人血管生長(zhǎng)素的真核表達(dá)及亞細(xì)胞定位

人血管生長(zhǎng)素的真核表達(dá)及亞細(xì)胞定位張宏斌,武婕,楊太成,冼江,賴晃文,楊傳紅,鄭文嶺【關(guān)鍵詞】人血管天生素;,真核表達(dá);,定位;,細(xì)胞核[摘要]目的:創(chuàng)立人血管天生素〔angigenin,ANG〕的真核表達(dá)體系并在細(xì)胞內(nèi)亞定位。要領(lǐng):接納亞克隆技能構(gòu)建重組熒光真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pEGFP/ANG,然后經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞〔HUVE〕并對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)pEGFP/ANG的表達(dá)用熒光顯微鏡和免疫組化染色舉行斷定。用共聚焦顯微鏡和免疫電鏡不雅察ANG的亞細(xì)胞定位。效果:熒光顯微鏡不雅察可見(jiàn)轉(zhuǎn)染的HUVE內(nèi)發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。免疫組化染色檢測(cè)表現(xiàn),轉(zhuǎn)染的HUVE中有棕色顆粒。共聚焦顯微鏡及免疫電鏡查抄表現(xiàn),ANG集聚于細(xì)胞核區(qū)。結(jié)論:以構(gòu)建的重組體pEGFP/ANG轉(zhuǎn)染HUVE后,可表達(dá)人ANG卵白;表達(dá)的ANG定位于細(xì)胞核區(qū)。[關(guān)鍵詞]人血管天生素;真核表達(dá);定位;細(xì)胞核血管天生素〔angigenin,ANG〕是一種相對(duì)分子質(zhì)量(r)為14100、pI為9.5、由123個(gè)氨基酸構(gòu)成的卵白質(zhì),存在于正凡人的血漿及實(shí)體腫瘤構(gòu)造中,屬于核糖核酸酶超家屬成員[1],其基因定位于14號(hào)染色體的q11區(qū)。ANG具有很強(qiáng)的促進(jìn)血管天生的作用。大量研究表白,ANG與腫瘤的快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有嚴(yán)密的干系[2,3],肺癌、胰腺癌及乳腺癌等患者的外周血中ANG的程度顯著升高,并且血清ANG的程度與這些腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移呈明顯的正相干,因此,通過(guò)檢測(cè)血清ANG的程度可猜測(cè)腫瘤的產(chǎn)生與生長(zhǎng)環(huán)境[4-6]。然而,ANG對(duì)付創(chuàng)傷、燒傷及血循環(huán)較差的股骨頭、半月板等損傷的修復(fù)那么具有較大的臨床應(yīng)用代價(jià)。為此,我們構(gòu)建了人ANG基因的真核表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞〔HUVE〕舉行表達(dá),斷定了其亞細(xì)胞定位。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料熒光標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟試劑盒為leularPrbes公司產(chǎn)物。鼠抗Glgi58K或alnexin單克隆抗體〔Ab〕為Siga公司產(chǎn)物。ERⅠ、BaHⅠ為Prega公司產(chǎn)物。熒光質(zhì)粒pEGFP/2購(gòu)自lnteh公司。T4DAN毗連酶為寶生物工程〔大連〕產(chǎn)物。Lipfetaine2000為Invitrgen公司產(chǎn)物。DE造就液為Gib公司產(chǎn)物。金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的羊抗鼠IgG抗體為美國(guó)ZYED公司產(chǎn)物。質(zhì)粒抽提試劑盒為上海博彩生物科技產(chǎn)物?？谷薃NGAb由本室制備[7]。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞〔HUVE〕為本室保存。其他生化試劑購(gòu)自華美生物工程公司等。1.2要領(lǐng)2效果2.1人ANG的真核表達(dá)[8]在熒光顯微鏡下,可見(jiàn)pEGFP/ANG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HUVE出現(xiàn)綠色熒光,而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞那么不表現(xiàn)熒光(圖1)。轉(zhuǎn)染72h后,用SP法免疫組化染色檢測(cè)ANG基因的表達(dá)表現(xiàn),重組質(zhì)粒pEGFP/ANG轉(zhuǎn)染的HUVE胞質(zhì)中布滿了棕色顆粒;而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,細(xì)胞全部呈藍(lán)色〔圖2〕。2.2ANG在HUVE中的定位〔1〕共聚焦顯微鏡不雅察:在共聚焦顯微鏡下,可見(jiàn)ANGGFP交融卵白與HUVE的細(xì)胞核區(qū)相重疊,與高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)重疊〔圖3〕;而單獨(dú)的GFP卵白是漫衍于整個(gè)細(xì)胞的?！?〕透射電鏡不雅察:透射電子顯微鏡下不雅察,可見(jiàn)HUVE核的核仁區(qū)有濃集的金顆粒,在細(xì)胞核區(qū)的其他部位也有少數(shù)散在的金顆粒;而在細(xì)胞質(zhì)及其他細(xì)胞器部位均未見(jiàn)金顆?！矆D4〕。圖1ANG在HUVE中表達(dá)的熒光顯微鏡不雅察〔×200〕〔略〕A:pEGFP/ANG轉(zhuǎn)染的HUVE;B:未轉(zhuǎn)染的HUVE.圖2ANG在HUVE中表達(dá)的免疫組化〔SP法〕染色檢測(cè)〔×200〕〔略〕A:pEGFP/ANG轉(zhuǎn)染的HUVE;B:空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HUVE.圖3表達(dá)的ANG在HUVE中定位的共聚焦顯微鏡不雅察〔×1000〕〔略〕圖4表達(dá)的ANG在HUVE中定位的透射電鏡不雅察〔×60000〕〔略〕3討論ANG通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞外貌的受體結(jié)合,可激活胞內(nèi)的第二信使,誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入及構(gòu)造中新生的管狀布局形成〔即新生的血管分支〕等[9,10],從而實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)血管生長(zhǎng)的作用。血管的形成是構(gòu)造修復(fù)與生長(zhǎng)必不成少的緊張環(huán)節(jié),因此,ANG的促血管生長(zhǎng)作用對(duì)構(gòu)造工程學(xué)的生長(zhǎng)具有龐大的鞭策作用。已有報(bào)道[10],ANG可改進(jìn)微循環(huán),在血循環(huán)較差的半月板纖維軟骨的修復(fù),以及在堵塞或損傷的構(gòu)造中重修側(cè)枝循環(huán)等歷程中,也發(fā)揮著緊張的作用。本研究中,我們以重組質(zhì)粒pEGFP/ANG轉(zhuǎn)染HUVE后,不雅察了ANG的瞬時(shí)表達(dá)。由于所用真核表達(dá)載體中帶有陳訴基因EGFP,因此,在熒光顯微鏡不雅察下,經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HUVE中可不雅察到綠色熒光,而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞那么不表現(xiàn)熒光。同時(shí),我們用免疫組化〔SP法〕染色檢測(cè)表白,pEGFP/ANG重組質(zhì)粒可以或許在HUVE中表達(dá),為進(jìn)一步開展ANG基因轉(zhuǎn)移在構(gòu)造工程學(xué)中的應(yīng)用奠基了必然的基矗透射免疫電鏡及共聚焦顯微鏡不雅察表現(xiàn),ANG在HUVE中定位于細(xì)胞核區(qū),為通過(guò)阻斷ANG治療腫瘤的研究提供了必然的實(shí)行根據(jù)。參考文獻(xiàn):[1]StrydDJ,FettJ,LbbRR,etal.Ainaidsequenefhuanturderivedangigenin[J].Biheistry,1985,24(20):5486-5494.[2]ShiyaaS,YaasakiK,Kaahara,etal.Inreasedseruangigeninnentratininlretalanerisrrelatedithanerprgressin[J].linanerRes,1999,5(5):1125-1130.[3]iyakeH,HaraI,YaanakaK,etal.Inreasedangigeninexpressinintheturtissueandserufurthelialarinapatientsisrelatedtdiseaseprgressinandreurrene[J].aner,1999,86(2):316-324.[4]張宏斌,郭文軍,吳錦銀,等.腫瘤患者血清血管生長(zhǎng)素程度變革的開端研究[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2002,18〔2〕:190-191.[5]HisaiH,KatJ,Kbune,etal.Inreasedexpressinfangigenininhepatellulararinainrrelatinithturvasularity[J].linanerRes,2022,9(13):4852-4859.[6]ShiyaaS,Kainishi.Angigenininseraasanindependentprgnstifatringastrianer[J].JanerReslinnl,2022,129(4):239-244.[7]張宏斌,江悅?cè)A,王捷,等.重組人血管生長(zhǎng)素及其單克隆抗體的特性斷定[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2001,17(3):277-279.[8]張宏斌,王捷,武婕,等.重組載體pEGFPANG的構(gòu)建及ANG基因在HUVE中的表達(dá)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2022,20〔1〕:15-17.[9]FlkanJ.Therlefangigenesisinturgrth[J].Se