研究生課程-細(xì)胞培養(yǎng)與應(yīng)用

細(xì)胞培養(yǎng)與應(yīng)用第一部分動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)BioengineeringCollegeDalianUniversity定義：指將動(dòng)物的某一組織取出，使其分散成單個(gè)細(xì)胞，在人工模擬體內(nèi)生理環(huán)境的條件下使之存活、生長(zhǎng)和增殖的技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)BioengineeringCollegeDalianUniversity動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)：又稱(chēng)初代培養(yǎng)。指將機(jī)體取出的細(xì)胞或組織置于體外條件下生長(zhǎng)，直到第一次傳代之前的過(guò)程。大約能增殖10代左右。傳代培養(yǎng)：也稱(chēng)繼代培養(yǎng)。指細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中繼續(xù)培養(yǎng)。BioengineeringCollegeDalianUniversity原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期BioengineeringCollegeDalianUniversity細(xì)胞系與細(xì)胞株的概念細(xì)胞系（cellline）：原代培養(yǎng)的細(xì)胞已經(jīng)首次傳代成功即成為細(xì)胞系，細(xì)胞系可泛指一般可傳代的細(xì)胞。有限細(xì)胞系和無(wú)限細(xì)胞系：不能傳代或傳代次數(shù)有限，稱(chēng)有限細(xì)胞；大多數(shù)二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。能連續(xù)傳代的細(xì)胞系，稱(chēng)永久細(xì)胞系。細(xì)胞株（cellstrain）：通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)物稱(chēng)為細(xì)胞株。BioengineeringCollegeDalianUniversity動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)方式1.貼壁型細(xì)胞

(1)成纖維細(xì)胞型細(xì)胞

(2)上皮細(xì)胞型細(xì)胞

(3)游走型細(xì)胞

(4)多形型細(xì)胞2.

懸浮型細(xì)胞BioengineeringCollegeDalianUniversity1.動(dòng)物細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)：

動(dòng)物細(xì)胞分裂周期一般為12-48h。它不僅隨細(xì)胞種屬的不同而有差異，即使是同一種屬，不同部位的細(xì)胞所需的時(shí)間也不同。此外，培養(yǎng)條件如：溫度、pH、培養(yǎng)基成分等也會(huì)影響分裂周期的長(zhǎng)短。動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)BioengineeringCollegeDalianUniversity各類(lèi)細(xì)胞分裂周期時(shí)間表BioengineeringCollegeDalianUniversity2.貼附生長(zhǎng)并伸展：

貼附并伸展是貼壁型細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)。它受許多因素影響，如離子濃度、機(jī)械、物理因素、生物因素等。動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)BioengineeringCollegeDalianUniversity細(xì)胞貼壁后的伸展BioengineeringCollegeDalianUniversity動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)3.接觸抑制(contactinhibitition)

現(xiàn)象：

貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞分裂增殖，細(xì)胞間逐漸匯合相互接觸時(shí)，細(xì)胞停止增殖，即細(xì)胞密度不再增加，這一現(xiàn)象稱(chēng)為接觸抑制或密度依賴(lài)抑制現(xiàn)象。BioengineeringCollegeDalianUniversity動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)4.有限細(xì)胞系和永久細(xì)胞系

原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)繼代培養(yǎng)后即成為有限細(xì)胞系只能在有限的時(shí)間內(nèi)生存，經(jīng)過(guò)10-50代后細(xì)胞逐漸死亡。細(xì)胞繼代次數(shù)和存活時(shí)間的長(zhǎng)短以細(xì)胞來(lái)源的年齡和種屬不同而有差異。年齡越大繼代次數(shù)越少。BioengineeringCollegeDalianUniversity

有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)化成永久細(xì)胞系稱(chēng)為“體外轉(zhuǎn)化”。永久細(xì)胞系有如下特征：細(xì)胞變小，黏附性減少，具有較高的核質(zhì)比；生長(zhǎng)速率增加，倍增時(shí)間縮短；對(duì)血清的依賴(lài)性減?。毁N壁依賴(lài)性降低；細(xì)胞異倍體和非整倍體增加；細(xì)胞接種到體內(nèi)后，生癌率上升。BioengineeringCollegeDalianUniversity5.動(dòng)物細(xì)胞的環(huán)境敏感性

動(dòng)物細(xì)胞與微生物和植物細(xì)胞相比，其培養(yǎng)難度要大一些，原因是動(dòng)物細(xì)胞只有細(xì)胞膜，而沒(méi)有細(xì)胞壁的保護(hù)。因此對(duì)培養(yǎng)環(huán)境十分敏感，一切影響細(xì)胞膜變形的因素都會(huì)影響動(dòng)物細(xì)胞存活。動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)BioengineeringCollegeDalianUniversity動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的條件1.溫度:37℃對(duì)低溫耐受比對(duì)高溫耐受強(qiáng)2.pH7.2-7.4對(duì)偏酸性耐受強(qiáng)些3.氣體O2和CO2（5%)CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-4.營(yíng)養(yǎng)需求：培養(yǎng)基和血清5.滲透壓6.無(wú)污染：培養(yǎng)要嚴(yán)格在無(wú)菌條件下進(jìn)行，細(xì)菌、真菌、病毒、或其它細(xì)胞均可導(dǎo)致培養(yǎng)物的污染。BioengineeringCollegeDalianUniversity實(shí)驗(yàn)室BioengineeringCollegeDalianUniversity常用實(shí)驗(yàn)用品、設(shè)備1.水處理設(shè)備：蒸餾水發(fā)生器、超純水系統(tǒng)2.無(wú)菌設(shè)備：超凈臺(tái)、滅菌鍋、濾器等3.培養(yǎng)設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱4.觀察分析設(shè)備：顯微鏡、酶標(biāo)儀等5.分離與保存設(shè)備：離心機(jī)、低溫冰箱、液氮罐6.耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)移液器，培養(yǎng)板，凍存管等BioengineeringCollegeDalianUniversity自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀水處理設(shè)備BioengineeringCollegeDalianUniversity常用滅菌器具：超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒壓力蒸汽消毒器（滅菌鍋）：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒。濾器：過(guò)濾除菌無(wú)菌設(shè)備BioengineeringCollegeDalianUniversity超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。BioengineeringCollegeDalianUniversity高壓蒸汽滅菌鍋濕熱滅菌：121℃,20min全過(guò)程約2h。BioengineeringCollegeDalianUniversity電熱干燥箱——可用于器材烘干以及進(jìn)行干熱滅菌。干熱滅菌（140℃，2-3h）烘干70℃BioengineeringCollegeDalianUniversity濾器BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity設(shè)定條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③蒸餾水槽中滅菌蒸餾水3000毫升以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2

培養(yǎng)箱BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity酶標(biāo)儀微孔板震蕩器BioengineeringCollegeDalianUniversity天平酸度計(jì)BioengineeringCollegeDalianUniversity培養(yǎng)瓶BioengineeringCollegeDalianUniversity培養(yǎng)板BioengineeringCollegeDalianUniversity凍存管BioengineeringCollegeDalianUniversity刻度吸管和電動(dòng)移液器BioengineeringCollegeDalianUniversity實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程

動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)方法有：培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法、培養(yǎng)板培養(yǎng)法、培養(yǎng)皿培養(yǎng)法。

準(zhǔn)備工作：

1.器材的清洗、包裝和滅菌

2.培養(yǎng)液及其他培養(yǎng)用液的配置BioengineeringCollegeDalianUniversity細(xì)胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)：

組織塊培養(yǎng)法——用剪刀將組織剪成小塊組織消化培養(yǎng)——用酶液將組織小塊進(jìn)一步分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞傳代培養(yǎng)——細(xì)胞覆蓋80%-90%是傳代的最佳時(shí)期

BioengineeringCollegeDalianUniversity組織塊培養(yǎng)法BioengineeringCollegeDalianUniversity組織消化培養(yǎng)取材分離組織消化（胰蛋白酶、膠原酶）培養(yǎng)過(guò)程BioengineeringCollegeDalianUniversity傳代培養(yǎng)BioengineeringCollegeDalianUniversity動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的生長(zhǎng)階段游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）BioengineeringCollegeDalianUniversity游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)；也稱(chēng)懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。一般游離期持續(xù)10分鐘——4小時(shí)BioengineeringCollegeDalianUniversity貼壁期：

細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。貼壁表面要帶陽(yáng)性電荷和高度的表面活性；一般用于細(xì)胞培養(yǎng)的表面是玻璃、塑料、金屬和微載體。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）。血清中有促使細(xì)胞貼壁的帶正電荷的糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再附著于吸附的促貼壁因子。BioengineeringCollegeDalianUniversity細(xì)胞貼壁過(guò)程BioengineeringCollegeDalianUniversity潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴(lài)性BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity

細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。

培養(yǎng)細(xì)胞的活力測(cè)定BioengineeringCollegeDalianUniversity臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)細(xì)胞活力

活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力BioengineeringCollegeDalianUniversity細(xì)胞凍存和復(fù)蘇1.凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融2.在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑能大大提高凍存效果。細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。獲得較好的凍存效果的方法：BioengineeringCollegeDalianUniversity1.預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基、10%DMSO2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106-5×106細(xì)胞/mL)3.1mL/管分裝于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱(chēng)和冷凍日期。4.1年后，存活率可達(dá)80％一90％。細(xì)胞凍存方法DMSO液先用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。BioengineeringCollegeDalianUniversityl.從液氮中取出冷凍管，迅速投入38～40℃水浴中，1分鐘以?xún)?nèi)使其融化；2.于5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；3.低速離心10分鐘；4.去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇方法第二部分動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)用

BioengineeringCollegeDalianUniversity

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)原理：MTT可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成結(jié)晶狀的深紫色產(chǎn)物formazan。在特定溶劑存在的情況下，可以被完全溶解。然后通過(guò)酶標(biāo)儀可以測(cè)定570nm波長(zhǎng)附近的吸光度。細(xì)胞增殖越多越快，則吸光度越高；細(xì)胞毒性越大，則吸光度越低。細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)細(xì)胞毒性檢測(cè)細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)。通過(guò)檢測(cè)從質(zhì)膜破裂的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞毒性的定量分析BioengineeringCollegeDalianUniversity細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)采用Hoechst33342和碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)雙染的方法。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)固縮。Hoechst33342可以穿透細(xì)胞膜，染色后凋亡細(xì)胞熒光會(huì)比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。碘化丙啶(PI)不能穿透細(xì)胞膜，對(duì)于具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞不能染色。而對(duì)于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性喪失，碘化丙啶(PI)可以染色壞死細(xì)胞。BioengineeringCollegeDalianUniversity免疫化學(xué)檢測(cè)法利用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)的靈敏性，以熒光素、酶、放射性核素或電子致密物質(zhì)等對(duì)抗原或抗體加以標(biāo)記，對(duì)某些蛋白質(zhì)(抗原或抗體)進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。特點(diǎn)：敏感性高、特異性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位。常用的免疫化學(xué)檢測(cè)法：免疫熒光技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附Westernblot技術(shù)2023/2/5572023/2/558免疫熒光技術(shù)5μm2023/2/560Westernblot雜交細(xì)心責(zé)任心愛(ài)心BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity

沿固相表面單層貼壁生長(zhǎng)，直至長(zhǎng)滿表面。表面長(zhǎng)滿后不再生長(zhǎng)，需進(jìn)行傳代。一般采用酶消化法或機(jī)械法使細(xì)胞從生長(zhǎng)表面上脫落下來(lái)。貼壁型細(xì)胞BioengineeringCollegeDalianUniversity貼壁型細(xì)胞

外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀相似，大致呈梭形或成纖維細(xì)胞型細(xì)胞

起源于中胚層的細(xì)胞（比如心肌、平滑肌、成骨肌細(xì)胞）在體外培養(yǎng)時(shí)一般表現(xiàn)為這種形式。

不規(guī)則三角形。中央有圓形細(xì)胞核，胞質(zhì)向外伸出2-3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起突連成網(wǎng)，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、漩渦狀走向。BioengineeringCollegeDalianUniversity貼壁型細(xì)胞上皮細(xì)胞型細(xì)胞

細(xì)胞呈不規(guī)則扁平多角形，中間有扁圓形胞核，彼此緊密相連的成單層生長(zhǎng)。消化道上皮、肝、胰和肺泡上皮等起源于外胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)多呈上皮細(xì)胞型。BioengineeringCollegeDalianUniversity貼壁型細(xì)胞游走型細(xì)胞

細(xì)胞貼附于支持物上分散生長(zhǎng)，一般不連接成片；常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快且方向不規(guī)則；細(xì)胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。該類(lèi)細(xì)胞主要是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等。BioengineeringCollegeDalianUniversity貼壁型細(xì)胞多形型細(xì)胞

形態(tài)上不規(guī)則，由胞體和胞突兩部分組成，胞突呈細(xì)長(zhǎng)型，類(lèi)似絲狀偽足。最常見(jiàn)的多形型細(xì)胞是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。BioengineeringCollegeDalianUniversity懸浮型細(xì)胞非貼附型細(xì)胞

此類(lèi)細(xì)胞體外生長(zhǎng)不必貼附于支持物上，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。來(lái)源于血液、淋巴組織的細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系都屬于此類(lèi)細(xì)胞。形態(tài)學(xué)特點(diǎn)是胞體始終為球形。BioengineeringCollegeDalianUniversity兼性貼壁型細(xì)胞

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，有些細(xì)胞呈現(xiàn)雙重性，既可以貼壁生長(zhǎng)，也可以懸浮培養(yǎng)。如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）、小鼠L929細(xì)胞等。BioengineeringCollegeDalianUniversity

1.天然培養(yǎng)基：

天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。BioengineeringCollegeDalianUniversity2.合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如MEM、RPMI-1640、DMEM等。優(yōu)點(diǎn):標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，成分相對(duì)固定,成本低缺點(diǎn):只能維持生存，需要額外補(bǔ)充血清。

BioengineeringCollegeDalianUniversity血清

成分復(fù)雜，提供維持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的各種生長(zhǎng)因子和保持細(xì)胞生物學(xué)性狀所需的許多未知成分。常用的動(dòng)物血清主要有牛血清和馬血清。牛血清包括小牛血清和胎牛血清。胎牛血清來(lái)源少，價(jià)格高。小牛血清要求剛生下未哺乳的小牛。優(yōu)質(zhì)血清：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)污染。一般使用濃度10%，凍存細(xì)胞時(shí)用20%。BioengineeringCollegeDalianUniversity血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過(guò)濾除菌血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞．BioengineeringCollegeDalianUniversity培養(yǎng)基3.無(wú)血清培養(yǎng)基通過(guò)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充已知的一些細(xì)胞生長(zhǎng)因子代替血清，比如激素、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴(kuò)展因子等。無(wú)血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。BioengineeringCollegeDalianUniversity常用各材質(zhì)器材、器皿的準(zhǔn)備1.玻璃器皿：浸泡、刷洗、浸酸、沖洗2.橡膠制品：浸泡、2%NaOH煮、自來(lái)水沖洗、1%鹽酸浸泡、蒸餾水煮沸3.塑料制品：自來(lái)水沖洗、2%NaOH浸泡、自來(lái)水、5%鹽酸浸泡、沖洗4.金屬器具：擦拭、消毒烘干、包裝、濕熱或干熱滅菌BackBioengineeringCollegeDalianUniversity清潔液的配制BioengineeringCollegeDalianUniversity1.水：新鮮制備的三蒸水或去離子水2.平衡鹽緩沖液：常用有Hank’s液、Earl液和PBS等

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20g

加水至1000ml細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制BioengineeringCollegeDalianUniversity

3.消化液：胰蛋白酶、膠原酶、EDTA溶液常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液配制；用濾器過(guò)濾除菌。消化時(shí)間2-10分鐘,用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。用于傳代細(xì)胞消化時(shí)常和EDTA聯(lián)合使用。膠原酶對(duì)膠原和細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用，適用于消化纖維組織、上皮組織。作用溫和，長(zhǎng)時(shí)間作用也不會(huì)影響細(xì)胞，血清和鈣、鎂離子對(duì)其無(wú)影響。BioengineeringCollegeDalianUniversity

4.培養(yǎng)基：

合成培養(yǎng)基大多數(shù)都已商品化，如DMEM、RPMI-1640、MEM等。一般為粉末狀，按每袋可配置1L培養(yǎng)基的量分裝。配制時(shí)，一袋粉末溶于1L三蒸水中，加入2gNaHCO3，用0.22μm的濾膜抽濾滅菌；分裝后于4℃短期保存，盡快用完。完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5