食品中有毒微生物的測(cè)定

第十二章

食品中有害成分測(cè)定

第二節(jié)diyijie食品中有毒微生物的測(cè)定目錄12

食品中沙門(mén)氏菌的快速篩檢方法345

李斯特菌快速檢測(cè)方法微生物數(shù)量的快速檢測(cè)大腸桿菌O157:H7快速檢測(cè)方法金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法微生物數(shù)量的快速檢測(cè)1.旋轉(zhuǎn)平皿計(jì)數(shù)方法2.疏水性柵格濾膜法或等格法3.皿膜系統(tǒng)4.酶底物技術(shù)5.直接外熒光濾過(guò)技術(shù)6.“即用膠”系統(tǒng)活細(xì)胞計(jì)數(shù)的改進(jìn)方法1.阻抗法2.ATP生物發(fā)光技術(shù)用于估計(jì)微生物數(shù)量的新方法旋轉(zhuǎn)平皿技術(shù)方法標(biāo)題旋轉(zhuǎn)平皿計(jì)數(shù)方法即是把液態(tài)樣品螺旋式并不斷稀釋地接種到一個(gè)旋轉(zhuǎn)的平皿中。這一系統(tǒng)在美國(guó)已被廣泛采用，如AOAC方法977.27《食品和化妝品中的細(xì)菌旋轉(zhuǎn)平板法》旋轉(zhuǎn)平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定原理原理:自食品或化妝品樣品制備的菌懸液被螺旋平板注入器連續(xù)不斷地注入分布到旋轉(zhuǎn)著的瓊脂平板的表面，在瓊脂表面形成阿基米德螺旋形軌跡。當(dāng)用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時(shí)，菌液體積減少，注入的體積和瓊脂半徑間存在著指數(shù)關(guān)系。培養(yǎng)時(shí)菌落沿注液線(xiàn)生長(zhǎng)。用一計(jì)數(shù)的方格來(lái)校準(zhǔn)與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量，計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的已知菌落數(shù)，再計(jì)算細(xì)菌濃度?！啊笔杷詵鸥駷V膜法或等格法常規(guī)微生物項(xiàng)目：菌落總數(shù)、大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希菌及霉菌、酵母計(jì)數(shù)，也有用于彎曲桿菌計(jì)數(shù)的報(bào)道。LIM等研制了臺(tái)盼藍(lán)的培養(yǎng)基使等格法能直接用于酵母菌計(jì)數(shù)。皿膜系統(tǒng)皿膜系統(tǒng)可用于輪廓總數(shù)、大腸菌群、大腸埃希菌、霉菌、酵母和金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)。測(cè)定原理Happyeveryday5.12在一雙層膜系統(tǒng)內(nèi)含有干燥的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和冷水可溶的膠體物質(zhì)，以每系統(tǒng)1ML的加樣量講樣品直接加到基礎(chǔ)膜中間，蓋上含有膠凝劑和2,3,5-氯化三苯四氮唑的覆蓋膜，培養(yǎng)后細(xì)菌在雙層膜之間生長(zhǎng)并顯色即可直接計(jì)數(shù)。酶底物技術(shù)用于大腸菌群和大腸埃希菌計(jì)數(shù)存在食品樣品中的大腸菌群特有的β-D-半乳糖苷酶系統(tǒng)能分解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷為5-溴-4-氯-3-吲哚的中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物經(jīng)過(guò)氧化生成水不溶性藍(lán)色二聚物。而β-葡萄糖苷酶則為大腸埃希菌（埃希菌和志賀菌）和一些沙門(mén)菌所特有，其能分解4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸為葡萄糖苷和甲基傘形酮，并在366nm下產(chǎn)生熒光，以此作為確認(rèn)是否有大腸菌群和大腸埃希菌存在的依據(jù)。測(cè)定原理底物酶技術(shù)直接外熒光過(guò)濾技術(shù)是測(cè)定許多食品如奶、肉、禽和禽制品、魚(yú)和魚(yú)制品、水果和蔬菜、啤酒和葡萄酒、輻射食品等食品及水中的微生物的一種快速方法。直接外熒光過(guò)濾技術(shù)原理:利用紫外光顯微鏡來(lái)快速測(cè)定活菌數(shù)。首先用一特殊濾膜過(guò)濾樣品，經(jīng)吖啶橙染色后，用紫外光顯微觀(guān)察活細(xì)胞呈橙色熒光、死細(xì)胞呈綠色熒光?！凹从媚z”系統(tǒng)是根據(jù)選擇的培養(yǎng)基不同可分別用于菌落總數(shù)、大腸菌群、大腸埃希菌計(jì)數(shù)和霉菌、酵母計(jì)數(shù)，以及彎曲桿菌的計(jì)數(shù)。“即用膠”系統(tǒng)原理:此系統(tǒng)盛有無(wú)菌液體（或脫水干燥）培養(yǎng)基的試管，在此專(zhuān)用培養(yǎng)基內(nèi)含有與多種細(xì)菌酶類(lèi)所對(duì)應(yīng)的底物，撿樣被細(xì)菌污染時(shí)，只要具有一種酶的活性即能與底物作用生成4-甲基傘形酮，培養(yǎng)一定時(shí)間后，在波長(zhǎng)365的紫外光下發(fā)出藍(lán)色熒光。把樣品傾入該試管中，混勻后再將混合物倒入一個(gè)裝有膠質(zhì)的特殊培養(yǎng)皿中。混合物與膠質(zhì)接觸后便形成與瓊脂相似的復(fù)合物，經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)顏色指示或在紫外光下產(chǎn)生熒光計(jì)數(shù)。用于估計(jì)微生物數(shù)量的方法阻抗法1ATP生物發(fā)光術(shù)23這些方法主要是將物理化學(xué)領(lǐng)域中的新知識(shí)新技術(shù)應(yīng)用于微生物檢測(cè)中。通過(guò)測(cè)量微生物在生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)中發(fā)生的變化來(lái)估測(cè)微生物數(shù)量。,,,,Bactometer系統(tǒng)1微生物在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，由于其本身的代謝作用，可將培養(yǎng)基中較大的分子分解成帶電荷較多的大分子，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基中的電導(dǎo)度增加。Malthus微生物發(fā)光技術(shù)2阻抗法Bactometer系統(tǒng)是利用阻抗變化來(lái)測(cè)定，當(dāng)培養(yǎng)基因微生物的代謝活動(dòng)而發(fā)生化學(xué)改變時(shí)，阻抗也發(fā)生變化。在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中，大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)檩^小但更為活躍的分子。在某些測(cè)定實(shí)例中，當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)生的離子濃度達(dá)到比培養(yǎng)基初始離子濃度稍低時(shí)，電導(dǎo)改變即可檢出。ATP生物發(fā)光技術(shù)是利用產(chǎn)生于生物體內(nèi)的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象而建立起來(lái)的一種檢測(cè)方法。目前發(fā)現(xiàn)的熒光素酶有細(xì)菌熒光酶和螢火蟲(chóng)熒光素酶兩大類(lèi)，前者是從海洋放光細(xì)菌中提取，后這是從螢火蟲(chóng)中提取。其方法是先將螢火蟲(chóng)螢光素酶基因克隆在大腸桿菌中表達(dá)，然后將轉(zhuǎn)化體置37℃的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，到對(duì)數(shù)期收集菌體，用滲透壓法，凍融法提取細(xì)菌胞質(zhì)組分，經(jīng)均質(zhì)，離心，用凝膠排阻，離心交換色譜提取純酶。食品中沙門(mén)菌的快速篩檢方法沙門(mén)菌

寄居在人類(lèi)動(dòng)物腸道內(nèi)生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭陰性桿菌。它是人類(lèi)食物中毒的主要病原之一。沙門(mén)菌廣泛分布于自然界，而且種類(lèi)多，所以，沙門(mén)菌日益引起人們的高度重視，食品中的沙門(mén)菌的檢驗(yàn)也顯得非常重要。食品中沙門(mén)菌的快速篩檢方法免疫學(xué)方法分子生物學(xué)方法沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基法自動(dòng)化傳導(dǎo)法免疫學(xué)方法1·單克隆酶免疫色度分析篩選方法2·多克隆酶免疫分析篩選方法3·熒光酶免疫分析篩選方法4·金標(biāo)免疫分析方法分子生物學(xué)方法DNA探針檢測(cè)法DNA探針技術(shù)是最新發(fā)展起來(lái)的一向特異，靈敏，快速的檢測(cè)方法。特別適用于直接檢驗(yàn)出致病性微生物，而不受非致病性微生物的影響。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)【PCR】技術(shù)該技術(shù)是由美國(guó)cetus公司和美國(guó)加利福尼亞大學(xué)于1985年聯(lián)合創(chuàng)建的，自PCR方法創(chuàng)建以來(lái)其已廣泛地應(yīng)用于致病性微生物的診斷中。自動(dòng)化傳導(dǎo)法

自動(dòng)化傳導(dǎo)法是根據(jù)電阻抗測(cè)量的原理，關(guān)鍵是選用適宜的培養(yǎng)基，以保證任何電導(dǎo)或電阻抗的變化都是由目標(biāo)微生物的生長(zhǎng)所致，通過(guò)儀器檢測(cè)電導(dǎo)或電阻抗的改變來(lái)確定是否存在被檢微生物。根據(jù)選用的專(zhuān)一性培養(yǎng)基不同，電導(dǎo)或電阻抗法還可用于大腸桿菌，李斯特菌，彎曲桿菌等菌的初篩檢驗(yàn)。也許對(duì)于大家而言，大腸桿菌已然并不陌生，但是你對(duì)于大腸桿菌O157：H7了解多少？它到底對(duì)于我們生活有何影響？？接下來(lái)就讓我們走進(jìn)今天的學(xué)習(xí)大腸桿菌O157：H7的特性介紹及檢測(cè)它的意義腸出血性大腸桿菌（EHEC）是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以O(shè)157:H7血清型為代表菌株。EHECO157:H7屬于腸桿菌科埃希氏菌屬。革蘭氏染色陰性，無(wú)芽胞，有鞭毛。危害：本菌與輕度腹瀉、溶血性尿毒綜合癥、出血性腸炎等多種人類(lèi)病狀密切相關(guān)。鑒別培養(yǎng)基及顯色培養(yǎng)基的檢測(cè)根據(jù)大腸桿菌O157：H7的某些生化特征設(shè)計(jì)些選擇性培養(yǎng)基，在這些培養(yǎng)基上大腸桿菌O157：H7與其他大腸桿菌或雜菌區(qū)分開(kāi)。另一類(lèi)根據(jù)菌落顏色來(lái)識(shí)別大腸桿菌O157：H7有法國(guó)梅里埃公司的“O157ID”，在這種培養(yǎng)基上大腸桿菌O157：H7顯藍(lán)色，其他大腸桿菌顯紫色。免疫學(xué)檢測(cè)方法1.免疫磁珠分離法：利用磁場(chǎng)作用將磁珠從增菌液中沉淀，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，讓成分分離2.金標(biāo)免疫分析法：免疫分析法利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的分析方法。3.酶聯(lián)免疫吸附法：酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，簡(jiǎn)稱(chēng)酶聯(lián)免疫法，或者ELISA法。它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過(guò)顯色來(lái)檢測(cè)。4.乳膠凝集實(shí)驗(yàn)：以乳膠顆粒作為載體的一種間接凝集試驗(yàn)。即吸附可溶性抗原于其表面，特異性抗體與之結(jié)合后，可產(chǎn)生凝集反應(yīng)。1.DNA探針：DNA探針是以病原微生物DNA或RNA的特異性片段為模板，人工合成的帶有放射性或生物素標(biāo)記的單鏈DNA片段，可用來(lái)快速檢測(cè)病原體。2.聚合酶鏈反應(yīng)：聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR），又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)(“freebacteria”cloningtechnique)，是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法分子生物學(xué)檢測(cè)方法金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)概況葡萄球菌屬微球菌科，本菌有19個(gè)菌種，從人體上可檢出12個(gè)種。葡萄球菌屬主要與皮膚腺體和溫血?jiǎng)游锏恼衬は嚓P(guān)系，有些種是人及動(dòng)物的條件致病菌。金黃色葡萄球菌對(duì)人類(lèi)有致病性，通常被稱(chēng)為病原性球菌。金黃色葡萄球菌可引起化膿性炎癥，又稱(chēng)為化膿性球菌。金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性形態(tài)與染色：金黃色葡萄球菌的典型形態(tài)呈球形，直徑0.4～1.2μm，大小不一，平均直徑約為0.8μm。革蘭氏染色陽(yáng)性，呈葡萄串狀排列。無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞。在陳舊培養(yǎng)物中，衰老的菌體常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。培養(yǎng)特性：易培養(yǎng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。需氧或兼性厭氧。最適生長(zhǎng)溫度37℃，最適生長(zhǎng)pH7.4。耐鹽性強(qiáng)，在含10～15%的氯化鈉培養(yǎng)基中仍能生長(zhǎng)，可用于篩選菌種。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)18～24ｈ，可形成圓形、表面光滑、不透明的菌落。可產(chǎn)生金黃色色素，色素為脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落內(nèi)，不滲至培養(yǎng)中。在血平板上可形成明顯透明的溶血環(huán)。為β型溶血?？僧a(chǎn)生卵磷脂，在卵黃高鹽培養(yǎng)基上形成周?chē)邪咨恋憝h(huán)的菌落。大多數(shù)菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)多為陽(yáng)性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)。觸酶陽(yáng)性。金黃色葡萄球菌的酶金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生血漿凝固酶和耐熱DNA酶。這兩種酶均與金黃色葡萄球菌的致病性有關(guān)。血漿凝固酶：與金黃色葡萄球菌的致病力密切相關(guān)。一般認(rèn)為，血漿凝固陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌菌株有致病力。否則為無(wú)力的菌株。血漿凝固酶對(duì)熱穩(wěn)定，能抵抗60℃30min甚至100℃30min后，仍能保存大部分活性。耐熱DNA酶作為除血漿凝固酶外鑒定金黃色葡萄球菌致病力的指標(biāo)之一。該酶的最適pH為9.0。血漿凝固酶試驗(yàn)試驗(yàn)原理：致病性的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w蛋白，附著于細(xì)菌表面，產(chǎn)生凝固。金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶：一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝固酶，為結(jié)合凝固酶；另一種是菌細(xì)胞釋放于培養(yǎng)基中，為游離凝固酶。二者的抗原性不同。血漿凝固酶試驗(yàn)挑取Baird－Parker平板或血平板上可疑菌落1個(gè)或以上，分別接種到5mLBHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入可疑菌落的BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL，振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀(guān)察一次，觀(guān)察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。結(jié)果如可疑，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培養(yǎng)18h～48h，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果報(bào)告如血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，可判定為金黃色葡萄球菌。報(bào)告在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。李斯特菌快速檢測(cè)方法李斯特菌李斯特菌(學(xué)名:Listeriamonocytogenes)，又名單核球增多性李斯特菌、李氏菌，是一種兼性厭氧細(xì)菌，為李斯特菌癥的病原體。李斯特菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，屬厚壁菌門(mén)，取名自約瑟夫·李斯特。它主要以食物為傳染媒介，是最致命的食源性病原體之一。

李斯特菌在環(huán)境中無(wú)處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特菌。肉類(lèi)、蛋類(lèi)、禽類(lèi)、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特菌的感染