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培養(yǎng)基適用性驗(yàn)證
大腸埃希菌金黃色葡萄球菌(枯草芽孢桿菌
(Bacillussubtilis)
白色念珠菌(Candidaalbicans)
黑曲霉(Aspergillusniger)
備料單(菌落計(jì)數(shù))一、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基200ml、*30.9%無菌氯化鈉溶液100ml*3平皿10套*31ml移液管9支*3、10ml移液管2支*3試管7支*3二、白色念珠菌、黑曲霉玫瑰紅鈉200ml、*20.9%無菌氯化鈉溶液100ml*2平皿10套*21ml移液管9支*3、10ml移液管2支*2試管7支*2菌液制備1)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,30℃、159r/min搖床培養(yǎng)24h做①代,上述培養(yǎng)物24h后接1ml至新鮮營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中30℃、159r/min搖床培養(yǎng)24h做②代4)白色念珠菌菌液的制備接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基,30℃150r/min培養(yǎng)24小時(shí),做①代,上述培養(yǎng)物24h后接1ml至新鮮改良馬丁培養(yǎng)基中30℃、159r/min搖床培養(yǎng)24h做②代5)黑曲霉菌液的制備接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁培養(yǎng)基上,30℃、150\min培養(yǎng)2天4.2適用性檢查4.2.1試驗(yàn)步驟a.菌液制備:按稀釋度10-5,10-6,10-7等依次類推稀釋菌懸液,接種培養(yǎng)后取50~100cfu計(jì)數(shù)。接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上;至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中,30~35℃,培養(yǎng)18~24小時(shí);接種白色念株菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基上25~28℃,培養(yǎng)24~48小時(shí),上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50~100CFU的菌懸液,備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上,23~28℃,培養(yǎng)5~7天,加入3-5ml0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,吸出孢子懸液(用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能通過濾菌絲的無菌巴氏吸管)至無菌試管內(nèi),用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50~100cfu的孢子懸液。菌液制備后在室溫2h內(nèi)使用,在2~8℃可再24h內(nèi)使用。b.適用性檢查:接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌各50-100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,每株試驗(yàn)菌平行制備3個(gè)平皿,混勻,凝固,置30~35℃培養(yǎng)48h,計(jì)數(shù);取白色念珠菌、黑曲霉各50-100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,每株試驗(yàn)菌平行制備3個(gè)平皿,混勻,凝固,置23~28℃培養(yǎng)72h,計(jì)數(shù)。同時(shí),用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定:若被檢培養(yǎng)基上得菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上得菌落平均數(shù)的70%,且菌落形態(tài)大小與對(duì)照培養(yǎng)基上得菌落一致,判改培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。4.2.2驗(yàn)證方法驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn),并分別計(jì)算個(gè)試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。a.平皿法計(jì)數(shù)時(shí),取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液1ml和50~100cfu試驗(yàn)菌,分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿,按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。薄膜過率法計(jì)數(shù)時(shí),取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋劑供試液,過濾,沖洗,在最后一次的沖洗液中加入50~100cfu試驗(yàn)菌,過濾,按薄膜過濾法測(cè)定其菌數(shù)。b.菌液組
測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。
c.供試品對(duì)照組取規(guī)定量的供試液,按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。
d.稀釋劑對(duì)照組
若供試液制備需要分散、乳化,中和、離心或薄膜過濾等待處理時(shí),應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組,以考察供試液替代供試驗(yàn)品,加入試驗(yàn)菌,使最終菌濃度為每1ml供試液含50~100cfu,按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。
表1微生物驗(yàn)證方法組數(shù)加樣加樣量(mL)回收率(%)是否合格試驗(yàn)組供試液+菌液1菌液組菌液供試品對(duì)照組供試液稀釋劑對(duì)照組稀釋液+菌液e.結(jié)果判斷
在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中。稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)稀釋劑對(duì)照的菌回收率= ×100%菌液組的平均菌落數(shù)試驗(yàn)組平均菌落數(shù)—供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)時(shí)間陰性對(duì)照結(jié)論金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌菌種類型培養(yǎng)基培養(yǎng)條件溫度銅綠假單胞白色念珠菌黑曲霉檢驗(yàn)人復(fù)核人日期備注:2:培養(yǎng)基適用性
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