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實(shí)驗(yàn)七黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私猱a(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)的機(jī)理;
檸檬酸發(fā)酵的發(fā)酵條件掌握發(fā)酵過(guò)程步驟黑曲霉中存在TCA的酶系檸檬酸的發(fā)酵的過(guò)程80%的糖代謝走EMP途徑檸檬酸發(fā)酵的條件
1、合適的碳源(淀粉、麥芽糖、甘露糖等),高濃度的糖;2、限制有機(jī)氮源、選擇適量的無(wú)機(jī)氮源(銨鹽);
孢子培養(yǎng)基
:要求能使菌體迅速生長(zhǎng),產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子,所以營(yíng)養(yǎng)不要太豐富;
發(fā)酵培養(yǎng)基:既要使菌體能迅速生長(zhǎng),達(dá)到一定的菌絲濃度,又要使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成所需產(chǎn)物
;3、合適的pH值,黑曲霉在pH為2~3的環(huán)境中發(fā)酵糖,產(chǎn)物以檸檬酸為主;當(dāng)pH接近中性時(shí)則大量產(chǎn)生草酸,而檸檬酸產(chǎn)量很低;
4、發(fā)酵液中溶氧量要高(搖床的轉(zhuǎn)速250r/m);5、限制重金屬離子,如Mn2+缺乏促進(jìn)EMP途徑暢通,
控制Fe2+含量使順烏頭酸酶活力降低,使檸檬酸積累。實(shí)驗(yàn)步驟菌種獲得孢子懸液制備
取約5mL無(wú)菌水至黑曲霉平板上,用滅菌滴管輕輕刮下孢子,振蕩數(shù)下制成孢子懸液。
液體深層發(fā)酵
取約4mL孢子懸液接種于玉米粉搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)速為200rpm旋轉(zhuǎn)搖床上,30℃培養(yǎng)5~6天。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(1.5L,分裝10只250mL三角瓶)
牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,瓊脂15g,水1000mL,pH7.4~7.6。制法:溶解分裝后121℃滅菌20min。改良CHALMERS培養(yǎng)基(1.5L,分裝10只250mL三角瓶)
大豆蛋白胨5g,牛肉浸膏5g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,乳糖20g,碳酸鈣10g,瓊脂15g,水1000mL,pH7.4~7.6,1%中性紅溶液5mL。制法:溶解分裝后121℃滅菌20min。
滅菌自來(lái)水(20mL,于50mL三角瓶)
每組2瓶,其中一瓶放置數(shù)顆玻璃珠其他滅菌物品(每組1套)
小包裝1.5mL離心管、藍(lán)色黃色槍頭若干,培養(yǎng)皿每組1包(每包不少于6個(gè))問(wèn)題與思考影響黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的因素有哪些?黑曲霉檸檬酸pH控制黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌生長(zhǎng)發(fā)育適宜PH3~7。在含糖合成培養(yǎng)基中,分生孢子在PH6.8—7.2發(fā)芽良好.若起始pH較低(例如4.5以下),會(huì)強(qiáng)烈抑制它的發(fā)育。在PH2.5以下,分生孢子不膨脹.當(dāng)pH大于7.5時(shí)分生孢子會(huì)劇烈膨脹,甚至破裂。一般認(rèn)為檸檬酸發(fā)酵在菌種生長(zhǎng)期,pH維持在4.5,而檸檬酸積累時(shí)即產(chǎn)酸期的最適PH2.0~3.0,pH3.0以上容易產(chǎn)生草酸,在pH5.0容易生成葡萄糖酸(葡萄糖氧化酶最適PH5.6),在PH3.0以下是檸檬酸積累的條件。采用淀粉或薯干粉等原料的檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中,淀粉的糖化和檸檬酸的生成和積累,是處在同一個(gè)環(huán)境中,都是由黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌完成的。發(fā)酵的技術(shù)關(guān)鍵是兼顧糖化和產(chǎn)酸,要保證糖化速度和產(chǎn)酸速度之間的銜接與平衡。黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的酸性糖化酶的最適PH為4.0~4.6.隨著pH的下降,尤其當(dāng)PH降至2.2時(shí),液化酶和糖化酶會(huì)大量破壞,而檸檬酸發(fā)酵的最佳PH是2.0以下。要解決兩者矛盾,可采用下列方法:
(1)采用酸性平扳馴化,分離在
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