第九章農(nóng)藥生物測定

第九章農(nóng)藥的生物測定

一、生物測定的基本原理和內(nèi)容

概念農(nóng)藥生物測定是指用活體生物對農(nóng)藥的毒效、毒性進(jìn)行的測定評價。是測定藥劑有無生物活性的基本方法。農(nóng)藥生物測定與室內(nèi)毒力測定一般沒有嚴(yán)格區(qū)別，多半是指在室內(nèi)進(jìn)行的測定。包括利用標(biāo)準(zhǔn)供試生物對農(nóng)藥有效成分含量的測定農(nóng)藥在室內(nèi)外對病蟲草藥的測定農(nóng)藥在動、植物體內(nèi)殘留量的測定對病蟲草抗藥性的測定。生物測定的基本原理利用生物體對農(nóng)藥的反應(yīng)性質(zhì)和程度來鑒別和測定農(nóng)藥的生物活性及其相關(guān)性，即對昆蟲、病原菌雜草及高等動物毒性、作用方式、作用程度，用以比較毒力或藥效。主要研究內(nèi)容主要研究內(nèi)容綜合其在農(nóng)藥研究和植物化學(xué)保護(hù)應(yīng)用中的作用，生物測定包括：室內(nèi)毒力測定、田間藥效試驗(yàn)和微量毒物的定量生物分析。A室內(nèi)毒力測定1、活性化合物的篩選（初篩/復(fù)篩），主要研究大量化合物的活性篩選。2、有害生物的抗性研究研究農(nóng)藥的作用機(jī)理及生理效應(yīng)，以及農(nóng)藥對植物的生理作用等。3、測定農(nóng)藥的有效含量及殘留量。4、研究農(nóng)藥理化性質(zhì)和劑型與毒效的關(guān)系。5、農(nóng)藥復(fù)配的共毒系數(shù)測定。B田間藥效試驗(yàn)田間藥效試驗(yàn)是在自然或一定的人為控制條件下進(jìn)行的生物測定，是一種綜合評價藥劑使用價值的試驗(yàn)方法。是一種新化合物能否成為農(nóng)藥的關(guān)鍵性階段。田間藥效試驗(yàn)可分為：小區(qū)試驗(yàn)大區(qū)試驗(yàn)大面積示范試驗(yàn)其中小區(qū)和大區(qū)藥效試驗(yàn)都是在有限的范圍和面積內(nèi)進(jìn)行的，有一定的局限性，通常還要進(jìn)行大面積示范試驗(yàn)以取得驗(yàn)證并迅速推廣。田間藥效試驗(yàn)包括以下內(nèi)容（1）農(nóng)藥品種比較試驗(yàn)（2）不同劑型比較試驗(yàn)（3）農(nóng)藥應(yīng)用技術(shù)試驗(yàn)（4）農(nóng)藥（劑型）的理化特征與藥效的關(guān)系（5）對寄主植物的藥害及對生物群落的影響，尤其是對害蟲天敵的影響試驗(yàn)。二、試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則和步驟

（一）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則1．相對控制環(huán)境條件（1）室內(nèi)生物測定多屬單因子試驗(yàn)。如：控制施藥劑量，靶標(biāo)生物的死亡率，控制試驗(yàn)的溫濕度條件等。（2）田間試驗(yàn)多因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對于大面積的試驗(yàn)區(qū)難以形成人工控制的條件，僅能對土肥、病蟲分布、長勢等進(jìn)行小區(qū)控制。加強(qiáng)田間管理，盡可能避免與試驗(yàn)無關(guān)因素的影響2．設(shè)立對照，消除試驗(yàn)中的偶然誤差在農(nóng)藥試驗(yàn)中通常所設(shè)的對照有：（1）空白對照（2）溶劑和乳化劑試驗(yàn)（3）標(biāo)準(zhǔn)藥劑試驗(yàn)3．各處理設(shè)立重復(fù)，減少誤差從生物統(tǒng)計(jì)的理論上講，重復(fù)次數(shù)越多，其平均值就越接近真實(shí)值，試驗(yàn)結(jié)果也越可靠，但工作量太大。通常在生物測定中，每處理設(shè)3～5個重復(fù)，每重復(fù)采樣數(shù)因測定對象而定：如某種殺蟲劑對小菜蛾的毒力測定，每處理可用30～50頭3齡幼蟲。4．統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用生物統(tǒng)計(jì)分析原理，總結(jié)歸納實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，化繁為簡，找出規(guī)律，科學(xué)地反映出農(nóng)藥與病蟲害間的內(nèi)在聯(lián)系，給出結(jié)果。主要用顯著性測定（方差分析，t值或F值測定）。（二）設(shè)計(jì)步驟1．選擇合適的試驗(yàn)對象2．確定藥劑的用量（濃度）及用法（點(diǎn)滴、浸漬、噴霧、藥膜等）3．確定試驗(yàn)結(jié)果的觀察方法，如LD50、ED50、LC50等指標(biāo)4．確定試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案5．試驗(yàn)的實(shí)施試驗(yàn)結(jié)果的生物統(tǒng)計(jì)分析第二節(jié)殺蟲劑室內(nèi)毒力測定殺蟲劑的室內(nèi)毒力測定是不斷地開發(fā)新的有效殺蟲劑，改善和提高現(xiàn)有殺蟲劑的使用效果，減少環(huán)境污染的必要手段。測定所得結(jié)果是安全、合理、經(jīng)濟(jì)、有效的使用殺蟲劑的依據(jù)；可有效監(jiān)測害蟲的抗性動態(tài)，有利于克服害蟲抗藥性以及保持自然環(huán)境的生態(tài)平衡。主要的研究內(nèi)容包括：（1）測定殺蟲劑對昆蟲的效力。（2）

篩選新農(nóng)藥及探索新化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與毒效關(guān)系的規(guī)律（即構(gòu)效關(guān)系的研究，較多地運(yùn)用于計(jì)算機(jī)輔助開發(fā)新農(nóng)藥的過程）。如溴氰菊酯有8種異構(gòu)體，但只有右旋順式體對昆蟲的毒效最高。六六六的8種異構(gòu)體中，也只有丙體666的毒效最高。（3）研究殺蟲劑的理化性狀與毒效的關(guān)系及鑒定加工劑型的質(zhì)量。（4）研究目標(biāo)昆蟲的生理狀態(tài)及外界條件與藥效的關(guān)系。（5）測定不同殺蟲劑混用的效力以及尋找增效劑等。一、標(biāo)準(zhǔn)試蟲的飼養(yǎng)殺蟲藥劑的室內(nèi)毒力測定，需要蟲態(tài)、齡期、營養(yǎng)及生活力狀況良好和發(fā)育一致的大量昆蟲作材料。而從田間采集的昆蟲生理生化狀態(tài)（蟲齡、抗性水平等）往往差異較大，測得的結(jié)果誤差很大，不符合試驗(yàn)要求。因此，必須在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大量飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化的試蟲。常用的室內(nèi)飼養(yǎng)的試驗(yàn)昆蟲種類很多，可根據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康模x擇不同的蟲種進(jìn)行飼養(yǎng)。昆蟲的室內(nèi)飼養(yǎng)的環(huán)境應(yīng)盡量滿足該試蟲的最適發(fā)育溫度、濕度、光照等條件。飼養(yǎng)的飼料可分為天然飼料和人工飼料。一般以人工飼養(yǎng)來代替天然飼料，以便長期長期穩(wěn)定的供給昆蟲飼養(yǎng)的需要。棉鈴蟲的飼養(yǎng)棉鈴蟲（HelicoverpaarmigeraH.）屬鱗翅目夜蛾科。食性雜，可長年飼養(yǎng)。但因幼蟲在三齡期以后有相互殘殺習(xí)性，須單頭飼養(yǎng)。連續(xù)大量飼養(yǎng)可采用人工飼養(yǎng)。（1）人工飼料配方A．含大豆粉和玉米粉的飼料（a）飼料組成熟大豆粉（g）20.0玉米粉（g）30.0

大麥粉（g）30.0抗壞血酸b）0

干酵母（g）8.0瓊脂（g）3.5

苯甲酸鈉（g）0.8棉油（ml）0.536％醋酸（ml）6.010％甲醛（ml）1.0

水（ml）200（b）配制方法大豆粉蒸熟。將甲醛、棉油和苯甲酸鈉放在占總水量10％的水中，再加入玉米粉等其他成分?jǐn)嚢?；加另?0％的熱水，以溶解瓊脂，冷至70℃時與上述組分混合攪拌；飼料均勻平鋪在瓷盤上，厚度0.5—1.0cm，冷卻后切成重5g左右小塊，分裝于養(yǎng)蟲管中備用。B．含棉葉粉的飼料（a）飼料組成干棉葉粉（g）7.0尼泊金（g）0.25熟豆粉（g）7.5瓊脂（g）1.5多維葡萄糖（g）1.9自來水（mL）600

抗壞血酸（g）1.9酵母片（粉）（g）4.5（b）配制方法將黃豆粉置高壓滅菌鍋內(nèi)，經(jīng)30分鐘滅菌（15磅壓力），取出涼干備用。把酵母片研成粉末，置紫外線燈下滅菌30分鐘。將瓊脂放入200ml水中加熱熔化，再加入400ml水、熟豆粉、多維葡萄糖、抗壞血酸、尼泊金、干制棉葉粉，充分拌勻后，分裝于指形管中，每管10g左右。（2）飼養(yǎng)方法將初孵幼蟲移入裝有人工飼料的指形管中，每管１頭，管口蓋上棉布，用橡皮筋扎好。幼蟲在內(nèi)取食，直至老熟，勿須再換飼料。幼蟲進(jìn)入預(yù)蛹期，即轉(zhuǎn)移到盛有無菌細(xì)土的養(yǎng)蟲缸內(nèi)，泥土必須保持濕潤，以利入土化蛹和蛹的存活。成蟲羽化后，雌雄配對，放入馬燈罩中，罩內(nèi)放一個內(nèi)有10％蜂蜜液的小瓶，瓶中插入一束上粗下細(xì)的脫脂棉條，以便蛾子從棉條上吸取蜜液。馬燈罩下鋪上紗布，并用橡皮筋扎好。蛾子在罩內(nèi)交尾產(chǎn)卵，每日將產(chǎn)于紗布上的卵連同紗布取下，并換新紗布和蜜液。有卵紗布放入養(yǎng)蟲缸中的飼料上，缸口糊白紙，以防幼蟲外逃。或用黑布將缸口封住，布上壓玻璃板，缸下部對著光源，孵化的幼蟲可很快到飼料上取食。（3）飼養(yǎng)條件養(yǎng)蟲室溫度保持26～28℃，相對濕度60％～70％，10小時/天光照。幼蟲歷期22天左右。二、供試?yán)ハx的準(zhǔn)備為了使毒力測定的結(jié)果可靠穩(wěn)定，除了嚴(yán)格控制每次試驗(yàn)過程中的條件外，殺蟲劑毒力測定要求所用試蟲群體質(zhì)量的均勻一致，除飼養(yǎng)的試蟲外，從野外采集的田間試蟲，應(yīng)進(jìn)行分離和嚴(yán)格挑選，如蟲期、齡期、性別等，使之達(dá)到群體質(zhì)量均勻，盡可能地減少試驗(yàn)誤差，保證獲得滿意的結(jié)果。移蟲前應(yīng)該凈手及消毒，避免藥劑或有害病菌污染蟲體；操作時要細(xì)心，不要碰傷蟲體。1移取試蟲的方法毒力測定時，首先應(yīng)將試蟲從飼養(yǎng)缸（籠）中快速移出，且不能損傷蟲體。根據(jù)毒力測定所用的昆蟲種類、個體大小、生活習(xí)性和特點(diǎn)不同，以及移取的工具和方法的差異可分為機(jī)械法，化學(xué)法和趨光法。1.1機(jī)械法對于菜青蟲、斜紋夜娥等活動能力不大或有假死性的試蟲，可采用最簡單的取蟲工具，如鑷子來移取。而一些體型小、體軟或易碰傷的試蟲，如蚜蟲、紅蜘蛛、小菜蛾等，可用毛筆移取。一些活動能力不大、微小或易受機(jī)械傷害的目標(biāo)昆蟲（如雜擬谷盜、米象、蚜蟲和蟲卵等）。此類試蟲用上述方法移取困難，費(fèi)時或易造成傷害，可用真空或喉管空氣注射吸蟲法移取，既方便又快速。1.2麻醉法移取飛翔或活動能力強(qiáng)的試蟲時，常采用麻醉法處理，以達(dá)到試蟲混勻移取的要求。但是麻醉處理對昆蟲的生理狀態(tài)有一定影響，因而要注意麻醉時間，以免對試蟲造成傷害。1.2.1二氧化碳法用CO2或CO2與空氣（3：1）混合氣體麻醉法，可用于大多數(shù)試蟲。可在一個密閉容器里放入試蟲，然后通入二氧化碳即可進(jìn)行麻醉。1.2.2揮發(fā)蒸氣法在密閉廣口玻璃容器（如干燥器）中，放入三氯甲烷與酒精（1：1）、三氯甲烷與乙醚（1：1）、乙醚與酒精（1：1）或乙醚等藥品，進(jìn)行麻醉。麻醉時間隨各種試蟲群體對麻醉劑的敏感性和所要求的麻醉程度不同而定，如家蠅的麻醉時間一般在4min以內(nèi)。1.2.3乙醚低溫麻醉法用試管扣試蟲，再用棉花蘸少許乙醚并把乙醚擠干后，封住管口，然后把麻醉的試蟲倒放在墊有冰塊的器皿上，以保持蟲體在冷凍狀態(tài)，便于操作處理。此法具有麻醉時間短、見效快和無死亡等優(yōu)點(diǎn)，此法使用于家蠅等飛翔能力強(qiáng)的試蟲。1.2.4冷凍法適用于蜚螃、家蠅等試蟲。一般分兩步進(jìn)行，先將試蟲置于5℃條件下冷凍10min，然后移至0℃條件下冷凍2－3min取出。這樣冷凍的效果較好，對試蟲的生活力無不良影響。該法所需時間較長、需要冷凍設(shè)備；在室溫20℃以上時，經(jīng)低溫麻醉的試蟲，恢復(fù)較快，不便對試蟲進(jìn)行分離操作。此外，冷凍處理時間過長，對試蟲的生理狀態(tài)和抗藥力均有一定程度的影響，在使用時要注意掌握時間。1.3趨光法用強(qiáng)光照射時，家蠅、果蠅等試蟲會向光源群集，利用昆蟲的這種趨光性來移取試蟲。如家蠅成蟲，家蠅從飼養(yǎng)籠中向著陽光或燈光飛到移取籠中。該法移取的試蟲均勻性較差，先移出的試蟲多為生活力較強(qiáng)的個體，且易造成蟲體損傷或飛逃。三、殺蟲劑毒力的表示方法毒力即是農(nóng)藥的毒性程度。常用的殺蟲劑毒力表示方式：致死中量(MedianLethalDose)，即殺死供試?yán)ハx群體半數(shù)個體所需要的劑量，常以LD50表示；致死中濃度(MedianLathalConcentration)，即殺死供試?yán)ハx群體一半個體所需要的藥劑濃度，以LC50表示；致死中時(MedianLethalTime)或擊倒中時(MedianKnockdownTime),即殺死或擊倒供試?yán)ハx群體一半個體所需的時間，單位示分鐘，記做LT50或KT50。同時，在不同藥劑間毒力比較時，還常常使用LD95或LC95來描述殺蟲劑毒力,即殺死昆蟲群體95％的個體所需的藥劑劑量或濃度。四、殺蟲劑毒力測定的常見方法

殺蟲劑對不同種類的害蟲毒力程度各異，且致毒的方式也不一樣，毒力測定的方法也很多，根據(jù)殺蟲劑的作用方式可分為四種：胃毒作用、觸殺作用、內(nèi)吸作用和熏蒸作用的毒力測定。1．胃毒作用(stomachaction)的毒力測定利用害蟲的貪食性，使殺蟲劑隨食物一起被目標(biāo)昆蟲吞食進(jìn)入消化道而發(fā)揮毒殺作用。常用的有葉片夾毒法、液滴飼喂法和口腔注射法三種（1）

葉片夾毒法（sandwichmethod）此法適用于植食性、取食量大的咀嚼式口器的昆蟲，如鱗翅目幼蟲、蝗蟲、玉米螟等?；具^程是用兩張葉片，中間均勻地涂上一定量的藥劑飼喂目標(biāo)昆蟲，然后由被吞服的葉片面積推算出吞服的藥量。此法最大的優(yōu)點(diǎn)是可以減少目標(biāo)昆蟲與藥劑的接觸，避免發(fā)生觸殺作用，操作方便，結(jié)果比較精確，仍然是目前較理想的胃毒劑毒力測定方法。但是準(zhǔn)備夾毒葉片、計(jì)算吞服面積等需大量的人力物力，每次處理的樣品不能太多。a.夾毒葉片的準(zhǔn)備將采回的植物葉片用水洗凈，待表面水分揮發(fā)后，用打孔器制成2cm直徑的圓葉片，其中一片的一面定量涂（噴）上藥劑，另一片則涂上淀粉糊（或面粉糊），小心地將兩片葉片對合制成夾毒葉片。將夾毒葉片按不同劑量飼喂已知體重的目標(biāo)昆蟲。葉片被食后，將剩余葉片移置于有方格紙的玻片上，在放大鏡下計(jì)算所吞食葉的面積。b.飼喂方法為保證試蟲有較大的取食量，在飼喂前應(yīng)饑餓5~8小時。將試蟲逐一稱重編號，單獨(dú)飼喂，取食一段時間后取出葉片，根據(jù)取食面積計(jì)算取食量。（取食時間一般為10分~2小時）單位體重目標(biāo)昆蟲吞食藥量可按下式計(jì)算：c．結(jié)果記錄昆蟲取食后放入干凈的容器中，放入新鮮的葉片，在24~72小時后檢查死亡率d．計(jì)算致死中量

（2）

液滴飼喂法（feedingofmeasureddrops）不宜用夾毒葉片法測定殺蟲劑對舐吸式口器昆蟲的毒力，如家蠅、果蠅、蜜蜂等昆蟲喜食糖液，可將一定的殺蟲劑加入到糖液中，用微量注射器形成一定大小的液滴（0.001~0.01ml），直接喂試蟲；或?qū)⑿纬傻囊旱畏旁诓Ａ?，讓家蠅等目?biāo)昆蟲自行舐食，試蟲在舐食前后都稱重，以確定其取食量。目標(biāo)昆蟲經(jīng)藥劑處理后，移入清潔干燥的器皿中，置于27℃的條件下定期觀察反應(yīng)情況，計(jì)算死亡率，求出致死中量（方法同前）。（3）

口腔注射法適用于個體較大的咀嚼式口器的昆蟲，但該法從口腔注入藥液時易刺破口腔內(nèi)軟組織，技術(shù)難以掌握，故目前很少使用。2．觸殺作用（contactaction）的毒力測定通過昆蟲體壁進(jìn)入蟲體而致死的殺蟲劑稱為觸殺劑。在測定藥劑的觸殺毒力時，應(yīng)盡量避免藥劑從口器或氣孔進(jìn)入蟲體。常用的有直接和間接兩種方法：2.1直接滴加2.1.1點(diǎn)滴法（Topicalapplication）點(diǎn)滴法是將一定濃度的藥液點(diǎn)滴于蟲體上的某一部位，如幼蟲的前胸背片上，溶劑迅速揮發(fā)，藥劑在體壁形成藥膜而侵入體內(nèi)。此法是殺蟲劑觸殺毒力測定中使用最普遍的方法。除了螨類及小型昆蟲外，可應(yīng)用于大多數(shù)目標(biāo)昆蟲的觸殺毒力測定，如二化螟、玉米螟、菜青蟲、黏蟲等。但是點(diǎn)滴法不能處理大批量的目標(biāo)昆蟲，測定結(jié)果準(zhǔn)確性在很大程度上取決于試蟲本身的生理狀態(tài)。因此，試驗(yàn)時須選用生理狀態(tài)一致的目標(biāo)昆蟲，否則會大大影響其準(zhǔn)確性。其次是點(diǎn)滴部位、滴點(diǎn)大小以及目標(biāo)昆蟲處理前的麻醉方式等都有影響，操作技術(shù)難掌握。且需專門的點(diǎn)滴設(shè)備，如千分尺微品點(diǎn)滴器、電動（不動）微量點(diǎn)滴器、手動微量點(diǎn)滴器、毛細(xì)管微量點(diǎn)滴器(圖)和微量進(jìn)樣器等。所以，點(diǎn)滴法測殺蟲劑毒力時應(yīng)注意選擇適宜的溶劑配制藥液，應(yīng)蟲而異確定點(diǎn)滴的藥量及部位，控制環(huán)境條件及時飼喂，適時檢查結(jié)果。在正式試驗(yàn)前，可設(shè)計(jì)一個預(yù)備試驗(yàn)，明確需設(shè)藥劑的最佳濃度梯度，使每一個處理的試蟲死亡率在10—90％之間，這需用大量試蟲。而該濃度范圍并非先知，因此在正式測定前必須進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)，一般可將待出藥劑設(shè)三個濃度，其梯度間差可適當(dāng)加大，如按10、100及1000ppm配制藥液，每一濃度處理試蟲10—20頭，不設(shè)重復(fù)，其他條件同正式測定。根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)中藥劑濃度與死亡率的相關(guān)現(xiàn)象再正式設(shè)計(jì)試驗(yàn)。測定實(shí)例點(diǎn)滴法測定毒死蜱對小菜蛾的毒力測定①試蟲準(zhǔn)備：用毛筆仔細(xì)地將3齡期小菜蛾幼蟲從甘藍(lán)葉上挑下，置于一片事先準(zhǔn)備好的園葉片上（直徑5cm）。②配制藥劑：用丙酮將毒死蜱原藥（新安化工，含量97.5％）稀釋成2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625微克/微升等5種濃度，每濃度取3毫升裝在小瓶中。③點(diǎn)滴對照組小菜蛾：用手動微量點(diǎn)滴器（上海昆蟲研究所制）0.1微升，將針頭對準(zhǔn)小菜蛾背部，輕輕轉(zhuǎn)動手柄，丙酮即在幼蟲上展布。注意針頭不能壓在幼蟲身上，否則極易傷害蟲體。④從低濃度開始點(diǎn)滴毒死蜱丙酮溶液。每點(diǎn)滴完一個濃度，用下一個濃度的藥液洗點(diǎn)滴器數(shù)次，再開始點(diǎn)滴。⑤處理完24小時后檢查死亡率。用毛筆輕觸幼蟲，無假死現(xiàn)象，或蟲體翻轉(zhuǎn)視作死亡。2.1.2噴霧（噴粉）法噴霧（噴粉）是使殺蟲劑直接附著于昆蟲體表，通過表皮侵入昆蟲體內(nèi)致毒。為了試蟲個體間所接受的藥量一直，除了試蟲本身的因素外，還跟所采用的噴霧裝置有關(guān)，目前有很多相關(guān)的設(shè)備被使用。如Potter噴霧器，適合于鱗翅目幼蟲、飛翔昆蟲蠅等的毒力測定；E.J.Gerberg設(shè)計(jì)的氣霧風(fēng)道則尤其適用于蚊子、家蠅、蜚蠊等衛(wèi)生害蟲的毒力測定。其優(yōu)點(diǎn)在于簡單易行，實(shí)驗(yàn)操作較接近于田間的實(shí)際情況，是目前最為常用的觸殺性殺蟲劑毒力測定的方法。噴霧（噴粉）法的基本操作于點(diǎn)滴法相似。2.2藥膜法（間接法）藥膜法的基本原理是將一定量的殺蟲藥劑施于物體表面，形成一個均勻的藥膜，然后放人一定數(shù)量的供試目標(biāo)昆蟲，讓其爬行接觸一定時間后，再移至正常的環(huán)境條件下，于規(guī)定時間內(nèi)觀察試蟲的中毒死亡反應(yīng)，計(jì)算擊倒率或死亡率。藥膜法的優(yōu)點(diǎn)是比較接近實(shí)際防治情況，方法簡單，操作方便，應(yīng)用范圍廣，幾乎一切爬行的昆蟲都適用，而且結(jié)果比較準(zhǔn)確，是目前常用的一種方法。但藥膜法有一定的局限性，當(dāng)昆蟲的足部表皮是殺蟲藥劑穿透的主要部位時，采用藥膜法測得的毒效就偏高，如家蠅用藥膜法測得的毒效高干點(diǎn)滴法。對于某些目標(biāo)昆蟲，足部表皮不是殺蟲劑穿透的主要部位或不能穿透的，采用此法測得的結(jié)果就偏低。其次是昆蟲的活動、習(xí)性對試驗(yàn)結(jié)果的影響較大，藥膜法測得的結(jié)果不能用準(zhǔn)確的劑量表示，即不能表示單位昆蟲體重接受的藥量，只能用單位面積的藥量來表示，而單位面積的藥量并不等于藥劑進(jìn)人蟲體的劑量，相對較難定量。2.2.1濾紙藥膜法液體藥劑采用此法較好。方法是將直徑為9cm的濾紙懸空平放，用移液管吸取0.8ml的丙酮藥液．從濾紙邊緣逐漸向內(nèi)滴加，使丙酮藥液均勻分布在濾紙上。也可用噴霧法向?yàn)V紙噴霧。用2張經(jīng)過藥劑同樣處理過的濾紙，放人培養(yǎng)皿底和皿蓋各1張，使藥膜相對。（圖8）最好在培養(yǎng)皿內(nèi)側(cè)壁涂上拒避劑，避免昆蟲進(jìn)人無藥的側(cè)避。隨即放入目標(biāo)昆蟲，任其爬行接觸一定時間（30～60min）后，再將目標(biāo)昆蟲移出放入干凈的器皿內(nèi)，置于正常環(huán)境條件下，定時觀察試蟲的擊倒率。2.2.2容器藥膜法采用干燥的三角瓶或其他容器，放人一定量的丙酮藥液（0.3～0.5ml），然后均勻地轉(zhuǎn)動容器，使藥液在容器中形成一層藥膜，待藥液干燥后（或丙酮揮發(fā)后），放人定量的目標(biāo)昆蟲，任其爬行接觸一定時間（40～60min）后，再將試蟲移至正常環(huán)境條件下，在規(guī)定時間內(nèi)觀察試蟲擊倒中毒反應(yīng)。2.2.3蠟紙粉膜法將蠟紙裁成一定面積的紙片，把藥粉撒在蠟紙的正面中央，兩手執(zhí)紙邊使藥粉在中間來回移動數(shù)次，均勻地分布在一定范圍內(nèi)，倒去多余的藥，再輕輕彈動背面1～2次，即成蠟紙粉膜，然后稱重，計(jì)算單位面積藥量。放人一定數(shù)量的目標(biāo)昆蟲于粉膜上，用直徑為9.0cm的培養(yǎng)皿蓋扣在藥膜上，待試蟲爬行接觸一定時間后，取出移至正常環(huán)境中，定時觀察試蟲擊倒中毒反應(yīng)。殺菌劑的生物測定方法根據(jù)殺菌劑生物測定方法的基本原理，可將其歸納為三大基本類型：離體法活體法組織篩選法1離體法離體法是利用藥劑和病原菌直接接觸，以測定藥劑殺菌作用的方法。此測定體系不包括寄主植物。常見的離體測定方法有：孢子萌發(fā)法、生長速率法、瓊脂擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法、對持培養(yǎng)法、菌絲干重法、定氮法等。離體法具有操作簡單，條件比較容易控制，試驗(yàn)材料易于獲得，測定所需的時間周期短等優(yōu)點(diǎn)。在一定程度上反應(yīng)了藥劑的生物活性，但此法最大的缺點(diǎn)是可能使一些具有防病作用的化合物漏篩。例如，以抑制孢子萌發(fā)作為指標(biāo)的殺菌劑生物活性測定，會使許多現(xiàn)代的殺菌劑被判斷為沒有活性，因?yàn)檫@些藥劑對孢子萌發(fā)沒有抑制作用。如三環(huán)唑，離體測定時對菌體沒有活性，但是可能會抑制真菌侵入寄主所需的黑色素等物質(zhì)的合成。另外，還有一些是調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)植物抗病性的藥劑，如果只用離體法測定它們的活性，這些藥劑就有可能被漏篩。2活體法人們已逐漸認(rèn)識到離體實(shí)驗(yàn)方法存在很多不足之處。于是采用“活體優(yōu)先”的原則來進(jìn)行生物測定。實(shí)際上，幾乎所有的農(nóng)用殺菌劑，都是在病原菌與寄主共存的情況下發(fā)揮藥效。不言而喻，在以實(shí)驗(yàn)為目的進(jìn)行試驗(yàn)時，最好是在病原菌與寄主共存的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時人們對生物測定進(jìn)行了大量的研究，孢子、菌絲的獲得和培養(yǎng)，接種方法，施藥方法，病害分級標(biāo)準(zhǔn)等方面技術(shù)的進(jìn)一步成熟，為活體生物測定創(chuàng)造了條件，促進(jìn)了活體生物測定技術(shù)的發(fā)展。活體法測定是在殺菌劑、病原物和寄主共存的條件下進(jìn)行的，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與田間效果具有很高的相關(guān)性，對生產(chǎn)實(shí)際有較大的參考價值。常用的方法有：種子殺菌劑藥效測定、幼苗接種實(shí)驗(yàn)方法、葉片接種實(shí)驗(yàn)方法，果實(shí)防腐劑生物測定、定殖法等。現(xiàn)在研究開發(fā)農(nóng)藥，平均10萬個化合物中才能篩選出1個有前途的化合物。如果將大量的化合物完全采用活體法進(jìn)行篩選，事實(shí)上很難實(shí)現(xiàn)，因?yàn)榛铙w測定需要的寄主多，占用空間大，測定周期長，實(shí)驗(yàn)條件難以控制，這樣將會耗費(fèi)更多的人力、物力和財(cái)力，當(dāng)然更談不上效率。為此，人們將實(shí)驗(yàn)方法簡化，建立了“組織篩選法”。3組織篩選法組織篩選法是利用植物部分組織、器官或替代物作為實(shí)驗(yàn)材料評價化合物殺菌活性的方法，是一種介于活體和離體的方法。由于它既具有離體的快速、簡便和微量等優(yōu)點(diǎn)，又具有與活體植株效果相關(guān)性高的特點(diǎn)。因此，近年來備受重視，以植物葉片、根、莖等組織為實(shí)驗(yàn)材料，適于多種病害殺菌劑的生物測定。目前比較成熟的組織篩選法有：適用于水稻紋枯病、蔬菜菌核病的“蠶豆葉片法”適用于稻瘟病的“葉鞘內(nèi)側(cè)接種法”適用于玉米彎孢霉葉斑病的“玉米葉段法”用來觀察藥劑對真菌各生長階段作用的“洋蔥鱗片法”針對黃瓜灰霉病新藥劑篩選的“子葉篩選法”適用于霜霉病的“葉片漂浮法”適用于稻白葉枯病的“噴菌法”針對細(xì)菌性白菜軟腐病的“蘿卜塊根法”適用于柑橘樹脂病的“離體葉片法”適用于抗病毒劑篩選的“局部病斑法”及“葉片漂浮法”不管是離體法、活體法還是組織篩選法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，要針對病菌的侵染特點(diǎn)加以選擇，必要時還要結(jié)合使用，綜合各種方法的優(yōu)勢。如日本三共農(nóng)藥研究所在采用活體法篩選出有效的化合物后，往往又采用離體的方法來尋找毒力更強(qiáng)的化合物，這是一種活體－離體－活體的篩選模式。實(shí)驗(yàn)殺菌劑的生物測定--生長速率法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握殺菌劑的生物測定方法之一--生長速率法二、實(shí)驗(yàn)原理生長速率法是殺菌劑毒力測定的常規(guī)方法之一，適用于不長孢子而菌絲生長較快的真菌，是通過菌落生長的速度快慢來衡量藥劑的毒力大小生長速率法又叫含毒介質(zhì)法，它是將供試藥劑與培養(yǎng)基混合，以培養(yǎng)基上菌落的生長速度來衡量化合物的毒力大小。一般多用于那些不產(chǎn)孢子或孢子量少而菌絲較密的真菌菌落生長速率的表示方法菌落達(dá)到一個給定的大小所需要的時間（天或小時）在單位時間內(nèi)菌落直徑的大小生長速率法常用的菌種棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporium）蘋果腐爛病菌（Valsamali）小麥紋枯病菌（Rhzoctoniasolani

）葡萄白腐病菌（Coniothyriumdiplodiella）小麥全蝕病菌（Gaeumannomycesgraminis）辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsici）三、試劑和儀器設(shè)備高壓滅菌鍋、超凈工作臺、酒精燈、接種針、紗布、吸管、消毒培養(yǎng)皿、打孔器、無菌小燒杯PDA培養(yǎng)基病原菌（蘋果腐爛病菌）供試殺菌劑(多菌靈)四、實(shí)驗(yàn)步驟將培養(yǎng)基加熱溶化，冷卻至45-50℃，加入供試藥液制成含藥液的培養(yǎng)基，并分別倒入培養(yǎng)皿中冷卻以無菌操作手續(xù)，用打孔器打取圓形菌塊后用接種針挑至培養(yǎng)皿中央，然后將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱（27℃）中培養(yǎng)即可于處理后不同時間觀察測定菌絲的生長情況五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及其處理純生長量=菌落平均直徑-菌餅直徑抑菌率（%）=[(對照菌落純生長量-處理菌落純生長量/對照純生長量]×100%藥劑濃度（mg/L）濃度對數(shù)菌落直徑（mm）抑制（%）機(jī)率值ⅠⅡⅢⅣ平均50%多菌靈對蘋果腐爛病菌的抑制作用(生長速率法)六、問題討論根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較各種供試藥劑之間對病原菌菌絲生長的抑制作用除草劑生物測定方法除草劑的生物測定廣義的包括了實(shí)驗(yàn)室、溫室和大田三個試驗(yàn)層次,而狹義的僅主要指前兩者,后者則為田間藥效評價。除草劑生物測定應(yīng)用的范圍(1)除草活性的確定。新合成的化學(xué)除草劑要判定其是否對雜草有活性,就必須采用生物測定的方法。(2)殺草譜的確定。新的除草劑對哪些種類的雜草有明顯的作用,必須通過生物測定來確定。(3)最佳用藥濃度和用藥時期的確定。除草劑對特定雜草的生長抑制是在適當(dāng)?shù)膭┝肯潞吞囟ǖ纳L時期,如果用藥量和用藥時期不當(dāng),就起不到預(yù)期的效果,還會造成經(jīng)濟(jì)損失。因此對特定的雜草,最佳的用藥濃度和時期非常重要。(4)對作物安全性的研究。包括兩方面含義,一是對當(dāng)茬作物的安全性,也就是除草劑的選擇性。二是對后茬作物的安全性,即是否存在殘留藥害。

(5)除草劑復(fù)配后聯(lián)合效果的判別。除草劑復(fù)配后聯(lián)合作用效果的判別一般采用生物測定的方法。(6)環(huán)境條件對除草劑活性的影響。這些環(huán)境條件包括溫度、光照、土壤濕度等。(7)除草劑在水體、土壤中的殘留活性和在土壤中的淋溶性。

(8)抗藥性和耐藥性雜草的鑒定。除以上提到的應(yīng)用范圍外,只要和除草劑活性相關(guān)的研究都可以采用生物測定的方法。供試的生物除草劑生物測定的供試生物以植物為主,也可以是其他生物。植物中根據(jù)測定目的不同可以選擇作物和雜草。具體選用哪種植物,應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)需要來確定。如測定除草劑對特定作物和雜草的生物活性,即以這些植物為材料。如果需要測定土壤或水體中除草劑的殘留活性,則需要進(jìn)行敏感植物的篩選,經(jīng)過預(yù)備實(shí)驗(yàn)后才能確定選用哪種植物。供試植物的選擇應(yīng)遵循如下原則(1)供試植物的來源充分(2)供試植物個體一致(3)在一定的劑量范圍內(nèi),供試植物對除草劑的反應(yīng)隨著劑量的增加而有規(guī)律的提高(4)在環(huán)境條件相同或相似的條件下,這種成比例的傷害關(guān)系是可以重現(xiàn)的。生物測定的材料與相應(yīng)程序常規(guī)生物測定一般是利用生物活體作靶標(biāo),通過觀察除草劑對靶標(biāo)生物的生長發(fā)育、形態(tài)特征、生理生化等方面的反應(yīng)來判斷除草劑的生物活性。除草劑的作用方式很多,如抑制光合作用、呼吸作用、細(xì)胞分裂,干擾蛋白質(zhì)、脂類、葉綠素等的生物合成以及生長的激素控制等,因此在進(jìn)行除草劑生物測定時,應(yīng)根據(jù)除草劑的不同作用方式選擇不同的靶標(biāo)生物和相應(yīng)的測定方法。測定方法整株水平測定組織或器官水平測定細(xì)胞或細(xì)胞器水平測定酶水平測定整株水平測定一般是在溫室用盆缽、培養(yǎng)皿或小杯如玻璃杯或一次性塑料杯培養(yǎng)供試的指示植物,根據(jù)不同要求用供試除草劑處理,待藥害癥狀明顯后進(jìn)行觀察評價。評價的指標(biāo)包括出苗率、株高、地上部重量和地下部重量等,還可對植物受害癥狀進(jìn)行分級,再計(jì)算綜合藥害指數(shù)。植株個體大的供試材料用大盆缽培養(yǎng),采用測定株高或重量的方法以及分級方法進(jìn)行評價都可以取得好的結(jié)果。組織或器官水平測定小杯法可以采用惰性材料沙子、蛭石或玻璃珠,也可以是土壤。測定的指標(biāo)可以是主根長或地上部鮮重或株高,具體采用哪種指標(biāo)應(yīng)根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)分析后選擇穩(wěn)定性和相關(guān)性較好,以及容易測定的指標(biāo)。應(yīng)用較多的是主根長生測法。例如利用玉米或油菜主根長法測定磺酰脲類除草劑的殘留活性。在利用種子作為生測材料時,供試的種子一定要有較高的發(fā)芽率和發(fā)芽勢,否則會影響測定結(jié)果,造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。細(xì)胞或細(xì)胞器水平測定一般是針對特定作用機(jī)制的除草劑,常用的細(xì)胞器有葉綠體和線粒體。根據(jù)葉綠體和線粒體中一些特定的生理生化反應(yīng)測定生理指標(biāo)。在離體線粒體條件下,用瓦氏呼吸裝置測定氧的吸收和磷氧比,從而確定呼吸作用抑制劑活性。酶水平測定因?yàn)椴莞熟⒆饔糜诜枷阕灏被岷铣蛇^程中的一種重要酶—EPSP合成酶,導(dǎo)致莽草酸積累,因此測定植物體內(nèi)莽草酸的累積量可以得知草甘膦活性的大小?；酋ｋ孱惓輨┮种埔阴Ｈ樗岷铣擅富钚?因此可以用乙酰乳酸合成酶活性的變化測定植物對磺酰脲類除草劑的敏感程度。農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)是在田間進(jìn)行的農(nóng)藥對有害生物施藥效果的試驗(yàn)，這是確定新的農(nóng)藥品種能否在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用很重要的方法。田間藥效試驗(yàn)可分為小區(qū)、大區(qū)與大面積示范等幾種。這是在自然條件下研究比較幾種不同的農(nóng)藥，采用幾種不同的即時條件和要求，從中鑒定出最有效、最有經(jīng)濟(jì)效果的農(nóng)藥品種，同時確定其大田使用范圍、防治對象、最低有效使用劑量、濃度及其他技術(shù)條件等。一般農(nóng)藥經(jīng)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明有效，需先進(jìn)行小區(qū)試驗(yàn)，獲得較好試驗(yàn)結(jié)果的項(xiàng)目，再進(jìn)行大區(qū)試驗(yàn)。在正式推廣之前，常常還要進(jìn)行大面積示范，以便取得廣泛經(jīng)驗(yàn)。進(jìn)行農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)之前，必須制定試驗(yàn)計(jì)劃和方案，明確試驗(yàn)的目的、要求、方法以及各項(xiàng)技術(shù)措施的規(guī)格要求，以便試驗(yàn)的各項(xiàng)工作按計(jì)劃進(jìn)行，也便于在進(jìn)行過程中檢查執(zhí)行情況，保證試驗(yàn)任務(wù)的完成。田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)的主要目的是減少試驗(yàn)誤差，提高試驗(yàn)的精確度，使試驗(yàn)人員能從試驗(yàn)結(jié)果中獲得無偏差的處理平均值及試驗(yàn)誤差的估計(jì)值，從而能進(jìn)行正確而有效的比較。在藥效試驗(yàn)中要減少試驗(yàn)誤差，就必須對試驗(yàn)誤差來源，通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)加以克服。在試驗(yàn)過程中如何減少試驗(yàn)誤差應(yīng)注意以下幾個方面：

1.試驗(yàn)地的選擇

選擇有代表性的試驗(yàn)地是使土壤差異減少至最少限度的一個重要措施，對提高試驗(yàn)準(zhǔn)確度有很大作用。選擇試驗(yàn)地要考慮到：a、試驗(yàn)地的地勢應(yīng)平坦，肥力水平均勻一致。b、試驗(yàn)地的作物生長整齊、樹勢一致，而且防治對象常年發(fā)生較重且為害程度比較均勻，且每小區(qū)的害蟲蟲口密度和病害的發(fā)病情況大致相同。特別是殺菌劑試驗(yàn)，要選擇高度感染供試對象病害的品種進(jìn)行試驗(yàn)。c、試驗(yàn)地的田間管理水平相對一致，并符合當(dāng)?shù)氐膶?shí)際情況。d、試驗(yàn)地應(yīng)選擇離房屋、道路、水塘稍遠(yuǎn)的開闊農(nóng)田，以保證人、畜安全和免受外來因素的偶然影響。e、試驗(yàn)地周圍最好種植相同的作物，以免試驗(yàn)地孤立而易遭受其它因素為害。2.試驗(yàn)藥劑處理供試農(nóng)藥和對照農(nóng)藥的劑型和含量要合乎規(guī)格，無變質(zhì)、失效現(xiàn)象，并有詳細(xì)的標(biāo)簽和說明書，標(biāo)明生產(chǎn)廠家、出廠日期等。評價一種農(nóng)藥產(chǎn)品不同劑量的藥效試驗(yàn)，至少要有供試產(chǎn)品的3個濃度梯度、1個常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥的常用濃度和1個空白對照等5個處理。如供試的農(nóng)藥產(chǎn)品是混配制劑，而且各個單劑已登記過，除設(shè)混劑本身3個濃度梯度和1個空白對照外，還應(yīng)設(shè)混劑中各個單劑的常規(guī)處理濃度，共6個處理。3.設(shè)置重復(fù)次數(shù)

試驗(yàn)設(shè)置重復(fù)次數(shù)越多，試驗(yàn)誤差越少。但在實(shí)際應(yīng)用中，并不是重復(fù)次數(shù)越多就越好。因?yàn)槎嘤谝欢ǖ闹貜?fù)次數(shù)，誤差的減少很慢，而人力、物力的花費(fèi)也大大增加，是不值得的。重復(fù)次數(shù)的多少，一般應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)所要求的精確度、試驗(yàn)地土壤差異的大小、供試作物的數(shù)量、試驗(yàn)地面積、小區(qū)的大小等具體決定。對試驗(yàn)精確度要求高、試驗(yàn)地土壤差異大、小區(qū)面積小的試驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)可多些，否則可少些。通常情況下，要求把試驗(yàn)誤差的自由度控制在10以上，即（處理數(shù)-1）*（重復(fù)數(shù)-1）>10。一般每個處理的重復(fù)次數(shù)以3-5次為宜。大區(qū)試驗(yàn)和大面積示范可不設(shè)重復(fù)。4.采用隨機(jī)區(qū)組排列

為使各種偶然因素作用于每小區(qū)機(jī)會均等，那么在每重復(fù)內(nèi)設(shè)置的各種處理只有用“隨機(jī)排列”才能符合這種要求，反映實(shí)際誤差。例如某種藥劑藥效好壞究竟是由于其所在小區(qū)病、蟲密度不均勻，還是藥劑本身的原因，就不容易判別了。為了解決這一問題，可將試驗(yàn)地按重復(fù)次數(shù)劃分為數(shù)量相同的區(qū)組（即重復(fù)），再將每一區(qū)組按處理數(shù)目劃分小區(qū)（包含藥劑處理和對照區(qū)），然后將每種藥劑在區(qū)組中隨機(jī)排列，即每種藥劑在區(qū)組中僅出現(xiàn)一次。用隨機(jī)區(qū)組和重復(fù)組合，試驗(yàn)就能提供無偏的試驗(yàn)誤差估計(jì)值。5.小區(qū)面積與形狀

小區(qū)面積的大小和形狀對于減少土壤差異的影響和提高試驗(yàn)的精確度是相當(dāng)重要的。小區(qū)面積的大小，應(yīng)根據(jù)土壤條件、作物種類、病蟲草害的生物學(xué)特性和試驗(yàn)?zāi)康亩?。一般要求：a、差異較大的田塊，小區(qū)面積宜大一些。b、凡植株高大、株行距較大的作物，單位面積上株數(shù)較少的作物，種植密度小的作物小區(qū)面積可大些，反之可小些。c、活動性強(qiáng)的害蟲，小區(qū)面積宜大些；活動性較差的如蚜蟲等，小區(qū)面積可小些。d、測產(chǎn)的試驗(yàn)，小區(qū)面積宜大些，否則可小些。e、田間藥效試驗(yàn)的小區(qū)面積一般為15-50m2，果樹每小區(qū)不少于3株。產(chǎn)量試驗(yàn)至少為25m2。小區(qū)的形狀一般以長方形尤其是狹長形為好，采用狹長小區(qū)能較全面地包括不同肥力的土壤，相應(yīng)減少小區(qū)間的土壤差異，提高精確度，其試