突變型遺傳病的直 診 突變體富集（mutant-enriched 存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用連續(xù)二次的巢式PCR來擴(kuò)增包括存在酶位點(diǎn)編碼子的DNA片段相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DN 段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集?；瘜W(xué)（Chemicalcleavageofmismatch,基本原理 化學(xué)試劑，故又發(fā)展了碳化二亞胺檢測(cè)法refractory ARMS法與 法靈敏度比ARMS技 文單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strandconformational 32P-dNTP摻入PCR↓↓單鏈↓ ↓

2、4、5.該法簡(jiǎn)單快速，被廣泛用于未知突變的檢測(cè)。由于該法的簡(jiǎn)便快速，特別適合大樣本突變研究的 變性高效液相色譜(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatographyDHPLC) 技術(shù)特點(diǎn)(HighResolutionMelt,原 變化從而雙鏈DNA在升溫過程中先后解開，形成不同融解曲線形狀 條件突變檢測(cè)靈敏HRM DNA甲基化檢在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷胞嘧啶的第五位碳原子上，這樣的胞嘧啶也叫做5胞嘧啶，如圖所，胚胎及維DNA亞硫酸鹽相關(guān)方法缺點(diǎn)CGGC將相對(duì)而言，Southern方法較復(fù)雜存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題不適用于混合亞硫鹽甲基化的胞嘧啶則不受影響。這樣DNA包含的甲基化信息就可轉(zhuǎn)化為序列亞硫酸氫 法（Bisulfitesequencing 處理的序列比較,判斷CpG位點(diǎn)是否 JiangM,etal.Rapid ficationofDNAmethylationbymeasuringrelativepeakheightsindirectbisulfite-pcrsequencingtraces.LabInvest2010;90(2):282-90.甲基化特異性的PCR（Methylation-specific MSPCR是一種快速檢測(cè)方法，只需要及少量DNA樣本。MSPCR方法是以引物中所有CpG位點(diǎn)胞嘧啶均甲基片段難擴(kuò)增，或特異性差等問題，整個(gè)CpG島軟件主要作用是輔助設(shè)計(jì)出具有甲基化(methylation)或硫化(bisulphite)的特殊聚合酶鏈鎖反應(yīng)的引物(primers)。在進(jìn)行DNA甲 目前這套專利權(quán)仍屬于 結(jié)合亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法（combined 甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析sistrand ysis，MS- 被分離開，隨后行單鏈構(gòu)象多性分 組整體水平的甲基化檢甲基 分析針對(duì)所有的CpG島設(shè)計(jì)探序列制作 ，甲基 Infinium探針設(shè)

原理（探針設(shè)計(jì)型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部為U型磁珠尾部為A，用來檢測(cè)未甲基化位點(diǎn)。G仍為G，與MMG變?yōu)镚，與U型磁珠配對(duì)，延伸后U型磁珠發(fā)光。Infinium針只使用一種磁珠，探針末端為C。配對(duì)后只摻入單個(gè)堿基（ddNTP-BioT，ddNTP-DNP）。根據(jù)熒光類型判斷摻入的堿基類型，第一部 組DNA的提完全可 條件成熟 2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在市售RNA酶后進(jìn)行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的是不僅沒有RNA，連DNA也被消化 第二部分亞硫酸氫鈉修 2：加5.5ul新鮮配制的3M342℃水浴4：10mM對(duì)苯二酚（氫醌）