食品理化檢驗(yàn) 霉菌毒素檢驗(yàn)

霉菌毒素的檢驗(yàn)掌握：黃曲霉毒素的理化性質(zhì)和薄層色譜法測(cè)定黃曲霉毒素B1的原理和方法微柱篩選法測(cè)定AFTB1的原理及方法赭曲霉毒素的理化性質(zhì)和薄層色譜法測(cè)定的原理及方法熟悉：展青霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、玉米赤霉烯酮的測(cè)定方法了解：霉菌毒素的命名、分類、危害和污染來(lái)源概述黃曲霉毒素的檢驗(yàn)赭zhě曲霉毒素

展青霉素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇

T-2毒素玉米赤霉烯酮的測(cè)定方法目錄霉菌及霉菌毒素霉菌：是絲狀真菌的俗稱，意即"發(fā)霉的真菌"，它們往往能形成分枝繁茂的菌絲體，但又不象蘑菇那樣產(chǎn)生大型的子實(shí)體。常見(jiàn)毒性大的霉菌毒素：黃曲霉毒素（AFT）、雜色曲霉素、赭曲霉毒素、伏馬菌素、展青霉素、桔青霉素、玉米赤霉烯酮霉菌毒素的命名與分類按照產(chǎn)生毒素的霉菌名稱來(lái)命名按毒作用部位分肝臟毒素腎臟毒素神經(jīng)毒素類似性激素作用物質(zhì)按毒素來(lái)源分曲霉毒素青霉毒素鐮刀菌毒素霉菌毒素的分類按毒作用機(jī)理抑制蛋白質(zhì)合成類作用于離子通道類作用于細(xì)胞骨架類作用于細(xì)胞突觸類霉菌毒素的分類按毒素結(jié)構(gòu)分二呋喃環(huán)內(nèi)酯環(huán)醌類霉菌毒素的產(chǎn)生條件水分

pH

溫度濕度氧氣霉菌毒性與危害肝、腎、神經(jīng)、生殖、消化系統(tǒng)的損害免疫抑制、細(xì)胞毒性致癌、致畸、致突變，如黃曲霉毒素能誘發(fā)人、猴、鼠、禽類發(fā)生肝癌，致癌所需時(shí)間最短為24周。第二節(jié)黃曲霉毒素的檢驗(yàn)黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)

黃曲霉、寄生霉和溫特霉的代謝產(chǎn)物劇毒物，其毒性是氰化鉀的10倍，為砒霜的68倍，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)之一黃曲霉毒素B1最為多見(jiàn)，其毒性和致癌性也最強(qiáng)高溫高濕地區(qū)生產(chǎn)的花生、玉米、大米、棉籽等最容易被污染基本結(jié)構(gòu)：二呋喃環(huán)和香豆素產(chǎn)生熒光顏色不同，可分為B族（藍(lán)色）和G族（綠色）兩大類及其衍生物主要存在于牛奶中AFTB1及其衍生物AFTG2及其衍生物黃曲霉毒素的理化性質(zhì)耐熱，高于280℃裂解；耐光，不耐氧化劑難溶于水，乙醚、石油醚，易溶于甲醇和氯仿在堿性條件下，其結(jié)構(gòu)中的內(nèi)脂環(huán)可被破壞形成香豆素鈉鹽，該鹽能溶于水，無(wú)毒。在酸性條件下，能發(fā)生逆反應(yīng)，恢復(fù)其毒性。其反應(yīng)式為：黃曲霉毒素B1黃曲霉毒素的分析方法TLC酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）微柱篩選法HPLC國(guó)標(biāo)法薄層色譜法—單向展開(kāi)法樣品中AFTB1經(jīng)甲醇-水溶液提取后，濃縮、定容、點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上，經(jīng)展開(kāi)分離后，在波長(zhǎng)365nm紫外光下觀察藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)比較來(lái)確定含量。樣品處理樣品→加正己烷（或石油醚）和甲醇-水溶液，震蕩→分層，取甲醇-水層→氯仿萃取→無(wú)水Na2SO4→過(guò)濾→濾液蒸干→苯-乙腈溶解→備用點(diǎn)樣

在距薄層板下端的2cm基線上用微量注射器滴加樣液，標(biāo)液，一塊板滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)的直徑～3mm，大小一致，在一條直線上。滴加樣式如下：

第一點(diǎn)第二點(diǎn)第三點(diǎn)第四點(diǎn)樣液

—

20

20

20

μl淡標(biāo)

(0.04μg/ml)

10

—

10

—

μl濃標(biāo)

(0.2μg/ml)—

—

—

10

μl

（最低熒光點(diǎn)）（樣點(diǎn)）（熒光定位）預(yù)展及展開(kāi)

預(yù)展，12cm無(wú)水乙醚展開(kāi)10～12cm

丙酮：氯仿

8：92觀察及確證365nm若Rf=0.6附近有藍(lán)紫色熒光確證點(diǎn)樣后，在點(diǎn)樣處滴加三氟乙酸Rf=0.1附近有藍(lán)紫色熒光展開(kāi)、紫外燈下觀察AFTB1→AFTB2a極性增大確證點(diǎn)樣操作第一點(diǎn)第二點(diǎn)第三點(diǎn)第四點(diǎn)樣液μl—20—20淡標(biāo)（0.04μg/ml）10—

10

—

三氟乙酸1小滴１小滴—

—

（反應(yīng)5min，熱風(fēng)吹2min，<40℃）

定量操作方法第一點(diǎn)第二點(diǎn)第三點(diǎn)第四點(diǎn)樣液

—101520μl淡標(biāo)

10—

—

—μl0.0004μg（0.04μg/ml）定量操作方法如樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與淡標(biāo)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度一致，則樣品中AFTB1含量為0.0004μg如樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度比最低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)減少滴加微升數(shù)或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸?，直至樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致。高效液相色譜法測(cè)定AFTB1樣品中的黃曲霉毒素經(jīng)C18柱分離，用帶熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，峰面積或峰高定量。樣品提取樣品粉碎加少量水氯仿提取無(wú)水Na2SO4脫水過(guò)濾提取液，待凈化樣品凈化和衍生物反應(yīng)硅鎂型吸附劑1.提取液2.氯仿-正己烷氯仿-甲醇3.丙酮-水洗脫洗脫液水浴蒸干氯仿溶解部分加入正己烷、三氟乙酸靜置30min氮?dú)獯蹈捎昧鲃?dòng)相溶解進(jìn)高效液相色譜儀高效液相測(cè)定參考條件檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)：360nm

發(fā)射波長(zhǎng)：425nm色譜柱：C18流動(dòng)相：甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀（1+1）或乙腈-甲醇-水（50+150+300）流速：1.3ml/min微柱篩選法P130樣液中黃曲霉毒素被微柱管內(nèi)硅鎂型吸附劑層吸附后,在365nm紫外光燈下顯示藍(lán)紫色熒光環(huán)，其熒光強(qiáng)度與黃曲霉毒素在一定的濃度范圍內(nèi)成正比例關(guān)系。由于在微柱上不能分離黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,所以測(cè)得結(jié)果為總的黃曲霉毒素含量。

GB/T5009.23-2006玻璃微柱管：內(nèi)徑0.4cm，長(zhǎng)12cm,為便于加液可在管的上部接一段粗的管口。

微柱層析架：附有接受洗脫廢液的容器，要盡可能密閉。

下層甲醇水提取液花生油振搖石油醚甲醇-水氯仿下層棄去水層，洗去殘留甲醇過(guò)濾備用無(wú)水硫酸鈉水黃曲霉毒素的提取—甲醇-水-石油醚提取法下層萃取液玉米磨碎潤(rùn)濕氯仿過(guò)濾備用無(wú)水硫酸鈉黃曲霉毒素的提取—三氯甲烷水提取法甲醇-水微柱管制備脫脂棉（鋪?lái)攲樱?cm無(wú)水硫酸鈉（60～100目）1.5cm酸性氧化鋁1～2.5cm中性氧化鋁0.5cm無(wú)水硫酸鈉0.5cm硅鎂型吸附劑0.5cm無(wú)水硫酸鈉脫脂棉（作底層）

微柱層析1ml液體樣液0.0025μg/ml標(biāo)液0.005μg/ml標(biāo)液氯仿展開(kāi)劑：丙酮－三氯甲烷（1:9）結(jié)果觀察與評(píng)定

365nm紫外光照射若樣品柱管內(nèi)硅鎂型吸附劑層只現(xiàn)微黃色熒光環(huán)，則樣品中黃曲霉毒素含量為未檢出(在5或10μg／kg以下)；若出現(xiàn)藍(lán)紫色熒光環(huán)，則需進(jìn)一步通過(guò)薄層色譜測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。

確證時(shí)，不需重新提取樣品其操作如下：準(zhǔn)確吸取原三氯甲烷提取液于小蒸發(fā)皿內(nèi)揮干，以少量苯－乙腈混合液(98＋2)分?jǐn)?shù)次轉(zhuǎn)入刻度小管中，定容至1.0mL，密塞，混勻，按薄層層析法確證，并測(cè)定黃曲霉毒素B1

、B2

、G1、G2

的含量。需要說(shuō)明之處層析用的氧化鋁、硅鎂型吸附劑及無(wú)水硫酸鈉使用前應(yīng)在120℃活化2h，裝瓶蓋嚴(yán)于干燥器內(nèi)，可保存1周左右，超過(guò)1周需再次活化層析結(jié)束后，最好在2h內(nèi)觀察接受洗脫液的容器要密封第三節(jié)赭曲霉毒素A的檢驗(yàn)赭曲霉毒素的理化性質(zhì)由曲霉菌，如赭曲霉、硫色曲霉、蜂蜜曲霉以及綠青霉等產(chǎn)生的一類毒素。赭曲霉毒素A（OTA）毒性最大，在霉變谷物、飼料等最常見(jiàn)。OTA微溶于水、石油醚，加堿成鹽，水溶解性增大酸性時(shí)，溶于苯、氯仿。對(duì)紫外線不穩(wěn)定，幾天即分解（應(yīng)避光）用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取樣品中的赭曲霉毒素A，樣品提取液經(jīng)液-液分配后，根據(jù)其在365nm紫外光燈下產(chǎn)生黃綠色熒光，在薄層色譜板上與標(biāo)準(zhǔn)比較測(cè)定含量。采用雙相展開(kāi)法薄層色譜法GB/T5009.96-2003氯仿層樣品粉碎過(guò)濾氯仿磷酸NaHCO3水層氯仿層蒸干備用苯-乙腈鹽酸氯仿提?。追ǎ┘状?水層樣品粉碎過(guò)濾石油醚甲醇-水氯仿層震蕩氯仿層備用苯-乙腈NaCl飽和溶液提取（乙法）氯仿點(diǎn)樣、縱展展開(kāi)劑：無(wú)水乙醚乙醚-甲醇-水縱展2～3cm

樣品+標(biāo)液橫展展開(kāi)10～12cm樣品+標(biāo)液

樣液與標(biāo)品展開(kāi)劑：無(wú)水乙醚乙醚-甲醇-水縱展展開(kāi)劑：甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水甲苯-乙酸乙酯-甲酸苯-冰乙酸縱展13～15cm

樣品+標(biāo)液觀察及確證365nm與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處有黃綠色熒光確證用碳酸氫鈉乙醇溶液噴灑色譜板，室溫下干燥紫外燈OTA熒光點(diǎn)應(yīng)由黃綠色變?yōu)樗{(lán)色稀釋定量比較樣液中OA與標(biāo)準(zhǔn)OA點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，估計(jì)稀釋倍數(shù)。薄層板經(jīng)雙向展開(kāi)后，當(dāng)樣品中OA含量高時(shí)，OA的熒光點(diǎn)會(huì)被橫向拉長(zhǎng)，使點(diǎn)變扁，或分成兩個(gè)黃綠色熒光點(diǎn)。在橫展過(guò)程中，原點(diǎn)上OA的量超過(guò)了硅膠的吸附能力，原點(diǎn)上的雜質(zhì)和殘留溶劑在橫展中將OA點(diǎn)橫向拉長(zhǎng)了。稀釋定量這時(shí)可根據(jù)OA黃綠色熒光的總強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度比較，估計(jì)需減少的滴加微升數(shù)或所需稀釋倍數(shù)。經(jīng)稀釋后測(cè)定含量時(shí)，可在樣液點(diǎn)的左邊基線上滴加二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，OA的量可為4ng、8ng，比較樣液與兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)OA熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，概略定量方法說(shuō)明本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了谷物和大豆中OTA的薄層色譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于小麥、玉米和大豆中OTA的測(cè)定。薄層板上OTA的最低檢出量為4ng。本方法的最低檢測(cè)量為10μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)使用液冰箱黑紙避光第四節(jié)展青霉素的檢驗(yàn)一、展青霉素的理化性質(zhì)無(wú)色結(jié)晶，熔點(diǎn)110℃，在70-100℃可升華；溶于水和乙醇；在堿性條件下不穩(wěn)定，在酸性溶液中較穩(wěn)定，耐熱。二、食品中的來(lái)源主要存在于腐爛水果及其制品中展青霉素由蕁麻青霉、擴(kuò)張青霉和棒曲霉等霉菌代謝產(chǎn)生的。三、毒性與危害四、衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)五、分析方法展青霉素的測(cè)定方法有氣相色譜法、高效液相色譜法和薄層色譜法。我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)分析方法為雙向薄層掃描定量測(cè)定法。雙相薄層掃描測(cè)定法用乙酸乙酯提取果汁，利用1.5%碳酸鈉凈化樣品，經(jīng)雙向薄層分離后，利用薄層掃描儀進(jìn)行紫外反射光掃描定量。

本方法適合于蘋(píng)果、山楂制品及其半成品中展青霉素的測(cè)定GB/T5009.185-2003薄層掃描儀展青霉素的提取果汁：加乙酸乙酯，振搖2min，靜置分層。重復(fù)以上步驟兩次，合并有機(jī)相。有機(jī)相加碳酸鈉，振搖1min，靜置分層后，棄去碳酸鈉層，再用碳酸鈉重復(fù)處理一次。提取液濾真空減壓濃縮近干，用少許三氯甲烷清洗瓶壁，濃縮干，加三氯甲烷定溶，供薄層色譜分析用。展青霉素的提取鮮蘋(píng)果、果醬：蘋(píng)果洗凈、削皮、打碎置研缽中，加無(wú)水硫酸鈉研磨后轉(zhuǎn)至錐形瓶加乙酸乙酯浸泡、振蕩，過(guò)濾濾液減壓濃縮近干，用少許三氯甲烷清洗瓶壁，濃縮干，三氯甲烷定溶，供薄層色譜分析用。薄層分析點(diǎn)樣標(biāo)液與樣液相差3cm

在樣品點(diǎn)用一垂直線上，距頂端2cm處點(diǎn)20ng的標(biāo)準(zhǔn)液，為位置參考點(diǎn)。固定相：硅膠GF254

薄層分析雙向展開(kāi)先橫向，排除雜質(zhì)的干擾，再縱向在波長(zhǎng)254nm紫外燈下觀察，展青霉素Rf值約為0.35，若樣品點(diǎn)出現(xiàn)黑點(diǎn)，則樣品為陽(yáng)性。根據(jù)樣液黑色吸收點(diǎn)的強(qiáng)度高低，稀釋不同倍數(shù)后，再點(diǎn)樣10μL，使每個(gè)樣品點(diǎn)展青霉素的絕對(duì)量在10~100ng之間，經(jīng)雙向展開(kāi)后，進(jìn)行掃描定量測(cè)定。

確證陽(yáng)性樣品的驗(yàn)證：將陽(yáng)性樣品的薄層色譜板噴以MBTH顯色劑，130℃烘烤15min，冷卻至室溫后，于波長(zhǎng)360nm紫外燈下觀察，展青霉素應(yīng)呈橙黃色點(diǎn)。定量測(cè)定波長(zhǎng)270nm；參考波長(zhǎng)310nm；反射光測(cè)定；掃描速度40nn/min；記錄儀紙速20nn/min；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)及樣品中展青霉素峰面積，按下式計(jì)算樣品中展青霉素含量。

X——果汁中展青霉素含量，μg/mL；

Y——鮮蘋(píng)果中展青霉素含，μg/g；

c——展青霉素標(biāo)準(zhǔn)液濃度，μg/mL；

A——樣液展青霉素峰面積；YS——展青霉素標(biāo)準(zhǔn)峰面積；

V——加三氯甲烷定容體積，mL；

D——樣液點(diǎn)稀釋倍數(shù)；

m——樣品質(zhì)量，g；

V1——液體樣品的體積，mL。第五節(jié)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的檢驗(yàn)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）三羥基-12,13環(huán)氧單端孢霉-9烯-8酮可溶于水、含水甲醇、含水乙醇、乙酸乙酯等紫外光下無(wú)熒光雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）四羥基-12,13環(huán)氧單端孢霉-9烯-8酮易溶于水、甲醇、乙醇等極性比DON大也稱嘔吐毒素分子結(jié)構(gòu)毒性與危害衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)主要來(lái)源：DON及NIV主要是雪腐鐮刀菌污染小麥、玉米、豆餅等糧食和飼料產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。分析方法：我國(guó)規(guī)定DON的標(biāo)準(zhǔn)分析方法是薄層色譜法（第一法）和免疫測(cè)定法（第二法）。其他常用的方法有GC,HPLC及微柱法。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-薄層色譜法測(cè)定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇經(jīng)提取、凈化、濃縮和硅膠G薄層展開(kāi)后，加熱薄層板。由于在制備薄層板時(shí)加入了三氯化鋁，使脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在365nm紫外光燈下顯藍(lán)色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比較。

本標(biāo)準(zhǔn)適合于谷物及其制品GB/T5009.111-2003提取粉碎樣品加水、三氯甲烷-無(wú)水乙醇振蕩1h過(guò)濾濾液蒸干液液分配凈化石油醚溶解殘?jiān)儆眉状?水分次洗滌蒸發(fā)皿甲醇-水層過(guò)中性氧化鋁、活性炭柱甲醇-水淋洗柱子沸水浴濃縮至干乙酸乙酯溶解，濃縮，備用點(diǎn)樣、展開(kāi)、測(cè)定先點(diǎn)樣液橫展：使DON偏離原點(diǎn)（雜質(zhì)）展開(kāi)劑：乙醚-丙酮或無(wú)水乙醚

對(duì)于小麥制品，還須再用10mL石油醚橫展一次。加點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)液后縱展開(kāi)展開(kāi)劑：三氯甲烷-丙酮-異丙醇(8:1:1)

三氯甲烷-丙酮-異丙醇-水(7.5:1:1.5:0.1)薄層上端與樣品點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的位置點(diǎn)一個(gè)DON標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，作為定位參考觀察365nm雜質(zhì)有熒光DON無(wú)熒光而后薄層板在130℃加熱，冷卻后如DON處無(wú)熒光，則為陰性雜質(zhì)、DON均有熒光，但是剛好分開(kāi)，為陽(yáng)性定量陽(yáng)性樣品與不同量的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)一起進(jìn)行薄層色譜分析，比較樣品與各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)DON點(diǎn)熒光強(qiáng)度，進(jìn)行概略定量。

薄層色譜法（DON，NIV）