培養(yǎng)基適用性驗(yàn)證

培養(yǎng)基適用性驗(yàn)證

大腸埃希菌金黃色葡萄球菌（枯草芽孢桿菌

(Bacillussubtilis)

白色念珠菌(Candidaalbicans)

黑曲霉(Aspergillusniger)

備料單（菌落計(jì)數(shù)）一、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基200ml、*30.9%無菌氯化鈉溶液100ml*3平皿10套*31ml移液管9支*3、10ml移液管2支*3試管7支*3二、白色念珠菌、黑曲霉玫瑰紅鈉200ml、*20.9%無菌氯化鈉溶液100ml*2平皿10套*21ml移液管9支*3、10ml移液管2支*2試管7支*2菌液制備1）金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30℃、159r/min搖床培養(yǎng)24h做①代，上述培養(yǎng)物24h后接1ml至新鮮營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中30℃、159r/min搖床培養(yǎng)24h做②代4）白色念珠菌菌液的制備接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基,30℃150r/min培養(yǎng)24小時，做①代，上述培養(yǎng)物24h后接1ml至新鮮改良馬丁培養(yǎng)基中30℃、159r/min搖床培養(yǎng)24h做②代5）黑曲霉菌液的制備接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁培養(yǎng)基上,30℃、150\min培養(yǎng)2天4.2適用性檢查4.2.1試驗(yàn)步驟a．菌液制備：按稀釋度10-5,10-6,10-7等依次類推稀釋菌懸液，接種培養(yǎng)后取50～100cfu計(jì)數(shù)。接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上；至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30~35℃，培養(yǎng)18~24小時；接種白色念株菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基上25~28℃，培養(yǎng)24~48小時，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50~100CFU的菌懸液，備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23~28℃，培養(yǎng)5~7天，加入3-5ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能通過濾菌絲的無菌巴氏吸管）至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。菌液制備后在室溫2h內(nèi)使用，在2~8℃可再24h內(nèi)使用。b．適用性檢查：接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌各50-100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備3個平皿，混勻，凝固，置30~35℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50-100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備3個平皿，混勻，凝固，置23~28℃培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定：若被檢培養(yǎng)基上得菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上得菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上得菌落一致，判改培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。4.2.2驗(yàn)證方法驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算個試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。a．平皿法計(jì)數(shù)時，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級供試液1ml和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。薄膜過率法計(jì)數(shù)時，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋劑供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。b．菌液組

測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

c．供試品對照組取規(guī)定量的供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

d．稀釋劑對照組

若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過濾等待處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，以考察供試液替代供試驗(yàn)品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50～100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測定其菌數(shù)。

表1微生物驗(yàn)證方法組數(shù)加樣加樣量（mL）回收率（%）是否合格試驗(yàn)組供試液+菌液1菌液組菌液供試品對照組供試液稀釋劑對照組稀釋液+菌液e．結(jié)果判斷

在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中。稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)稀釋劑對照的菌回收率= ×100%菌液組的平均菌落數(shù)試驗(yàn)組平均菌落數(shù)—供試品對照組平均菌落數(shù)時間陰性對照結(jié)論金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌菌種類型培養(yǎng)基培養(yǎng)條件溫度銅綠假單胞白色念珠菌黑曲霉檢驗(yàn)人復(fù)核人日期備注：2：培養(yǎng)基適用性