研究生課程-細胞培養(yǎng)與應(yīng)用

細胞培養(yǎng)與應(yīng)用第一部分動物細胞培養(yǎng)技術(shù)BioengineeringCollegeDalianUniversity定義：指將動物的某一組織取出，使其分散成單個細胞，在人工模擬體內(nèi)生理環(huán)境的條件下使之存活、生長和增殖的技術(shù)。動物細胞培養(yǎng)BioengineeringCollegeDalianUniversity動物細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)：又稱初代培養(yǎng)。指將機體取出的細胞或組織置于體外條件下生長，直到第一次傳代之前的過程。大約能增殖10代左右。傳代培養(yǎng)：也稱繼代培養(yǎng)。指細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中繼續(xù)培養(yǎng)。BioengineeringCollegeDalianUniversity原代培養(yǎng)細胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期BioengineeringCollegeDalianUniversity細胞系與細胞株的概念細胞系（cellline）：原代培養(yǎng)的細胞已經(jīng)首次傳代成功即成為細胞系，細胞系可泛指一般可傳代的細胞。有限細胞系和無限細胞系：不能傳代或傳代次數(shù)有限，稱有限細胞；大多數(shù)二倍體細胞為有限細胞系。能連續(xù)傳代的細胞系，稱永久細胞系。細胞株（cellstrain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物的培養(yǎng)物稱為細胞株。BioengineeringCollegeDalianUniversity動物細胞體外培養(yǎng)的生長方式1.貼壁型細胞

(1)成纖維細胞型細胞

(2)上皮細胞型細胞

(3)游走型細胞

(4)多形型細胞2.

懸浮型細胞BioengineeringCollegeDalianUniversity1.動物細胞的分裂周期長：

動物細胞分裂周期一般為12-48h。它不僅隨細胞種屬的不同而有差異，即使是同一種屬，不同部位的細胞所需的時間也不同。此外，培養(yǎng)條件如：溫度、pH、培養(yǎng)基成分等也會影響分裂周期的長短。動物細胞體外培養(yǎng)特點BioengineeringCollegeDalianUniversity各類細胞分裂周期時間表BioengineeringCollegeDalianUniversity2.貼附生長并伸展：

貼附并伸展是貼壁型細胞體外培養(yǎng)時的基本生長特點。它受許多因素影響，如離子濃度、機械、物理因素、生物因素等。動物細胞體外培養(yǎng)特點BioengineeringCollegeDalianUniversity細胞貼壁后的伸展BioengineeringCollegeDalianUniversity動物細胞體外培養(yǎng)特點3.接觸抑制(contactinhibitition)

現(xiàn)象：

貼壁生長的細胞分裂增殖，細胞間逐漸匯合相互接觸時，細胞停止增殖，即細胞密度不再增加，這一現(xiàn)象稱為接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。BioengineeringCollegeDalianUniversity動物細胞體外培養(yǎng)特點4.有限細胞系和永久細胞系

原代培養(yǎng)細胞經(jīng)繼代培養(yǎng)后即成為有限細胞系只能在有限的時間內(nèi)生存，經(jīng)過10-50代后細胞逐漸死亡。細胞繼代次數(shù)和存活時間的長短以細胞來源的年齡和種屬不同而有差異。年齡越大繼代次數(shù)越少。BioengineeringCollegeDalianUniversity

有限細胞系轉(zhuǎn)化成永久細胞系稱為“體外轉(zhuǎn)化”。永久細胞系有如下特征：細胞變小，黏附性減少，具有較高的核質(zhì)比；生長速率增加，倍增時間縮短；對血清的依賴性減?。毁N壁依賴性降低；細胞異倍體和非整倍體增加；細胞接種到體內(nèi)后，生癌率上升。BioengineeringCollegeDalianUniversity5.動物細胞的環(huán)境敏感性

動物細胞與微生物和植物細胞相比，其培養(yǎng)難度要大一些，原因是動物細胞只有細胞膜，而沒有細胞壁的保護。因此對培養(yǎng)環(huán)境十分敏感，一切影響細胞膜變形的因素都會影響動物細胞存活。動物細胞體外培養(yǎng)特點BioengineeringCollegeDalianUniversity動物細胞體外培養(yǎng)的條件1.溫度:37℃對低溫耐受比對高溫耐受強2.pH7.2-7.4對偏酸性耐受強些3.氣體O2和CO2（5%)CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-4.營養(yǎng)需求：培養(yǎng)基和血清5.滲透壓6.無污染：培養(yǎng)要嚴格在無菌條件下進行，細菌、真菌、病毒、或其它細胞均可導(dǎo)致培養(yǎng)物的污染。BioengineeringCollegeDalianUniversity實驗室BioengineeringCollegeDalianUniversity常用實驗用品、設(shè)備1.水處理設(shè)備：蒸餾水發(fā)生器、超純水系統(tǒng)2.無菌設(shè)備：超凈臺、滅菌鍋、濾器等3.培養(yǎng)設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱4.觀察分析設(shè)備：顯微鏡、酶標儀等5.分離與保存設(shè)備：離心機、低溫冰箱、液氮罐6.耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動移液器，培養(yǎng)板，凍存管等BioengineeringCollegeDalianUniversity自動雙重純水蒸餾器純水儀水處理設(shè)備BioengineeringCollegeDalianUniversity常用滅菌器具：超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒壓力蒸汽消毒器（滅菌鍋）：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒。濾器：過濾除菌無菌設(shè)備BioengineeringCollegeDalianUniversity超凈工作臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。BioengineeringCollegeDalianUniversity高壓蒸汽滅菌鍋濕熱滅菌：121℃,20min全過程約2h。BioengineeringCollegeDalianUniversity電熱干燥箱——可用于器材烘干以及進行干熱滅菌。干熱滅菌（140℃，2-3h）烘干70℃BioengineeringCollegeDalianUniversity濾器BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity設(shè)定條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱時應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③蒸餾水槽中滅菌蒸餾水3000毫升以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2

培養(yǎng)箱BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity酶標儀微孔板震蕩器BioengineeringCollegeDalianUniversity天平酸度計BioengineeringCollegeDalianUniversity培養(yǎng)瓶BioengineeringCollegeDalianUniversity培養(yǎng)板BioengineeringCollegeDalianUniversity凍存管BioengineeringCollegeDalianUniversity刻度吸管和電動移液器BioengineeringCollegeDalianUniversity實驗室動物細胞培養(yǎng)的一般過程

動物細胞小規(guī)模培養(yǎng)方法有：培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法、培養(yǎng)板培養(yǎng)法、培養(yǎng)皿培養(yǎng)法。

準備工作：

1.器材的清洗、包裝和滅菌

2.培養(yǎng)液及其他培養(yǎng)用液的配置BioengineeringCollegeDalianUniversity細胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)：

組織塊培養(yǎng)法——用剪刀將組織剪成小塊組織消化培養(yǎng)——用酶液將組織小塊進一步分散成細胞團或單個細胞傳代培養(yǎng)——細胞覆蓋80%-90%是傳代的最佳時期

BioengineeringCollegeDalianUniversity組織塊培養(yǎng)法BioengineeringCollegeDalianUniversity組織消化培養(yǎng)取材分離組織消化（胰蛋白酶、膠原酶）培養(yǎng)過程BioengineeringCollegeDalianUniversity傳代培養(yǎng)BioengineeringCollegeDalianUniversity動物細胞貼壁培養(yǎng)的生長階段游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）BioengineeringCollegeDalianUniversity游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)；也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。一般游離期持續(xù)10分鐘——4小時BioengineeringCollegeDalianUniversity貼壁期：

細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。貼壁表面要帶陽性電荷和高度的表面活性；一般用于細胞培養(yǎng)的表面是玻璃、塑料、金屬和微載體。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學合成的功能基團）。血清中有促使細胞貼壁的帶正電荷的糖蛋白（生長基質(zhì)），這些促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再附著于吸附的促貼壁因子。BioengineeringCollegeDalianUniversity細胞貼壁過程BioengineeringCollegeDalianUniversity潛伏期此時細胞有生長活動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity

細胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。

培養(yǎng)細胞的活力測定BioengineeringCollegeDalianUniversity臺盼藍法測細胞活力

活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細胞占細胞中的百分比表示細胞活力BioengineeringCollegeDalianUniversity細胞凍存和復(fù)蘇1.凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融2.在細胞凍存時加入低溫保護劑能大大提高凍存效果。細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。獲得較好的凍存效果的方法：BioengineeringCollegeDalianUniversity1.預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基、10%DMSO2.取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液（1×106-5×106細胞/mL)3.1mL/管分裝于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。4.1年后，存活率可達80％一90％。細胞凍存方法DMSO液先用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細胞。BioengineeringCollegeDalianUniversityl.從液氮中取出冷凍管，迅速投入38～40℃水浴中，1分鐘以內(nèi)使其融化；2.于5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；3.低速離心10分鐘；4.去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細胞。細胞復(fù)蘇方法第二部分動物細胞應(yīng)用

BioengineeringCollegeDalianUniversity

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍原理：MTT可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成結(jié)晶狀的深紫色產(chǎn)物formazan。在特定溶劑存在的情況下，可以被完全溶解。然后通過酶標儀可以測定570nm波長附近的吸光度。細胞增殖越多越快，則吸光度越高；細胞毒性越大，則吸光度越低。細胞增殖及細胞毒性檢測細胞毒性檢測細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)。通過檢測從質(zhì)膜破裂的細胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性，就可以實現(xiàn)對細胞毒性的定量分析BioengineeringCollegeDalianUniversity細胞凋亡與壞死檢測采用Hoechst33342和碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)雙染的方法。細胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會固縮。Hoechst33342可以穿透細胞膜，染色后凋亡細胞熒光會比正常細胞明顯增強。碘化丙啶(PI)不能穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色。而對于壞死細胞，其細胞膜的完整性喪失，碘化丙啶(PI)可以染色壞死細胞。BioengineeringCollegeDalianUniversity免疫化學檢測法利用免疫學抗原抗體反應(yīng)的靈敏性，以熒光素、酶、放射性核素或電子致密物質(zhì)等對抗原或抗體加以標記，對某些蛋白質(zhì)(抗原或抗體)進行檢測的技術(shù)。特點：敏感性高、特異性強、應(yīng)用范圍廣，可以對蛋白質(zhì)進行定量、定性或定位。常用的免疫化學檢測法：免疫熒光技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附Westernblot技術(shù)2023/2/5572023/2/558免疫熒光技術(shù)5μm2023/2/560Westernblot雜交細心責任心愛心BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity

沿固相表面單層貼壁生長，直至長滿表面。表面長滿后不再生長，需進行傳代。一般采用酶消化法或機械法使細胞從生長表面上脫落下來。貼壁型細胞BioengineeringCollegeDalianUniversity貼壁型細胞

外形與體內(nèi)成纖維細胞形狀相似，大致呈梭形或成纖維細胞型細胞

起源于中胚層的細胞（比如心肌、平滑肌、成骨肌細胞）在體外培養(yǎng)時一般表現(xiàn)為這種形式。

不規(guī)則三角形。中央有圓形細胞核，胞質(zhì)向外伸出2-3個長短不同的突起突連成網(wǎng)，生長時呈放射狀、漩渦狀走向。BioengineeringCollegeDalianUniversity貼壁型細胞上皮細胞型細胞

細胞呈不規(guī)則扁平多角形，中間有扁圓形胞核，彼此緊密相連的成單層生長。消化道上皮、肝、胰和肺泡上皮等起源于外胚層和內(nèi)胚層的細胞在體外培養(yǎng)生長時多呈上皮細胞型。BioengineeringCollegeDalianUniversity貼壁型細胞游走型細胞

細胞貼附于支持物上分散生長，一般不連接成片；常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且方向不規(guī)則；細胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。該類細胞主要是單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞，如顆粒性白細胞、淋巴細胞、單核細胞等。BioengineeringCollegeDalianUniversity貼壁型細胞多形型細胞

形態(tài)上不規(guī)則，由胞體和胞突兩部分組成，胞突呈細長型，類似絲狀偽足。最常見的多形型細胞是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。BioengineeringCollegeDalianUniversity懸浮型細胞非貼附型細胞

此類細胞體外生長不必貼附于支持物上，可在培養(yǎng)液中懸浮生長。來源于血液、淋巴組織的細胞以及某些腫瘤細胞、轉(zhuǎn)化細胞系都屬于此類細胞。形態(tài)學特點是胞體始終為球形。BioengineeringCollegeDalianUniversity兼性貼壁型細胞

動物細胞培養(yǎng)中，有些細胞呈現(xiàn)雙重性，既可以貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)。如中國倉鼠卵巢細胞（CHO）、小鼠L929細胞等。BioengineeringCollegeDalianUniversity

1.天然培養(yǎng)基：

天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。BioengineeringCollegeDalianUniversity2.合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如MEM、RPMI-1640、DMEM等。優(yōu)點:標準化生產(chǎn)，成分相對固定,成本低缺點:只能維持生存，需要額外補充血清。

BioengineeringCollegeDalianUniversity血清

成分復(fù)雜，提供維持細胞生長增殖的各種生長因子和保持細胞生物學性狀所需的許多未知成分。常用的動物血清主要有牛血清和馬血清。牛血清包括小牛血清和胎牛血清。胎牛血清來源少，價格高。小牛血清要求剛生下未哺乳的小牛。優(yōu)質(zhì)血清：透明，淡黃色，無沉淀物，無污染。一般使用濃度10%，凍存細胞時用20%。BioengineeringCollegeDalianUniversity血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學特性是細胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞．BioengineeringCollegeDalianUniversity培養(yǎng)基3.無血清培養(yǎng)基通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充已知的一些細胞生長因子代替血清，比如激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴展因子等。無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。BioengineeringCollegeDalianUniversity常用各材質(zhì)器材、器皿的準備1.玻璃器皿：浸泡、刷洗、浸酸、沖洗2.橡膠制品：浸泡、2%NaOH煮、自來水沖洗、1%鹽酸浸泡、蒸餾水煮沸3.塑料制品：自來水沖洗、2%NaOH浸泡、自來水、5%鹽酸浸泡、沖洗4.金屬器具：擦拭、消毒烘干、包裝、濕熱或干熱滅菌BackBioengineeringCollegeDalianUniversity清潔液的配制BioengineeringCollegeDalianUniversity1.水：新鮮制備的三蒸水或去離子水2.平衡鹽緩沖液：常用有Hank’s液、Earl液和PBS等

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20g

加水至1000ml細胞培養(yǎng)用液的配制BioengineeringCollegeDalianUniversity

3.消化液：胰蛋白酶、膠原酶、EDTA溶液常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用無Ca2+、Mg2+的緩沖液配制；用濾器過濾除菌。消化時間2-10分鐘,用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用。用于傳代細胞消化時常和EDTA聯(lián)合使用。膠原酶對膠原和細胞間質(zhì)有較強的消化作用，適用于消化纖維組織、上皮組織。作用溫和，長時間作用也不會影響細胞，血清和鈣、鎂離子對其無影響。BioengineeringCollegeDalianUniversity

4.培養(yǎng)基：

合成培養(yǎng)基大多數(shù)都已商品化，如DMEM、RPMI-1640、MEM等。一般為粉末狀，按每袋可配置1L培養(yǎng)基的量分裝。配制時，一袋粉末溶于1L三蒸水中，加入2gNaHCO3，用0.22μm的濾膜抽濾滅菌；分裝后于4℃短期保存，盡快用完。完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5