實驗七-黑曲霉發(fā)酵檸檬酸

實驗七黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸實驗目的了解產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)的機理；

檸檬酸發(fā)酵的發(fā)酵條件掌握發(fā)酵過程步驟黑曲霉中存在TCA的酶系檸檬酸的發(fā)酵的過程80%的糖代謝走EMP途徑檸檬酸發(fā)酵的條件

1、合適的碳源（淀粉、麥芽糖、甘露糖等），高濃度的糖；2、限制有機氮源、選擇適量的無機氮源（銨鹽）；

孢子培養(yǎng)基

：要求能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，所以營養(yǎng)不要太豐富；

發(fā)酵培養(yǎng)基：既要使菌體能迅速生長，達到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成所需產(chǎn)物

；3、合適的pH值，黑曲霉在pH為2～3的環(huán)境中發(fā)酵糖，產(chǎn)物以檸檬酸為主；當pH接近中性時則大量產(chǎn)生草酸，而檸檬酸產(chǎn)量很低；

4、發(fā)酵液中溶氧量要高（搖床的轉速250r/m）；5、限制重金屬離子，如Mn2＋缺乏促進EMP途徑暢通，

控制Fe2＋含量使順烏頭酸酶活力降低，使檸檬酸積累。實驗步驟菌種獲得孢子懸液制備

取約5mL無菌水至黑曲霉平板上，用滅菌滴管輕輕刮下孢子，振蕩數(shù)下制成孢子懸液。

液體深層發(fā)酵

取約4mL孢子懸液接種于玉米粉搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中。在轉速為200rpm旋轉搖床上，30℃培養(yǎng)5～6天。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（1.5L，分裝10只250mL三角瓶）

牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g,瓊脂15g，水1000mL,pH7.4～7.6。制法：溶解分裝后121℃滅菌20min。改良CHALMERS培養(yǎng)基（1.5L，分裝10只250mL三角瓶）

大豆蛋白胨5g，牛肉浸膏5g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，乳糖20g，碳酸鈣10g，瓊脂15g，水1000mL，pH7.4～7.6，1%中性紅溶液5mL。制法：溶解分裝后121℃滅菌20min。

滅菌自來水（20mL，于50mL三角瓶）

每組2瓶，其中一瓶放置數(shù)顆玻璃珠其他滅菌物品（每組1套）

小包裝1.5mL離心管、藍色黃色槍頭若干，培養(yǎng)皿每組1包（每包不少于6個）問題與思考影響黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的因素有哪些？黑曲霉檸檬酸pH控制黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌生長發(fā)育適宜PH3～7。在含糖合成培養(yǎng)基中，分生孢子在PH6.8—7.2發(fā)芽良好．若起始pH較低(例如4.5以下)，會強烈抑制它的發(fā)育。在PH2.5以下，分生孢子不膨脹．當pH大于7.5時分生孢子會劇烈膨脹，甚至破裂。一般認為檸檬酸發(fā)酵在菌種生長期，pH維持在4.5，而檸檬酸積累時即產(chǎn)酸期的最適PH2.0～3.0，pH3.0以上容易產(chǎn)生草酸，在pH5.0容易生成葡萄糖酸(葡萄糖氧化酶最適PH5.6)，在PH3.0以下是檸檬酸積累的條件。采用淀粉或薯干粉等原料的檸檬酸發(fā)酵過程中，淀粉的糖化和檸檬酸的生成和積累，是處在同一個環(huán)境中，都是由黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌完成的。發(fā)酵的技術關鍵是兼顧糖化和產(chǎn)酸，要保證糖化速度和產(chǎn)酸速度之間的銜接與平衡。黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的酸性糖化酶的最適PH為4.0～4.6．隨著pH的下降，尤其當PH降至2.2時，液化酶和糖化酶會大量破壞，而檸檬酸發(fā)酵的最佳PH是2.0以下。要解決兩者矛盾，可采用下列方法：

(1)采用酸性平扳馴化，分離在